Kwantificering van rabiësvirus in verschillende runderhersenstructuren

Samenvatting

Dit protocol presenteert een qRT-PCR-gebaseerde benadering voor het bepalen van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) genkopienummer binnen verschillende anatomische structuren van runderhersenen met behulp van in vitro transcriptie.

Samenvatting

Runderverlammingsdolheid (BPR) is een vorm van virale encefalitis die van aanzienlijk economisch belang is in heel Latijns-Amerika, waar het een groot zoönotisch risico vormt. Hier was ons doel om een laboratoriumprotocol te gebruiken om het relatieve kopienummer van het rabiësvirus (RABV) genoom in verschillende anatomische structuren van runderhersenen te bepalen met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR kwantificeert het specifieke aantal genkopieën in een monster op basis van fluorescentie die wordt uitgestoten na versterking die direct evenredig is met de hoeveelheid doelnucleïnezuur die in het monster aanwezig is. Deze methode is voordelig vanwege de korte duur, het verminderde risico op besmetting en het potentieel om virale nucleïnezuren in verschillende monsters gemakkelijker te detecteren in vergelijking met andere technieken. De hersenen van zes hondsdolle dieren waren verdeeld in zes anatomische structuren, namelijk de hoorn van de Ammon, cerebellum, cortex, medulla, pons en thalamus. Alle hersenen werden geïdentificeerd als positief voor RABV-antigenen op basis van een directe immunofluorescentietest. Dezelfde anatomische structuren uit de hersenen van vier RABV-negatieve runderen werden ook beoordeeld. RNA werd geëxtraheerd uit elke structuur en gebruikt voor qRT-PCR. Een test werd uitgevoerd om de kopieaantallen van RABV-genen te bepalen met behulp van een in vitro getranscribeerd nucleoproteïnegen. De standaardcurve die werd gebruikt om viraal RNA te kwantificeren vertoonde een efficiëntie van 100% en lineariteit van 0,99. Analyse toonde aan dat de cortex, medulla en thalamus de ideale CNS-porties waren voor gebruik bij RABV-detectie, gebaseerd op de observatie dat deze structuren de hoogste niveaus van RABV bezaten. De test specificiteit was 100%. Alle monsters waren positief, er werden geen valse positieven gedetecteerd. Deze methode kan worden gebruikt om RABV te detecteren in monsters die lage RABV-niveaus bevatten tijdens de diagnose van BPR.

Inleiding

Rabiës kan antemortem en postmortem worden bevestigd door verschillende technieken die de detectie van virale nucleïnezuren in de hersenen, huid, urine of speeksel mogelijk maken¹. Detectie van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) gen wordt voornamelijk gebruikt voor rabiësdiagnose door moleculaire tests. Dit gen wordt ook gebruikt voor virale genotypering. Hondsdolheid kan worden gediagnosticeerd bij dieren met behulp van een deel van de aangetaste hersenen; om de mogelijkheid van rabiës uit te sluiten, moet weefsel uit ten minste twee gebieden in de hersenen echter worden getest². Er bestaan ve....

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen voor het gebruik van dieren die werden verstrekt door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Monsters

1. Gebruik verschillende gebieden van de hersenen ontleed uit 6 verschillende rabiës-positieve runderhersenen voor RT-PCR analyse.

2. Directe fluorescerende antilichamen (DFAs) om rabiës te bevestigen

OPMERKING: Detectie van het rabiësantigeen door DFA is een kwalitatieve....

Resultaten

DFA-resultaten toonden respectievelijk 100%, 100%, 83,3%, 66% en 50% positiviteit voor RABV in de cortex, thalamus, medulla, pons en hoorn. Deze resultaten bevestigden de vorige resultaten, en ten minste drie van de structuren ontleed uit elke hersenen waren positief voor RABV. Figuur 1geeft een representatieve positieve DAF-kleuring weer .

Figuur 2 toont de versterking van een fragment van het RABV N-gen (stap 5.5) met de primers eer.......

Discussie

Eerdere studies hebben aangetoond dat DFA RABV alleen kan detecteren binnen zeven dagen nadat het monster bij kamertemperatuur (21 °C) is opgeslagen¹⁴. Dit werk toonde daarentegen aan dat de gevoeligheid van RT-PCR begint af te nemen nadat de monsters gedurende 12 dagen aan kamertemperatuur zijn blootgesteld. Daarom kan het RABV-genoom worden gedetecteerd door qRT-PCR in monsters die tot 23 dagen aan kamertemperatuur zijn blootgesteld. Dit toont aan dat de gevoeligheid van qRT-PCR relatief hoger i.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chloroform	SIGMA	C7559	Maakt herstel van de waterige fase van PCR's die zijn overdekt met minerale olie mogelijk.
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	De DNA Clean & Concentrator-500 (DCC-500) is ontworpen voor de snelle, grootschalige zuivering en concentratie van maximaal 500 µg hoogwaardig DNA uit monsters, inclusief grootschalige restrictie-endonuclease-digesties en onzuivere DNA-preparaten.
Ethanol	Amresco	193-500	Zuivering van nucleïnezuren
FastStart High Fidelity PCR System kit, dNTPack	Roche	3553400001	Enzym met hoge getrouwheid voor de amplificatie van PCR-producten waarbij willekeurige baseveranderingen worden vermeden
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analyseert grotere eiwit- en DNA-gels
GelRed	Biotium	41003	Een nieuwe generatie nucleïnezuurgelkleuren, ze bezitten nieuwe chemische eigenschappen die zijn ontworpen om de kans te minimaliseren dat de kleurstoffen in interactie komen met nucleïnezuren in levende cellen.
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	Temperatuur kan worden gemonitord en geregeld door instrumentalgoritme, in-monstersonde of monsterstukmodi
iTaq Universal Probes One-Step Kit	BioRad	1725141	Reactiemengsel om PCR-reacties in real time uit te voeren met behulp van TaqMan-type hybridisatiesondes
Isopropyl alcohol	Amresco	0918-500	Precipitatie van nucleïnezuren
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28706	QIAquick-kits bevatten een silicamembraanassemblage voor binding van DNA in buffer met hoge zoutconcentratie en elutie met buffer met lage zoutconcentratie of water. De zuiveringsprocedure verwijdert primers, nucleotiden, enzymen, minerale olie, zouten, agarose, ethidiumbromide en andere onzuiverheden uit DNA-monsters
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-021	Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) gebruikt enkelstrengs RNA of DNA in aanwezigheid van een primer om een complementair DNA-streng te synthetiseren.
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	Microvolume spectrofotometer
Oligo(dT)18 primer	Invitrogen	SO132	De oligo (dT)18-primer is een synthetische enkelstrengs 18-mer oligonucleotide met 5'- en 3'-hydroxyleinden.
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems kit SP6 en T7	Promega	P1300	In vitro transcriptiereacties worden gebruikt om microgramhoeveelheden RNA-sondes te synthetiseren uit recombinante DNA-sjablonen. De meeste transcriptiereacties die zijn ontworpen om RNA-sondes te genereren, zijn geoptimaliseerd om maximale incorporatie van radioactief gelabelde ribonucleotiden te maximaliseren in plaats van om grote hoeveelheden RNA te produceren
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA Polymerase is een zeer thermostabiel DNA-polymerase van de thermofiele bacterie Thermus aquaticus. Het enzym katalyseert 5’ en 3’ synthese van DNA
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026	Het TRIzol-reagens is een volledig, gebruiksklaar reagens, ontworpen voor het isoleren van hoogwaardig totaal RNA of het gelijktijdig isoleren van RNA, DNA en eiwitten uit een verscheidenheid aan biologische monsters.