Farmacologische validatie van de prepulsremming van de schrikreactie bij larvale zebravissen met behulp van een commercieel geautomatiseerd systeem en software

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van in de handel verkrijgbare geautomatiseerde systemen om de prepulsinhibitie (PPI) test in larvale zebravissen farmacologisch te valideren.

Samenvatting

Hoewel er een overvloed is aan commerciële en gestandaardiseerde geautomatiseerde systemen en software voor het uitvoeren van de prepulsinhibitie (PPI) -test bij knaagdieren, zijn voor zover wij weten alle PPI-tests die in de zebravis zijn uitgevoerd, tot nu toe uitgevoerd met behulp van op maat gemaakte systemen die alleen beschikbaar waren voor individuele groepen. Dit heeft daarbij uitdagingen met zich meegebracht, met name met betrekking tot de reproduceerbaarheid en standaardisatie van gegevens. In het huidige werk hebben we een protocol gegenereerd dat gebruik maakt van in de handel verkrijgbare geautomatiseerde systemen om de PPI-test in larvale zebravissen farmacologisch te valideren. In overeenstemming met gepubliceerde bevindingen waren we in staat om de resultaten van apomorfine, haloperidol en ketamine te repliceren op de PPI-respons van 6 dagen na de bevruchting van zebravislarven.

Inleiding

De larve van de zebravis (Danio rerio) is een geschikte kandidaat voor het modelleren van psychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie (beoordeeld door Gawel et ^al.1) vanwege de vele voordelen die hij bezit. Deze omvatten een volledig gesequenced genoom met 70% sequentiehomologie met menselijke orthologen², het bestaan van voorwaartse en achterwaartse genetische hulpmiddelen om het genoom te manipuleren en om de bijdrage van een bepaald gen aan ontwikkeling of ziekte te identificeren³, en de aanwezigheid van belangrijke neurotransmitters bij mensen/knaagdieren in de hersenen van zebravissen⁴. Er zijn verschillende neuro-fenotypische domeinen beschikbaar in zebravissen, zoals angst, leren en geheugen³. Optische transparantie en gevoeligheid voor de belangrijkste klassen van neurotrope geneesmiddelen maken het een ideale kandidaat bij uitstek voor farmacologische manipulaties en screening van fenotypische geneesmiddelen ^5,6.

Om een high-throughput screening van geneesmiddelen uit te voeren, is automatisering en de aanwezigheid van een robuust endofenotype van groot belang⁷. Er zijn bijvoorbeeld verschillende automatische registratietechnieken ontwikkeld voor het meten van het gedrag van larvale zebravissen, zoals thigmotaxis, schrikreactie, optokinetische respons, optomotorische respons, gewenning, prooivangst, slaap/waakgedrag, locomotorisch gedrag en verschillende andere⁶. Hoewel sommige laboratoria op maat gemaakte systemen ontwikkelen voor geautomatiseerde metingen en analyse van sommige van deze gedragingen, zijn er in de handel verkrijgbare beeldvormings- en softwaresystemen 8,9,10,11. Prepulsinhibitie (PPI), een vorm van sensomotorische gating waarbij de schrikreactie wordt verminderd wanneer een zwakke niet-startende stimulus kort voor de verrassende stimulus wordt gepresenteerd, is gebruikt als een endofenotype voor het bestuderen van schizofrenie in diermodellen (beoordeeld door^12,13). Bovendien hebben akoestische schrikrespons (ASR) en PPI een nuttige rol gespeeld bij het bestuderen van het gehoor en de auditieve functie in diermodellen, waaronder de zebravis^14,15. De larvale zebravis vertoont een karakteristieke C-start als reactie op een onverwachte verrassende stimulus die wordt verminderd door een zwakkere stimulus die de prepuls wordt genoemd. De C-start is al lang beschreven als een ontsnappingsgedrag dat wordt gecontroleerd door verschillende neurale celpopulaties en is grondig gekarakteriseerd in de larvale zebravis 15,16,17.

Er is een overvloed aan commerciële en gestandaardiseerde geautomatiseerde systemen en software voor het uitvoeren van de PPI-test bij knaagdieren 18,19,20. Voor zover wij weten, zijn alle PPI-testen die tot nu toe in de zebravis zijn uitgevoerd, uitgevoerd met behulp van op maat gemaakte systemen die alleen beschikbaar zijn voor de individuele groepen 15,16,21,22. Dit brengt uitdagingen met zich mee voor het bereiken van reproduceerbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens met betrekking tot standaardisatie²³.

Onlangs heeft een bekende leverancier in de zebravisgemeenschap een set-up ontwikkeld met een snelle camera en PPI-generator-add-ons om de PPI-test in larvale zebravissen²⁴ uit te voeren. De camera neemt op met 1000 frames per seconde, waardoor snelwerkend gedrag zoals de C-start kan worden vastgelegd, terwijl de PPI-generator een door de gebruiker gecontroleerde levering van verschillende akoestische stimuli mogelijk maakt om een schrikreactie op te roepen²⁴. Hier combineren we het bovengenoemde systeem met een commercieel beschikbaar uitgebreid softwarepakket dat is ontworpen voor de geautomatiseerde analyse van complex gedrag¹¹, om een protocol te genereren voor het uitvoeren van PPI-responstesten in larvale zebravissen. We valideren de PPI-respons farmacologisch met behulp van 1) apomorfine, een dopamine-agonist waarvan bekend is dat het tekorten in PPI veroorzaakt; 2) haloperidol, een dopamine-antagonist en antipsychoticum waarvan bekend is dat het PPI verbetert en 3) ketamine, een NMDA-receptorantagonist waarvan bekend is dat het PPI moduleert.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het toezicht- en aanvraagsysteem van de Noorse Autoriteit voor Voedselveiligheid (FOTS-18/106800-1).

1. Zebravissen houden

1. Zet paringen op van wildtype volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravissen (Danio rerio) bestanden, onderhouden onder standaardomstandigheden²⁵ de avond ervoor. Hier wordt de Tupfel long-fin (TL) stam gebruikt.
2. Verwijder de barrières de volgende ochtend en laat paren door middel van natuurlijk paaien.
3. Verzamel eieren uit de paringsbakken.
4. Verwijder onbevruchte eieren en ander vuil, breng de eieren vervolgens over naar petrischaaltjes (n = 60) en kweek ze op in een broedmachine bij 28 °C in embryomedium: 1,5 mM HEPES, pH 7,6, 17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgSO4 en 0,18 mM Ca(NO3)₂.
5. Vernieuw de helft van het embryomedium en verwijder dode larven dagelijks tot 6 dpf.
   OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd op individuele larven 6 dagen na de bevruchting (dpf).

2. Farmacologische middelen en voorbehandeling van larven

1. Los apomorfine en ketamine op in E3-medium om respectievelijk 500 μM en 10 mM stockoplossingen te maken.
2. Los haloperidol op in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) om een stockoplossing van 10 mM te maken. De uiteindelijke concentratie van de gebruikte DMSO was 0,1%.
3. Gebruik 0,1% DMSO en E3-medium als voertuigbesturing.
4. Gebruik de volgende eindconcentraties van geneesmiddelen: 10 mg/ml apomorfine, 1 mM ketamine en 20 μM haloperidol¹⁶.
5. Stel de larven van de apomorfine- en ketaminegroepen gedurende 10 minuten en de haloperidol- en DMSO-voertuigcontrolegroepen gedurende 20 minuten^{en 16} minuten voor.

3. Opstelling voorafgaand aan de gedragstest

1. Breng op de dag van het experiment de larven en alle relevante materialen over naar de experimenteerruimte. Stel de experimenteerruimte in op een temperatuur van 27 ± 1 °C.
2. Zorg ervoor dat het achtergrondgeluid in de testkamer zo laag mogelijk is, bij voorkeur niet meer dan 45 dB geluidsdrukniveau (SPL).
   1. Installeer de sonometermicrofoon van de decibelmeter (dB) in de testkamer (de opening voor installatie is al geboord door de fabrikant).
   2. Om het achtergrondgeluid in de ruimte te verminderen, isoleert u de testkamer met een op maat gemaakte geluidscabine (zie Figuur 1B voor een overzicht van de opstelling).
3. Bereid een plaat met 96 putjes voor op de prepulsinhibitietest.
   OPMERKING: De videocamera heeft een resolutie van 2048 × 500 pixels, wat betekent dat er maximaal 3 banen (33 putten) tegelijk kunnen worden afgebeeld.
   1. Gebruik een op maat gemaakte acrylplaat van 96-well formaat om interferentie door schaduwen te verminderen.
      LET OP: De afmetingen voor de aangepaste plaat zijn te vinden op de volgende website: https://zenodo.org/record/3739378#.XooyLW5uKas
4. Breng met behulp van een transferpipet 310 μl blootstellingsoplossing/medium met één larve over in elk putje.
5. Kalibreer en meet de stimulusintensiteit met behulp van respectievelijk de volumeknop van de stereoversterker en een decibelmeter.
6. Registreer de maximale geluidsintensiteit in het gedeelte "niveaureferentie".

4. Stimulusparameters en video-acquisitie

1. Zet de computer, het versterkersysteem en de dB-meter aan (zie Figuur 1A voor een overzicht van de opstelling).
2. Gebruik de volumeknop door deze op minimaal of maximaal te draaien om de geluidsintensiteit aan te passen.
   1. Controleer het geluidsniveau met de dB-meter elke keer, de volumeknop wordt aangepast. Dit is belangrijk bij het vinden van de maximale en minimale geluidsintensiteit die door de opstelling kan worden geproduceerd.
      OPMERKING: De dB-meter berekent de RMS dB-output voor de stimulus. Het systeem genereert het geluid in de vaste componenten van de testkamer, waardoor de plaat stevig blijft en er een trilling wordt geproduceerd in het horizontale vlak van de gehele plaatdrager.
      1. Zet de volumeknop op maximaal, meet de geluidsintensiteit met de dB-meter en gebruik deze waarde.
3. Definieer op de interface van de PPI-generator de parameters: inter-stimulusinterval weergegeven als vertraging; intertrial-interval weergegeven als Acquisitie deltatijd; duur van de voorpuls enz.
   1. Zorg er bij proeven met alleen prepulse voor dat de "Amplitude" of duur van de stimulus voor schrikparameters op nul is ingesteld en vice versa voor proeven met alleen schrik.
4. Als u een studielijst wilt genereren, selecteert u Toevoegen > geeft u een naam aan de proefversie. Bijvoorbeeld: "Prepulse 50 dB alleen".
   OPMERKING: Men kan zoveel proeven genereren als gewenst, maar wees voorzichtig met hoe lang de lijst is, omdat dit het programma kan laten crashen.
   1. Wissel prepulse-proeven af met alleen pulsproeven in alle PPI-experimenten in een pseudowillekeurige volgorde. Wanneer in een experiment meerdere stimuli worden gepresenteerd, wordt een inter-trial interval (ITI) van 30 s gebruikt.
      OPMERKING: In dit onderzoek werden een schrikstimulus (pols) van 100 ms van 660 Hz en 5 ms prepulsstimuli van 440 Hz gebruikt. Voor PPI-experimenten was het interstimulusinterval (ISI) 100 ms.
5. Als u het protocol wilt opslaan, selecteert u Bestand > Opslaan als.
6. Pas de lichtomstandigheden in de testkamer als volgt aan.
   1. Start USB-metingscomputing, selecteer analoog uit en ga vervolgens naar D/A OUT O (P13) om wijzigingen in de verlichting aan te brengen. Een waarde van nul betekent geen licht, terwijl het verhogen van de D/A OUT O-waarde de intensiteit van het licht in de doos verhoogt. Voor alle experimenten werd een lichtintensiteit van 100 gebruikt.
7. De camera instellen
   1. Start de software en wacht tot de camera is geladen.
   2. Selecteer Aanpassingen (te vinden aan de rechterkant) en stel de acquisitieframesnelheid in op 1.000 en klik vervolgens op toepassen om de wijziging door te voeren.
8. Acclimatiseer de larven gedurende 5 minuten in een 100% licht verlichte testkamer voordat de experimenten worden gestart.
9. Als u een experiment wilt starten, selecteert u het menu Experiment op de PPI-generator, klikt u op Uitvoeren en op de indeling putje selecteren (bijvoorbeeld 33 putjes).
   1. Zorg er altijd voor dat de camerasoftware met de juiste instellingen wordt gestart voordat u een experiment uitvoert.
   2. Verkrijg een video van 2 seconden voor elke proefversie.
   3. Zorg ervoor dat de framesnelheid voor acquisitie is ingesteld op 1.000.

5. Geautomatiseerde tracking en analyse van akoestische schrikrespons en PPI

1. Protocol instellen.
   1. Start de analysesoftware (zie de materiaaltabel). Kies Nieuw uit sjabloon > Pas een vooraf gedefinieerde sjabloon toe en doorloop vervolgens andere menu's (details hieronder).
      1. Kies uit een videobestand onder Videobron.
      2. Blader door het videobestand. Stel het onderwerp in als vis > zebravislarven > zonesjabloon (geen sjabloon). Geef het aantal arena's op onder Arena's.
      3. Geef het aantal onderwerpen per arena op (ingesteld op 1) onder Onderwerpen.
      4. Selecteer detectie van middelpunt, neuspunt en staartbasis onder Gevolgde kenmerken (zie afbeelding 2A,B).
         OPMERKING: Dit is belangrijk om de lichaamshoek van de C-start-respons te berekenen (zie afbeelding 2C).
      5. Klik op Naam > opslaan als. De gebruikte eenheden zijn mm, s, deg voor respectievelijk afstand, tijd en rotatie.
         NOTITIE: Vergeet niet om hetzelfde apparaat te gebruiken voor het kalibreren van de weegschaal.
   2. Kies Arena-instelling.
      1. Klik op Achtergrondafbeelding pakken.
      2. Doorloop de stappen in het rechtermenu (gebruik bij twijfel het Help-menu ).
      3. Kies het gereedschap voor het tekenen van cirkels om de arena's te tekenen.
   3. Kies Instellingen voor proefbesturingselementen > maak een nieuwe > naam.
   4. Kies Detectie-instellingen, doorloop de stappen in het rechtermenu.
      1. Stel de samplefrequentie in op 25. Kies geavanceerde detectie-instellingen. Selecteer onder Methode dynamisch aftrekken, geavanceerd model/volwassen vis, stel vervolgens Onderwerpkleur in vergelijking met achtergrond in op Donkerder en verplaats de schuifregelaar om het contrast van de larve te definiëren.
      2. Selecteer onder de contour van het onderwerp eerst eroderen, verwijd en verhoog vervolgens de waarden voor contourerosie en dilatatie totdat het dier volledig is gedetecteerd.
   5. Sla het protocol op en gebruik het voor latere analyses van verkregen PPI-video's.
2. Instelling van de proeflijst.
   1. Kies een proeflijst, definieer onafhankelijke variabelen zoals larvale ID, behandeling, stimulustype, enz. Selecteer het pad van video's en definieer een lijst met proeven voor batchacquisitie.
3. Acquisitie setup.
   OPMERKING: Als er een proeflijst is gegenereerd, kan men een batchacquisitie van de video's uitvoeren.
   1. Als sommige tracks verloren zijn gegaan, gebruikt u de trackeditor om de trackfuncties aan te passen.
   2. Sluit de trackingfouten uit die onopgelost blijven na het gebruik van de trackeditor.
   3. Stel het profiel voor het afvlakken van rails in op 1 mm om ruis van gegevens te verminderen. Dit kan worden aangepast op basis van de achtergrondactiviteit van larven.
4. Analyse opstelling.
   1. Als u proeven wilt selecteren die moeten worden geanalyseerd, kiest u Gegevensprofielen en definieert u tracks op basis van de onafhankelijke variabele die van belang is.
      OPMERKING: Als componenten verborgen zijn, klikt u op het oogsymbool in de rechterbovenhoek om weer te geven.
      1. Filter delen van te analyseren onderzoeken (bijv. op basis van behandeling of type stimulusgroep).
      2. Selecteer een deel van de sporen die moeten worden geanalyseerd (nesting). Voor deze studie werden gegevens genest voor sporen tussen het begin van de stimulus en 100 ms na het begin van de stimulus.
      3. Vergeet niet om alle filters en nestkasten met pijllijnen te verbinden om de instructie te voltooien.
   2. Definieer afhankelijke variabelen die moeten worden geanalyseerd, selecteer Analyseprofielen en specificeer de variabelen die van belang zijn (focus op Lichaam onder afhankelijke variabelen).
      OPMERKING: Als componenten verborgen zijn, klikt u op het oogsymbool in de rechterbovenhoek om weer te geven.
      1. Dubbelklik op de hoek van de behuizing. Selecteer absolute buiging. Ga door de instellingen van de proefversie, selecteer maximum en klik vervolgens op toevoegen.
   3. Dubbelklik op de toestand van de lichaamshoek. Stel het gemiddelde interval in op 5 monsters. Stel de drempelwaarde voor de buighoek in. Als u statistieken voor bent wilt berekenen, doorloopt u Proefstatistieken en selecteert u latentie om eerst > toevoegen. Herhaal de stappen totdat verschillende drempels zijn verkregen (tussen 20-80° werd gebruikt) en noem dienovereenkomstig.
   4. Statistieken en grafieken genereren.
      1. Kies analyse > resultaten > statistieken en grafieken en klik vervolgens op berekenen.
      2. Zorg ervoor dat de gegevens- en analyseprofielen op de juiste sjabloon zijn ingesteld, aangezien er onder elke sectie meerdere sjablonen kunnen worden gemaakt.
   5. Exporteer proef- en groepsstatistieken als spreadsheetbestanden voor verwerking en analyse.

6. Gegevensanalyse

1. Open het spreadsheetbestand met de onderzoeksstatistieken.
2. Selecteer de kolommen Lichaamshoek Maximale deg, gebogen latentie (van de verschillende drempels voor de lichaamshoek).
3. Beschouw elke verandering in lichaamshoek ≥ 30° binnen een cut-off latentie van 50 ms na het begin van de stimulus als een positieve C-start-respons (d.w.z. een responder); Degenen met < lichaamshoek van 30° zijn non-responders.
4. Wijs op een binaire manier 1 toe aan een reagerende larve en 0 aan niet-reagerende larven voor elke plaat.
   1. Tel het totale aantal responders en non-responder larven voor elke plaat. Bereken de responders (%) in elk geval berekend als (aantal larven dat reageert/totaal aantal larven) × 100. Sluit larven die minder dan 30% reageren op de schrikprikkel uit van de analyse¹⁶.
      OPMERKING: Elke stimulusintensiteit die in staat is om een C-start-respons op te wekken die gelijk is aan of meer dan 70% van de larven, wordt beschouwd als een geschikte schrikstimulus¹⁶.
5. Bereken %PPI als 100 × (percentage dat reageert op schrikstimulus − percentage dat reageert op prepuls + schriksequentie)/ (percentage dat reageert op schrikstimulus)¹⁶.

7. Statistische analyse

1. Presenteer de gegevens als het gemiddelde ± standaarddeviatie, SD (zie de materiaaltabel voor statistische software).
2. Bepaal de effecten van verschillende prepulsintensiteiten op de larvale respons met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door een post-hoctest van Tukey.
3. Gebruik ANOVA in twee richtingen, gevolgd door de post-hoctest van Holm-Sidak om de effecten van medicamenteuze behandeling op % PPI-respons met variërende prepulsintensiteiten te bepalen.

Resultaten

Er werden drie experimenten uitgevoerd om het protocol van het combineren van meerdere systemen te valideren om de prepulsremming van de akoestische schrikrespons in de larvale zebravis te analyseren. Eerst werd het vermogen getest om akoestische stimuli nauwkeurig af te geven en de reactie van larven op de schrikprikkel vast te leggen. Vervolgens werd het vermogen gevalideerd om de schrikrespons te verzwakken wanneer een prepulsstimulus wordt gepresenteerd. Ten slotte werd het vermogen vastgesteld om de farmacologische modulatie van prepulsremming van de schrikreactie door de geneesmiddelen apomorfine, haloperidol en ketamine te detecteren.

Reactie van larvale zebravissen op akoestische schrikstimuli
Eerder werk heeft aangetoond dat larvale zebravissen een karakteristieke C-start vertonen wanneer ze worden gepresenteerd met een verrassende akoestische stimulus¹⁶. Het vermogen om het gedrag van larven aan de schrikstimuli aan te zetten en vast te leggen, werd getest. Er werd waargenomen dat geregistreerde larven de C-start-respons vertoonden (Figuur 2). Een stimulus van 70 dB re (100 ms, 660 Hz, aanvullende figuur 1A) was sterk genoeg om bij ≥70% van de larven een respons op te wekken (figuur 3A). Wanneer de stimulus herhaaldelijk 30 keer werd gepresenteerd met een interval van 30 s, resulteerde de 70 dB re-stimulus niet in gewenning van de larven (N = 3 replicaten; 16 larven/replicaat), zoals weergegeven in figuur 3B.

Prepulse vermindert de schrikreactie van larvale zebravissen op akoestische prikkels
Een overvloed aan bewijs toont aan dat prepulsstimuli de larvale respons op een schrikstimulus moduleren 15,21,22,26. Er werd een paradigma van twee pulsen gebruikt, waarbij een zwakke stimulus, de prepuls genaamd, voorafging aan de schrikopwekkende stimulus die de puls wordt genoemd. De gebruikte prepulsstimuli waren 20, 17 of 14 dB minder dan de pulsstimulus die was ingesteld op 70 dB re. De voorpuls (5 ms, 440 Hz) werd altijd 100 ms voor het begin van de puls gepresenteerd (aanvullende figuur 1B). Elke geteste prepulsstimulus verminderde de larvale respons op de pols aanzienlijk. In Figuur 4 wordt de larvale respons (in %) op akoestische schrikstimuli weergegeven voor 6 dpf TL in E3-medium, N = 6 (16 larven/groep). Het percentage larven dat reageerde op de schrikstimulus (pols) was 79,86 ± 9,772. Naar verwachting, wanneer de schrikstimulus werd voorafgegaan door een voorpuls van 50, 53 of 56 dB, daalde de larvale respons tot respectievelijk 40,87% ± 11,30%, 39,58% ± 7,345% en 29,17% ± 9,350%. Eenzijdige Anova-analyse onthulde een statistisch verschil in stimuluseffect op larven (F (3, 48) = 57,23, P < 0,0001) waarbij Tukey's meervoudige vergelijkingstest statistische significantie onthulde tussen groepen met een betrouwbaarheidsinterval van 95%.

Farmacologische modulatie van prepulsremming
Eerdere studies toonden aan dat de dopaminerge geneesmiddelen, apomorfine en haloperidol, evenals het glutamaterge medicijn, ketamine, de remming van de prepuls bij larven significant moduleerden, net als bij hun equivalenten bij zoogdieren en knaagdieren¹⁶. Op basis van deze studies werden concentraties geselecteerd voor validatie van de opstelling. Het interstimulusinterval (ISI) voor alle farmacologische experimenten was 100 ms.

Effect van apomorfine op remming van de prepuls
In figuur 5 vertoonden larven die gedurende 10 minuten waren voorbehandeld met 10 mg/ml apomorfine een algehele vermindering van % PPI in vergelijking met E3-controlelarven (tweerichtings-ANOVA, niet-RM (factoren: behandeling en prepulsintensiteit; behandeling: F (1, 34) = 16,21, p = 0,0003; prepulsintensiteit: F (2, 34) = 8,674, P = 0,0009, dit toonde een niet-significante interactie: F (2, 34) = 2,514, p = 0,0959). Om de verschillen in meer detail te onderzoeken, onthulde de post-hoctest van Holm-Sidak significante verschillen in de schrikrespons tussen E3-controle en met apomorfine behandelde larven bij prepulsintensiteiten 53 (p = 0,0126) en 56 (p = 0,0044) maar niet bij 50 dB (p = 0,5813).

Effect van haloperidol op remming van de prepuls
Figuur 6 toont een algehele toename van %PPI in larven die gedurende 20 minuten zijn voorbehandeld met 20 μM haloperidol in vergelijking met die in E3-medium (tweerichtings-ANOVA, niet-RM (factoren: behandeling en prepulsintensiteiten; behandeling: F (1, 32) = 20,75, p < 0,0001; prepulsintensiteit: F (2, 32) = 3,147, p = 0,0565, zonder significante interactie: F (2, 32) = 0,7455, p = 0,4826). Met behulp van de post-hoctest van Holm-Sidak werd de aanwezigheid van statistische significantie alleen waargenomen bij prepulsintensiteiten 53 (p = 0,00489 en 56 (p = 0,0348) maar niet bij 50 dB (p = 0,067).

Effect van ketamine op remming van de prepuls
Figuur 7 laat zien dat er bij verschillende prepulsstimulusintensiteiten verschillen waren in de schrikrespons tussen E3-controlelarven en larven die gedurende 10 minuten werden voorbehandeld in ketamine van 1,0 mM (tweerichtings-ANOVA, niet-RM (factoren: behandeling en prepulsintensiteiten; behandeling: F (1, 35) = 25,46, p < 0,0001; prepulsintensiteit: F (2, 35) = 6,018, p = 0,0057, zonder significante interactie: F (2, 35) = 0,8450, p = 0,4381). De post-hoctest van Holm-Sidak toonde alleen significantie bij prepuls-intensiteiten van 50 (p = 0,0039) en 53 (p = 0,0027), maar niet bij 56 dB (p = 0,0802).

Figuur 1: Testapparatuur. (A) Overzicht van de opstelling van de apparatuur. (B) Interne isolatie van de opstellingsapparatuur om achtergrondgeluid tijdens experimenten tot een minimum te beperken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Analyse van de akoestische schrikreactie van de larvale zebravis. (A) Karakteristieke C-start vertoond door 6 zebravislarven bij 6 dpf. (B) Representatief beeld van de drie gevolgde kenmerken over elkaar heen gelegd op een larve van 6 dpf: middelpunt (rood), neuspunt (cyaan) en staartbasis (paars). (C) Representatief beeld van de absolute buighoek die wordt weergegeven door een 6-dpf TL wildtype larven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bepaling van de akoestische schrikdrempel. (A) Een stimulusintensiteit van 70 dB (weergegeven door rode stippellijnen) is in staat om een C-start-respons op te wekken bij >70% van de larven (N = 33; 6 dpf TL). (B) Larven wennen niet aan 70 dB restimulus die 30 keer (proeven) wordt gepresenteerd met een interval van 30 s tussen de proeven (N = 3 replicaten; 16 larven/replicaat). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Pre-puls-geïnduceerde afname van de larvale respons (%). Pre-puls stimuli van 20, 17 en 14 dB lager dan de 70 dB re startprikkel veroorzaken een vermindering van het aantal wildtype TL larven C-start responders. Alle gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D., N = 5 (16 larven/groep), ****p < 0,0001, significant verschillend van de schrikstimulus door Tukey's post-hoctest na eenrichtings-ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Door apomorfine geïnduceerde tekorten in %PPI. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D., N = 4\u20125 (16 larven/groep), statistisch significant verschil door de post-hoctest van Holm-Sidak na tweerichtings-ANOVA. *p = 0,0126, met E3 ctl/apomorfine behandelde groep bij 53 dB; **p = 0,0044, met E3 ctl/apomorfine behandelde groep bij 56 dB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Door Haloperidol geïnduceerde versterking van %PPI. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D., N = 4\u20125 (16 larven/groep), statistisch significant verschil door de post-hoctest van Holm-Sidak na tweerichtings-Anova. **p = 0,0048, met DMSO ctl/apomorfine behandelde groep bij 53 dB; *p = 0,0348, DMSO ctl/apomorfine behandelde groep bij 56 dB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Door ketamine geïnduceerde versterking van %PPI. Alle gegevens weergegeven als gemiddelde ± S.D, N = 4\u20125 (16 larven/groep), statistisch significant verschil door de post-hoctest van Holm-Sidak na tweeweg Anova **p = 0,0039, met E3 ctl/apomorfine behandelde groep bij 50 dB, **p = 0,0027, met E3 ctl/apomorfine behandelde groep bij 53 dB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: Representatieve video van larven die een C-start vertonen als reactie op een akoestische schrikstimulus van 70 dB. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Representatieve voorbeelden van gegenereerde stimuluscondities met behulp van de PPI-generator. (A) Proef met alleen stimulus, (B) pre-pulsinhibitieproef (pre-puls + puls), (C) proef zonder stimulus om de drempel te meten basislijn buighoek van niet-gestimuleerde larven. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Discussie

Het is essentieel om elk nieuw gedragstestsysteem te valideren met als doel de protocollen voor neurogedragsonderzoek te verbeteren en te verfijnen. In het huidige onderzoek werd het vermogen van twee in de handel verkrijgbare systemen en software beoordeeld om een akoestische schrikreactie bij zebravislarven te induceren en om eerder beschreven farmacologische modulatie van dergelijk gedrag te detecteren en te kwantificeren.

Er zijn een aantal aanpassingen en probleemoplossing uitgevoerd om de set-up te optimaliseren. De standaardsoftware voor de analyse van C-start-responsen was zodanig dat de analyse automatisch werd voortgezet nadat de gegevens voor elk experiment waren verkregen (22 proeven/plaat vormden een experiment). Hierdoor werd het aantal platen dat per dag kon draaien verminderd, waardoor de doorvoer (5 platen per dag) werd verminderd. Om deze beperking te voorkomen, was het nodig om de analysesoftware los te koppelen van het gegevensverzamelingsproces, waardoor de doorvoer toenam tot gemiddeld 10 platen per dag. De beslissing om over te stappen op onafhankelijke analysesoftware voor niet-live analyse bleek dus succesvol en efficiënter. Om interferentie van schaduwen of ander vuil te voorkomen, waardoor ruis in de gegevens wordt geïntroduceerd, wordt aanbevolen om putjes volledig met medium te vullen, alle bubbels te verwijderen en voedseldeeltjes of iets dergelijks te vermijden die kunnen worden aangezien voor larven, waardoor ruis in de gegevens wordt gegenereerd. Na kalibratie van de geluidsstimuli was de maximale intensiteit die door het versterkersysteem kon worden bereikt, zoals vastgelegd door de dB-meter, 85 dB re, terwijl het initiële achtergrondgeluid in de testkamer 60 dB re was. Dit resulteerde in een smal dB-venster om in te werken. Daarom was het van cruciaal belang om achtergrondgeluid zo minimaal mogelijk te houden. Om dit te bereiken, werd parafon-akoestisch materiaal (zie materiaaltabel) gebruikt om een extra isolatielaag rond de testkamer te bouwen en een extra isolatielaag met behulp van een zangcabinebundel (zie materiaaltabel). Met deze isolatielagen werd het achtergrondgeluid in de testkamer met succes teruggebracht van de aanvankelijke 60 dB naar 45 dB re.

Momenteel is een voordeel van deze opstelling dat alle componenten in de handel verkrijgbaar zijn en als zodanig niet beperkt zijn tot slechts een paar laboratoria. Personen met beperkte kennis van codeertaal kunnen het gebruiken, omdat het protocol vrij gemakkelijk te begrijpen en te volgen is. Door gebruik te maken van het PPI-systeem was het bijvoorbeeld mogelijk om pulsen en pre-pulsen af te geven met verschillende interstimulus- en intertrial-intervallen, en om larvale reacties op dergelijke stimuli vast te leggen. Zodra dit gedrag was vastgelegd, konden ze met behulp van de analysesoftware worden geclassificeerd in responders en non-responders. De respondergroep werd gecategoriseerd als larven die een C-start van 30° of meer vertoonden met een latentie van <50 ms. Bovendien wordt de PPI-respons gemoduleerd door geneesmiddelen die gericht zijn op dopaminerge en glutamaterge signalering (beoordeeld door Geyer en collega's²⁷). In overeenstemming met eerdere studies verminderde apomorfine, een niet-selectieve dopaminereceptoragonist, de pre-pulsremming van de schrikrespons bij larvale zebravissen, terwijl haloperidol, een dopamine-antagonist, de respons versterkte. Bij larvale zebravissen is aangetoond dat ketamine de PPI differentieel moduleert op basis van de duur van de ISI¹⁶. In de bovengenoemde studie werd de PPI van larven versterkt na 30 ms, maar onderdrukt bij 500 ms ISI wanneer deze werd voorbehandeld met ketamine. Hoewel in deze studie geen variabele ISI werd gebruikt, maakt de observatie dat ketamine de PPI versterkte bij een ISI van 100 ms, vergelijkbaar met de gegevens van de vorige studie wanneer een ISI van 30 ms werd gebruikt. De studie toonde aan dat door deze in de handel verkrijgbare systemen te combineren, het mogelijk is om de PPI-test uit te voeren en farmacologisch geïnduceerde veranderingen in de PPI-respons van de zebravislarven betrouwbaar te detecteren. Een beperking van het systeem is dat de nose-point-functie die door de analysesoftware wordt gevolgd, altijd op een van de ogen van de larven valt, waardoor een basislijn ontstaat Om dit te verhelpen, is het noodzakelijk om altijd de basisbuighoek van niet-gestimuleerde larven te bepalen, die ~30° bleek te zijn voor larven die in dit onderzoek werden gebruikt. Dit vormde dus de basis voor de keuze van 30° als drempel voor wat werd beschouwd als een positieve C-start-respons bij geschrokken larven. Als met deze punten rekening wordt gehouden, zou het mogelijk moeten zijn om de PPI-test uit te voeren in elk laboratorium met toegang tot de installatieapparatuur. Dit artikel richtte zich niet op het categoriseren van de kinematica van schrikrespons in korte latentie en lange latentie, zoals eerder gerapporteerd¹⁶, vanwege de reikwijdte van de variabiliteit van latentie. Daarom werden alleen C-start-responsen <50 ms na het begin van de stimulus¹⁵ gebruikt.

Er is gemeld dat stamverschillen het gedrag van zebravissen beïnvloeden in verschillende tests 28,29,30,31 en de gehoorgevoeligheid^{beïnvloeden 32}. Daarom is het essentieel om de basisbuighoek van elke geteste rek te bepalen. Aangezien gehoorgevoeligheden ook kunnen verschillen, is het van cruciaal belang om de startreacties bij aanvang te bepalen, de geluidsintensiteit die het meest geschikt is als voor- of schrikstimulus voor elke spanning en hoe lang de stimulus wordt gepresenteerd. De ISI is een andere parameter die zorgvuldig moet worden overwogen, omdat sommige geneesmiddelen de PPI kunnen versterken of verlagen op basis van het interval tussen de prepuls en het begin van de schrikstimulus¹⁶. De verwachting is dat laboratoria die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van cognitieve functie, neuropsychiatrische stoornissen en gehoor (auditieve functie) deze PPI-opzet en dit protocol nuttig zullen vinden bij het screenen van hun farmacologische en/of genetische modellen. Dit protocol biedt ook een basis voor high-throughput screening van samengestelde bibliotheken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apomorphine	Sigma Aldrich	A4393	Dopaminagonist
dB meter	PCE instruments	PCE-MSM 4	Voor het meten van stimulusintensiteit
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	Voor het oplossen van organische opgeloste stoffen
Dynavox Versterker	Dynavox	CS-PA1 MK	Voor het afleveren van akoestische stimuli
EthoVision XT	Noldus, Nederland	EthoVision XT, versie 14	Geautomatiseerd tracking software
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versie 8	Statistische analysesoftware
Haloperidol	Sigma Aldrich	H1512	Dopaminantagonist
Ketamine	Sigma Aldrich	Y0000450	NMDA-receptorantagonist
parofon akoestische materialen	Paroc	8528308	Helpt bij het verminderen van achtergrondruis in de testkast
t.akustik Vocal Booth Bundle	Thormann, Duitsland	458543	Helpt bij het verminderen van achtergrondruis in de testkast
ZebraBox Revo met PPI-add-ons	ViewPoint, Frankrijk	ZebraBox Revo met PPI-add-ons	Inclusief hardware en software