Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een capsule-gebaseerd model voor onrijpe Harde Tik Stadia Besmetting op Laboratoriummuizen

6.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61430

⸱

9 juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1UMR BIPAR, INRAE, Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, ANSES, Université Paris-Est, 2Faculté de Pharmacie, Université de Limoges, 3UMR SPE 6134 CNRS, Université de Corte Pascal Paoli

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie werd een voedingssysteem ontwikkeld voor nimfen- en larvestadia van harde teek met behulp van een capsule die aan de laboratoriummuis is bevestigd. De voercapsule is gemaakt van flexibele materialen en blijft minstens een week stevig aan de muis vast zitten en maakt een comfortabele monitoring van het voeden van teek mogelijk.

Samenvatting

Teken zijn verplichte bloedvoedingsparasieten in alle stadia van ontwikkeling (behalve eieren) en worden erkend als vectoren van verschillende ziekteverwekkers. Het gebruik van muismodellen in tekenonderzoek is van cruciaal belang voor het begrijpen van hun biologie en tick-host-pathogen interacties. Hier tonen we een niet-moeizame techniek voor het voeden van onrijpe stadia van harde teken op laboratoriummuizen. Het voordeel van de methode is de eenvoud, korte duur, en de mogelijkheid om te controleren of te verzamelen teken op verschillende tijdstippen van een experiment. Bovendien maakt de techniek het mogelijk om twee individuele capsules op dezelfde muis te bevestigen, wat gunstig is voor een verscheidenheid aan experimenten waarbij twee verschillende groepen teken nodig zijn om zich met hetzelfde dier te voeden. De niet-irriterende en flexibele capsule is gemaakt van gemakkelijk toegankelijke materialen en minimaliseert het ongemak van de proefdieren. Bovendien is euthanasie niet nodig, muizen herstellen zich volledig na het experiment en zijn beschikbaar voor hergebruik.

Inleiding

Teken zijn belangrijke vectoren van verschillende ziekteverwekkers en vormen een ernstig risico voor de gezondheid van mens en dier1. Het opzetten van een effectief voedingssysteem is cruciaal bij het bestuderen van hun biologie, tick-host-pathogen interacties, of het vaststellen van effectieve controlemaatregelen. Momenteel zijn verschillende kunstmatige voedersystemen, die het gebruik van levende dieren vermijden, beschikbaar voor teken2,,3,4 en deze moeten worden gebruikt wanneer experimentele omstandigheden dit toelaten. In verschillende experimentele omgevingen slagen deze systemen er echter niet in om de specifieke fysiologische kenmerken op de juiste manier na te bootsen en het gebruik van levende dieren is noodzakelijk om relevante resultaten te bereiken.

Laboratoriummuizen worden vaak gebruikt voor de studie van vele biologische systemen en worden routinematig gebruikt als gastheren voor het voeden van teken5,6,7,8,9. De twee meest voorkomende methoden voor het voeden van onvolwassen teken op muizen zijn gratis besmettingen en het gebruik van opsluitingskamers aan de muis. Gratis besmettingen worden voornamelijk gebruikt voor larve stadia en opgeslokte teken kunnen dalen naar een gebied waar ze kunnen worden hersteld. Opsluitingskamers bestaan meestal uit acryl- of polypropyleendoppen die aan de rug van de muis zijn gelijmd. De eerste techniek is een effectief natuurlijk systeem voor het voeden van teken, maar staat geen nauwe controle toe tijdens het experiment omdat de individuele teken verspreid zijn in verschillende delen van het gastlichaam. Bovendien kunnen engorged teken die naar een herstelgebied vallen, besmet raken met uitwerpselen en urine10,11,12,13,14 die de tekenconditie ernstig kunnen beïnvloeden of ze kunnen worden beschadigd of opgegeten door de muis als er geen scheiding is tussen het dier en het herstelgebied15. Kamer-gebaseerde systemen kunnen de opsluiting van teken tot een bepaald gebied, echter, het lijmproces is moeizaam en de caps zijn vaak zwak aanhangend aan de lijm en dus ze vaak los tijdens het experiment16,17,18,19. De doppen zijn ook stijf, ongemakkelijk, en leiden tot huidreacties, die het hergebruik van de muizen te voorkomen en vereist hun euthanasie na het experiment.

In onze vorige studie hebben we met succes een effectief systeem ontwikkeld met behulp van kamers gemaakt van ethyleen-vinyl acetaat (EVA) schuim voor het voeden van teken op laboratoriumkonijnen20. Hierin hebben we dit systeem aangepast aan een muismodel en een eenvoudige en schone methode voorgesteld om onrijpe harde tekenstadia te voeden in gesloten capsules gemaakt van EVA-schuim. Specifiek, ons systeem maakt gebruik van elastische EVA-schuim capsules gelijmd aan de geschoren muizen terug met snel drogen (3 min), niet-irriterende latex lijm. Deze techniek maakt stevige en langdurige bevestiging van capsules aan de experimentele muis, evenals effectieve teek besmetting / collectie tijdens de gehele loop van het experiment. De platte capsule is gemaakt van flexibele materialen en belemmert manipulatie van de muis niet voor bloedafname of andere doeleinden. Het systeem is voornamelijk geschikt voor de nimfenkiesstadia, maar met lichte modificatie kan het ook worden gebruikt voor het voeden van larven. De methode kan worden voltooid door een enkele ervaren persoon en uitgebreide training is niet vereist.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Houd er rekening mee dat dit protocol alleen kan worden toegepast wanneer alle welzijns- en veiligheidsmaatregelen in het laboratorium zijn genomen. Dit protocol kreeg toestemming om muizen te gebruiken voor het voeden van teek door de Ethics Committee for Animal ExperimentsComEth Anses/ENVA/UPEC, Permit Numbers E 94 046 08. Voor het eindpunt werden de dieren gedurende 9 minuten blootgesteld aan CO2 in twee fasen van elk 4 en 5 min.

1. Voorbereiding van de capsule

  1. Plak 2 mm dik EVA-schuim en het lijmdubbel plakkerig schuim aan elkaar(figuur 1A).
  2. Snijd met behulp van een 20 mm diameter lederen gat punch, snijd een cirkel van de geplakte schuimstukken. Vervolgens, met behulp van een 12 mm diameter gat punch, snijd het interieur om de dubbele schuim cirkel(Figuur 1B)te creëren.
    OPMERKING: De framedikte van de capsule moet groter zijn dan 3 mm om voldoende oppervlak te garanderen voor het lijmproces op de gastheerhuid (zie hieronder).
  3. Pel de beschermpapierstrook van het lijmdubbel plakschuim(figuur 1C)en bevestig een transparant rond plastic met een diameter van 20 mm (figuur 1D).
    OPMERKING: Als larven worden gevoed, moet u de beschermpapierstrook niet uit het kleefschuim verwijderen en direct naar stap 2 in het protocol gaan. Lijm de dubbele schuimring, inclusief beschermpapierstrook, op de muis.
  4. Maak een ~ 1 cm spleet in het transparante plastic(figuur 1E).
  5. Maak ten minste 10 kleine gaatjes met een entomologische pin(figuur 1F)om overmatige vochtverdamping tijdens het experiment mogelijk te maken.
    OPMERKING: De capsule (Figuur 1G) heeft een totale hoogte van 4 mm (2 mm EVA-schuim samen met 2 mm kleefschuim) en kan worden gebruikt om nimfen en larven van alle harde tekensoorten te voeden. De capsulegrootte (figuur 1H) van 20 mm buitendiameter is geschikt voor de meeste muisstammen, maar kan indien nodig worden aangepast.

2. Voorbereiding van de muizen vóór tekenbesmetting

OPMERKING: In deze studie werden 10 - 12 weken oude vrouwelijke experimentele muizen (stam C57BL/6 en BALB/cByJ) onderhouden in standaardkooien met voedsel en water aangeboden ad libitum (Groene lijn geventileerde rekken op -20 Pa) bij het Franse Agentschap voor Voedsel, Milieu en Gezondheid & Veiligheid (ANSES) geaccrediteerde dierlijke faciliteiten in Maisons-Alfort, Frankrijk. Dieren werden twee keer per dag gecontroleerd door ervaren technici op abnormale huidreacties, gezondheidsproblemen of complicaties.

  1. Verdoof de muis met isoflurane in de inductiekamer. Eenmaal verdoofd, plaats de muis aan de manipulatiemat en bevestig aan een neuskegel voor de continue isoflurane-toevoer(figuur 2A). Controleer de ademhaling en verlaag het isofluraneniveau om ervoor te zorgen dat het minder dan 80 ademhalingen per minuut is.
    OPMERKING: Voorafgaand aan de manipulatie, label de individuele muis door het tatoeëren of radio-frequentie identificatie chip indien nodig. Het wordt aanbevolen om de individuele muizen in aparte kooien te houden om capsuleschade te voorkomen door te bijten.
  2. Scheer het voorste deel van de muis van achter de schouderbladen tot aan het gebied net achter de oren(figuur 2A).
    LET OP: Het geschoren gebied moet groter zijn dan het oppervlak van de capsule.
  3. Breng niet-irriterende latexlijm aan op de gehele EVA-schuimplaats van de voorbereide capsule en wacht 1 min(figuur 2B).
  4. Lijm de capsule aan de muis terug door lichte 3 min constante druk met de vinger(en) (Figuur 2C),vooral aan de linker- en rechterkant van de capsule. Til de capsule iets op om de bevestiging aan de huid visueel te controleren. Als niet-aangesloten gebieden worden gevonden, breng meer lijm met behulp van een spatel en druk nog 3 minuten.

3. Tekenbesmetting

  1. Voor nimfbesmetting, introduceer de individuele nimfen in de capsule via de snede gemaakt in stap 1.4 (Figuur 2D).
    LET OP: Voor Ixodes tekensoorten wordt een maximum van 20 nimfen per capsule aanbevolen.
  2. Knijp de capsule iets van twee kanten om het transparante plastic te laten buigen voor een gemakkelijkere introductie van individuele nimfen met behulp van fijne dissectie-tangen(figuur 2D). Duw de individuele nimfen via de snede in de capsule. Eenmaal binnen, draai de tang in 90° en trek de tangen te storten teken in de capsule.
  3. Voor larven besmetting verwijder de papier slip uit de bijgevoegde capsule (Figuur 2E). Plaats de spuit, met larven (Figuur 2F),direct in de capsule en deponeert teken door de spuitzuiger te duwen. Draai de zuiger voorzichtig naar de huid om de resterende larven te verwijderen.
    OPMERKING: Plaats larven in een spuit van 1 mL met gesneden uiteinde dat is aangesloten op een stuk katoen voorafgaand aan het experiment.
  4. Zodra de larven op de huid worden afgezet, sluit u de capsule door het transparante plastic(Figuur 2G)te bevestigen.
  5. Breng de beschermende plastic band rond de capsule(figuur 2H).
    OPMERKING: De beschermende plastic band heeft de duurzaamheid van de capsule gedurende de gehele duur van het experiment aanzienlijk verbeterd(figuur 2I,J). Het is mogelijk om twee capsules aan één individuele muis te bevestigen(figuur 2K). In dit geval is minimaal 3 mm ruimte tussen de capsules vereist en moet het geschoren gebied op de juiste manier worden vergroot.
  6. Breng de muizen terug naar de kooi.

4. Verzameling teken

  1. Verdoven de muis zoals in stap 2.1 hierboven.
  2. Maak een kruisvormige snede(Figuur 3A) aan het plastic met een scalpel.
    LET OP: Deze kruisvormige snede maakt het gemakkelijk verzamelen van engorged teken of loslating van de voeding teken indien nodig.
  3. Sluit indien nodig de capsule opnieuw af door een lijmplastic patch aan het transparante plastic (20 mm diameter, figuur 3B)te plakken.
    LET OP: Als het verzamelen van teken op meerdere tijdstippen gewenst is, kan dezelfde kleverige plastic patch worden gebruikt. Als het protocol vereist, kan men ook euthanasie op de muis, verwijder de capsule, en verzamelen / los te maken van de teken(Figuur 3C).

5. Herstel van de muizen

  1. Houd de muizen in kooi voor een extra week.
  2. Laat de capsule op natuurlijke wijze losmaken.
    OPMERKING: In dit geval duurt het ongeveer 8-9 dagen voordat capsules eraf vallen. Wanneer de capsule wordt verwijderd, is het belangrijk om te controleren op abnormale reacties op de huid van de muizen. In geval van irritatie een verzachtende lotion aanbrengen, hoewel normaal gesproken geen behandeling nodig is. Als het ethische protocol het toelaat, kunnen de herstelde muizen(figuur 3D)worden hergebruikt voor een andere tekenbesmetting of verschillende experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij stellen de gedetailleerde stapsgewijze methode voor voor het voeden van onrijpe harde tekenstadia in EVA-schuim capsules toegepast op de rug van een muis(figuur 2). Dit niet-moeizame protocol is geschikt voor verschillende soorten experimenten wanneer nauwkeurige tekenbewaking en -verzameling vereist is. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn de eenvoud, gemakkelijk toegankelijke kosteneffectieve materialen, en korte duur. Bovendien zijn we erin geslaagd om twee capsules aan éé...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritieke stap in het protocol is stevig lijmen van de capsule op de muishuid. Daarom moet de latexlijm homogeen worden aangebracht op het gehele EVA-schuimoppervlak van de capsule en moet constante druk gedurende 3 minuten worden uitgeoefend, vooral aan de linker- en rechterkant van de capsule. We raden ook aan om de capsule zo ver mogelijk naar voren te plaatsen op de rug om te voorkomen dat de muis met de achterste poten wordt verwijderd. In onze experimenten is alleen de hechting van het EVA-schuim en latex l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen de technische bijstand van Alain Bernier French National Institute of Agricultural Research (INRAE) en Océane Le Bidel (ANSES). De studie werd ondersteund door de DIM One Health - Région Île-de-France (Acroniem van het project: NeuroPaTick). De muizen werden gekocht door ANSES. Dr. Jeffrey L. Blair wordt erkend voor het herzien van de eerdere versie van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EVA-foam 2 mm dik, (lage dichtheid)Cosplay ShopEVA-45kg (950/450/2 mm)Het kan ook worden besteld via Amazon (ref. nr. B07BLMJDXD)
Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inchAmazonB0848S3S6TEr zijn verschillende diameters van Heat Shrink Tubing verkrijgbaar via Amazon.
Mice BALB/cByJCharles RiverStamcode 627
Mice C57BL/6Charles RiverStamcode 664
Niet-toxisch latexlijmScheurpleisterLijk- en lederen kleefstofOok verkrijgbaar via Amazon (ref. nr. B001RQCTUU)
Punch Tool Hand Art ToolAmazonB07QPWNGBFVerkocht door Amazon als Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working voor riemgespen
PVC-bindcovers doorschijnendAmazonB078BNLSNPElke doorschijnende PVC-plaat met een dikte tussen 0,150 mm en 0,180 mm is geschikt
Zelfklevende pad sponsapplikations dubbelzijdig schuimtapeAmazonB07RHDZ35JVerkocht door Amazon als 2 rollen dubbelzijdige schuimtape, super sterke witte montagetape schuim
Transparante zegelstickers (cirkels met een diameter van 20 mm)AmazonB01DAA6X66

Referenties

  1. Sonenshine, D. E., Roe, M. Biology of Ticks. , Oxford University Press. (2014).
  2. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
  3. Bonnet, S., et al. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
  4. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  5. Kohls, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain wood tick, Dermacentor andersoni. Culture methods for invertebrate animals. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publishing Co. Ithaca, N.Y. 246-256 (1937).
  6. Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum. Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
  7. Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic.) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbit. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
  8. Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. Maramorsch, K., Mahmood, F. , Science Publishers Inc. Enfield NH. 57-82 (1999).
  9. Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
  10. Almazán, C., et al. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine. 21 (13-14), 1492-1501 (2003).
  11. Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. Laboratory life cycle of Ixodes woodi. (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 35, 177-179 (1998).
  12. Almazán, C., et al. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine. 23 (35), 4403-4416 (2005).
  13. Levin, M. L., Ross, D. E. Acquisition of different isolates of Anaplasma phagocytophilum by Ixodes scapularis from a model animal. Vector Borne Zoonotic Diseases. 4 (1), 53-59 (2004).
  14. Heinze, D. M., Wikel, S. K., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J. Transcriptional profiling of the murine cutaneous response during initial and subsequent infestations with Ixodes scapularis nymphs. Parasites & Vectors. 6 (5), 26(2012).
  15. Nuss, A. B., Mathew, M. G., Gulia-Nuss, M. Rearing, Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice. Journal of Visualized Experiments. (123), e55286(2017).
  16. Wada, T., et al. Selective ablation of basophils in mice reveals their nonredundant role in acquired immunity against ticks. Journal of Clinical Investigation. 120 (8), 2867-2875 (2010).
  17. Saito, T. B., Walker, D. H. A Tick Vector Transmission Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. The Journal of Infectious Diseases. 212 (6), 968-977 (2015).
  18. Boppana, V. D., Thangamani, S., Alarcon-Chaidez, F. J., Adler, A. J., Wikel, S. K. Blood feeding by the Rocky Mountain spotted fever vector, Dermacentor andersoni, induces interleukin-4 expression by cognate antigen responding CD4+ T cells. Parasites & Vectors. 2 (1), 47(2009).
  19. Gargili, A., Thangamani, S., Bente, D. Influence of laboratory animal hosts on the life cycle of Hyalomma marginatum and implications for an in vivo transmission model for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Frontiers in Cell and Infection Microbiology. 20 (3), 39(2013).
  20. Almazán, C., et al. A Versatile Model of Hard Tick Infestation on Laboratory Rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994(2018).
  21. Zhijun, Y., et al. The life cycle and biological characteristics of Dermacentor silvarum Olenev (Acari: Ixodidae) under field conditions. Veterinary Parasitology. 168 (3-4), 323-328 (2010).
  22. Ahmed, B. M., Taha, K. M., El Hussein, A. M. Life cycle of Hyalomma anatolicum Koch, 1844 (Acari: Ixodidae) fed on rabbits, sheep and goats. Veterinary Parasitology. 177 (3-4), 353-358 (2011).
  23. Široký, P., Erhart, J., Petrželková, K. J., Kamler, M. Life cycle of tortoise tick Hyalomma aegyptium under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 54, 277-284 (2011).
  24. Chen, X., et al. Life cycle of Haemaphysalis doenitzi (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions and its phylogeny based on mitochondrial 16S rDNA. Experimental and Applied Acarology. 56, 143-150 (2012).
  25. Jin, S. W., et al. Life Cycle of Dermacentor everestianus Hirst, 1926 (Acari: Ixodidae) under Laboratory Conditions. Korean Journal of Parasitology. 55 (2), 193-196 (2017).
  26. Labruna, M. B., Fugisaki, E. Y., Pinter, A., Duarte, J. M., Szabó, M. J. Life cycle and host specificity of Amblyomma triste (Acari: Ixodidae) under laboratory conditions. Experimental and Applied Acarology. 30 (4), 305-316 (2003).
  27. Breuner, N. E., et al. Failure of the Asian longhorned tick, Haemaphysalis longicornis, to serve as an experimental vector of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ticks Tick Borne Diseases. 11 (1), 101311(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Infestatie met harde tekenteekvoedingsmodelcapsulebevestigingEVA schuimcapsulemonitoring van tekenverzamelen van tekenhergebruik van muizentekenbiologietransmissie van pathogenen
Een capsule-gebaseerd model voor onrijpe Harde Tik Stadia Besmetting op Laboratoriummuizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.