Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Summary

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Abstract

Technieken die beschikbaar zijn voor micro- en nano-schaal mechanische karakterisering zijn geëxplodeerd in de afgelopen decennia. Van de verdere ontwikkeling van de scanning en transmissie elektronenmicroscoop, tot de uitvinding van atomaire kracht microscopie, en de vooruitgang in fluorescerende beeldvorming, zijn er aanzienlijke winsten in technologieën die de studie van kleine materialen mogelijk te maken. Conpokal is een portmanteau dat confocale microscopie combineert met atoomkrachtmicroscopie (AFM), waar een sonde het oppervlak "prikt". Hoewel elke techniek is zeer effectief voor de kwalitatieve en / of kwantitatieve beeldcollectie op hun eigen, Conpokal biedt de mogelijkheid om te testen met gemengde fluorescentie beeldvorming en mechanische karakterisering. Ontworpen voor bijna gelijktijdige confocale beeldvorming en atoomkracht indringende, Conpokal vergemakkelijkt experimenten op levende microbiologische monsters. Het toegevoegde inzicht uit gepaarde instrumentatie biedt colokalisatie van gemeten mechanische eigenschappen(bijvoorbeeldelastische modulus, hechting, oppervlakteruwheid) door AFM met subcellulaire componenten of activiteit waarneembaar via confocale microscopie. Dit werk biedt een stap voor stap protocol voor de werking van laser scanning confocale en atomaire kracht microscopie, tegelijkertijd, om dezelfde cel, dezelfde regio, confocale beeldvorming, en mechanische karakterisering te bereiken.

Introduction

Micro- of nanoschaal mechanische evaluatie tools worden vaak gebruikt om de vervorming kenmerken bloot te leggen op de eencellige of micro-organismen niveau, terwijl aparte hoge resolutie microscopie tools worden gebruikt om subcellulaire processen en structurele functies te visualiseren. Conpokal, is de combinatie van laser scanning confocale microscopie en atomaire kracht microscopie (AFM) in een instrumentaal platform. De Conpokal-techniek werd voor het eerst geïmplementeerd in een niet-biologisch polymeersysteem, waarbij het doel was om de hechting, elasticiteit en oppervlaktespanning van harde oppervlakken te bepalen in contact met zachte oppervlakken. Confocale beelden gaven een visuele weergave van hoe het polymeer vervormt, hecht en vrijkomt uit de harde sonde^1,2. Van polymeren tot biologische monsters, deze techniek biedt de mogelijkheid voor bijna gelijktijdige live cel of micro-organisme confocale beeldvorming en AFM.

Veranderingen in de celelasticiteit zijn betrokken bij de pathogenese van veel menselijke ziekten³ inclusief vasculaire aandoeningen⁴Malaria^5,6, sikkelcelarmoede⁷Artritis⁸Astma⁹, en kanker^{6,10,11,12,13,14,15}. Gemeenschappelijke technieken om de mechanica van cellen te meten zijn het gebruik van magnetische kralen^16,17, optische pincet^18,19, micropipette aspiratie^8,20,21,22, en AFM^{11,23,24,25,26}. Sinds de toepassing van de AFM op levende cellen is het gemakkelijk aangepast om celtopografie te karakteriseren^27,28 evenals mechanische eigenschappen^{11,24,29,30,31} met nanoschaal precisie. AFM verder aangepast voor microrheologie^32,33, frequentiemodulatie^34,35, en kruip^25,36,37 experimenten om de visco-elastische eigenschappen van verschillende cellijnen te bestuderen. Het gebruik van een geschikt nanocontactmodel is van cruciaal belang voor de extractie van kwantitatieve elasticiteitswaarden uit door de AFM geproduceerde krachtinspringingsmetingen^1,2. AFM-onderzoeken die de invloed van cytoskeletale geneesmiddelen op celelasticiteit onderzoeken, hebben aangetoond dat de elastische modulus sterk³⁸. Op basis van de elastische modulusmetingen hebben veel onderzoekers aangetoond dat kankercellen zachter zijn dan hun niet-getransformeerde tegenhangers^11,38,39. Verhoogde vervormbaarheid speelt waarschijnlijk een prominente rol in het vermogen van kankercellen om weefsels te metastaseren en te infiltreren⁴⁰. Dergelijk gedrag wordt gereguleerd door wijzigingen in de cytoskeletale organisatie van cellen^38,41,42. Naast kanker, een andere klasse van mechanisch-afhankelijke ziekten zijn aandoeningen van de luchtwegen. Bijvoorbeeld, acute ademhalingsstress syndroom treft meer en meer mensen per jaar. Het is aangetoond dat wanneer patiënten mechanische ventilatie krijgen, met hoge concentraties zuurstof, hun toestand kan verergeren⁴³. In een reeks studies waarin alveolaire epitheelmacrofagen met AFM werden waargenomen, ontdekten wetenschappers dat de toevoeging van een zuurstofrijke omgeving de stijfheid van cellen als gevolg van actinvorming verhoogde; een goed voorbeeld van de impact die de AFM heeft op ons gedetailleerde inzicht in de atmosferische milieu-invloed op de ademhalingsfunctie op cellulair niveau en, uiteindelijk, menselijke genezing en gezondheid^44,45,46. Epitheelcelstijfheid tijdens de migratie naar een wond kan ook via de AFM worden beoordeeld en dat een variatie in elastische modulus optreedt om toekomstige celspreiding te signaleren^47,48. Daarom is er een praktische noodzaak om celmechanica kwantitatief te meten om te begrijpen hoe zieke cellen verschillen van, en interageren met, gezonde cellen.

De AFM wordt ook gebruikt om lijmeigenschappen en oppervlaktestructuur te bestuderen. Een atoomkrachtmicroscoop heeft een verscheidenheid aan modi om informatie over een monster te verzamelen met behulp van contactmechanica. Voor levende biologische monsters zijn twee van de primaire doelstellingen het verkrijgen van kwantitatieve mechanische eigenschapswaarden(bijvoorbeeldelastische moduli, kleefkrachten) en de hoogte van het kaartoppervlak. Deze modi omvatten tikken modus (ook bekend als intermitterende contact), die een constante cantilever amplitude met tussenpozen contact met het monster oppervlak en contactmodus, die verhoogt of verlaagt de cantilever om een constante afbuiging⁴⁹te handhaven onderhoudt. Adhesiekaarten kunnen worden verzameld met behulp van force mapping op het AFM-systeem. De cantilever zet het monster in een bepaalde kracht en wordt vervolgens ingetrokken. De kracht die zich verzet tegen intrekking wordt gemeten door de detector om een krachtverplaatsingsgrafiek te genereren. De hechtingskracht is de maximale kracht die tijdens het intrekken wordt gemeten. Oppervlaktemorfologie geeft een gedetailleerd beeld van het monster op micro- of nanoniveau. De cantilever voltooit een rasterscan over het monster op basis van de inkeping en afbuiging die zijn vastgelegd door de beweging van de cantilever bij elke pixel, waarbij functies van micro- en nanoformaat worden onthuld. Bij AFM kan de grootte van kleine kenmerken zoals peptidoglycan structuur^50,polymeerkettinglijn^51,flagella⁵², lamellipodia⁵³en filipodia⁵⁴ worden gemeten. Terwijl de kracht van de AFM ligt in krachtverplaatsingscurven en niet-optische topologische beelden, biedt confocale microscopie gedetailleerde beeldvorming van fluorescerende monsters met het label.

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) is een dominante techniek voor het beeldvorming van levende cellen, vaste cellen en weefsels^55,56,57. CLSM is sinds 1955 werkzaam voor biologische beeldvorming , d.w.z.sinds de oprichting^{van 58,59}. Hoewel het werkingsprincipe van confocale microscopen (d.w.z., de afwijzing van onscherp licht door een gaatje) grotendeels hetzelfde is gebleven , is de technische uitvoering zeer divers geworden^56,57,58,60. Confocale beeldvorming kan worden uitgevoerd via multipoint scanning, zoals in een draaiend schijfsysteem⁶¹, puntscanning van een enkele laserstraal, zoals in line scanning⁶², of beeldvorming van de puntspreadfunctie met daaropvolgende pixelherinningen via een multi-element detector⁵⁷. Recente ontwikkelingen die het nut van confocale beeldvorming uit te breiden omvatten laser scanning vermogen, hoge snelheid resonantie scannen, en hoge gevoeligheid detectoren^63,64,65. Het voordeel dat alle confocale systemen hebben over breedveld microscopen is de mogelijkheid om optische secties uit te voeren in de z-as met meer detail, vooral in dikke monsters. Widefield microscopen met behulp van camera-gebaseerde detectie verzamelen licht dat wordt uitgezonden vanuit het brandpuntsvlak en, tegelijkertijd, licht uitgezonden van overal in de verlichting pad. Door het sluiten van het gaatje, ten koste van het verminderen van het signaal, zowel de axiale en laterale resolutie kan worden verhoogd⁶⁶. In CLSM worden beelden pixel voor pixel opgebouwd door middel van het verzamelen van emissiesignaalen, omdat een excitatielaser wordt gescand over een x-y gezichtsveld. De verzameling van verschillende x-y-vlakken langs de z-as van het monster kan vervolgens worden gebruikt om de 3-dimensionale architectuur van het monster^57,67te reconstrueren . Confocale microscopie in combinatie met de introductie van fluorescerende eiwitten, heeft een revolutie teweeggebracht in ons begrip van celbiologie^68. Bijvoorbeeld, het is uitgegroeid tot een essentieel instrument in de neurowetenschappen⁶⁹. De CLSM wordt regelmatig gebruikt om gewist weefsel te observeren, en om uitgebreide beelden van immuun gekleurde hersenen en neuronale netwerkarchitectuur⁷⁰te verkrijgen. Deze toepassing heeft geresulteerd in nieuwe inzichten in synaptische contacten en communicatie tussen neuronen en gliacellen in de hersenen⁷¹. Van hersencellen tot eikjes, fluorescerende kleuringsprotocollen ondersteunen inspectie en het vastleggen van celfuncties via confocale microscopie voor vooruitgang in therapeutische technieken^72,73.

Hoewel ze zijn indrukwekkend en veelzijdig tools individueel, de combinatie van confocale en atomaire kracht microscopie (Conpokal) stelt onderzoekers in staat om uniek correleren topografische en micromechanische cellulaire / weefsel eigenschappen met de observatie van verschillende cellulaire organellen en hun respectieve dynamiek. Gekoppelde instrumentatie stelt gebruikers in staat om, in wezen, "zien" wat ze zijn indringende; een enorm voordeel ten opzichte van een techniek op zijn eigen. Met Conpokal wordt force mapping via AFM bedekt met confocale beelden om bijvoorbeeld celstijfheid, hechting of morfologie te correleren met de cytoskeletale structuur binnen het monster. Het algemene doel van de Conpokal-methode is om onderzoekers een platform te bieden om levende monsters op een beknopte, effectieve manier te bestuderen, waarbij zowel beeld- als materiaaleigenschapsgegevens in één platform worden verstrekt. In dit werk demonstreren we de werking van Conpokal, inclusief de juiste monsterselectie en -voorbereiding, het instellen van instrumenten, cantilever kalibratie en richtlijnen voor succesvolle probleemoplossing. Na het protocol bieden we representatieve resultaten die succesvolle bacteriën en cel AFM hoogtemapping, bacteriën en cel AFM modulus mapping, en confocale beeldvorming van multi-label cellen, via dezelfde cel confocale en AFM. We sluiten af met een bespreking van de Conpokal-procedure kritieke stappen, aanbevelingen voor het oplossen van problemen, beperkingen van de techniek, betekenis en toekomstige vooruitzichten voor de methode.

Protocol

1. Bereiding van instrumenten, cultuurmedia, gerechten

1. Zet de krachtbronnen voor zowel de confocale microscoop en de atoomkracht microscoop, evenals alle andere bijbehorende instrumenten of apparaten gebruikt tijdens Conpokal. Laat de instrumenten voldoende tijd hebben om thermisch te equilibiseren en te stabiliseren voordat de metingen beginnen. Typisch, 1 uur is voldoende.
2. Bereid een schone, systeemgekeurde petrischaal met glazen bodem en vul halfvol, maar niet meer dan twee derde vol, met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of soortgelijke heldere vloeistof. Deze schotel (aangeduid als de "kalibratie schotel") is gescheiden van het monster gerechten en zal worden gebruikt om te lokaliseren en kalibreren van de atoomkracht microscoop (AFM) cantilever.
   OPMERKING: Het is belangrijk dat de vloeistof helder is en een lage autofluorescentie heeft om interferentie met de fluorescentiespectra te voorkomen. PBS wordt aanbevolen omdat het de biologische omgeving nabootst.
3. Bereid experimentele monstergerechten zodanig dat de bijbehorende vloeistof de schotel minstens half vol heeft gevuld. Als het monster fluorescerend is, zorg er dan voor dat het bedekt is of op een donkere plaats totdat het nodig is. Maak de bodem van alle glazen schotels schoon met lensreiniger en lensdoekjes.
4. Mappen voor gegevensopslag maken voor de confocale en AFM op de harde schijf(s) van de computer(en).

2. Selectie van cellen of micro-organismen

1. Om bacteriën voorraad oplossing te creëren, inenting Streptococcus mutans bacteriën, met behulp van een inenting lus, in 15 mL van Todd Hewitt Gist (THY) 's nachts (voor exponentiële fase) in een 5% CO₂ incubator.
2. 1 uur voordat de nachtelijke incubatie is voltooid, vacht experimentele monsterschotels met 1 mL poly-l-lysine oplossing of genoeg om het glazen gedeelte van de glazen bodem schotel te bedekken en laat in de biosafety kast voor 1 uur. Na het instellen, aspirate poly-l-lysine oplossing en spoel de gerechten 3x met PBS.
3. Na 18 – 24 uur bacteriële incubatie, inenting THY met 1 mL bacteriële suspensie tot een optische dichtheid van 0,6 – 0,7 wordt bereikt (typische waarden voor inenting zijn 3 mL thy met 1 mL bacteriële suspensie per schotel). Voeg 1 mL nieuwe bacterieoplossing toe aan elk met poly-l-lysine gecoate schaal en broed gedurende 1 uur. Voeg gedurende de laatste 10 minuten 1 mL groene fluorescerende membraanvlek (concentratie van 1 μM) toe aan elk gerecht.
4. Spoel elk gerecht 3x met PBS. Bevestig de bacteriën voorzichtig met ongeveer 1 mL van 4% paraformaldehydeoplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een bioveiligheidskast. Spoel elke schotel 3x met PBS na fixatie.
5. Bewaar de Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cellen in vloeibare stikstof. Voer snel ontdooien bij 37 °C waterbad voor beplating.
6. Voeg 1 mL van keldermembraan matrix oplossing in celkweek media aan elke cel monster schotel en incbaat (5% CO₂) bij 37 °C voor 1 uur. Aspirate de oplossing en was de afwas met cel cultuur media. Plaats het vereiste aantal HEK 293-cellen(bijvoorbeeld100.000 cellen per schaal van 35 mm) en voeg 2 mL celkweekmedia toe. Vervolgens, incubeer (5% CO₂) de cellen bij 37 °C gedurende 48 uur.
7. Voeg na 48 uur 2 μL van een fluorescerende microtuble cytoskeletkleurstof (concentratie van 1x) toe aan elke celmonsterschaal en broed gedurende 30 minuten in. Aspirate de oplossing met de kleurstof, was de cellen 3x met PBS, en voeg 2 mL van celcultuur media.
8. Voeg 1 μL plasmamembraankleurstof (concentratie van 10 μM) toe aan de monsterschalen en broed gedurende 30 minuten uit. Was de oplossing met de kleurstof 3x met PBS en voeg 2 mL celkweekmedia toe.
9. Tegenstain de kern door 1 μL van een nucleïnezuurkleurstof (concentratie van 10 μM) aan de monsterschalen toe te voegen en gedurende 30 minuten in te broeden. Was de oplossing met de kleurstof 3x met PBS en voeg 2 mL cultuurmedia toe.

3. AFM-procedure

1. Open de atomaire krachtmicroscoop (AFM) bedieningssoftware door op het softwarepictogram op de computer te klikken.
2. Draai naar of voeg een lage vergrotingsluchtdoelstelling (aanbevolen 10x of 20x). Een lange werkafstand van 5 mm of meer is gunstig bij het verlagen van de tip en kalibratie.
3. Monteer de gekozen celmonsterfase als deze nog niet is geïnstalleerd. Voor levende monsters, gebruik een schotel kachel om het monster op de gewenste temperatuur te houden.
4. Laad de schone, door het systeem goedgekeurde petrischaal half vol PBS (bereid in stap 1.2) of soortgelijke heldere vloeistof (kalibratieschotel). Als de monsterfase ingebouwde gespen heeft, gebruikt u deze, anders gebruikt u vacuümvet om het monster te stabiliseren.
5. Selecteer een geschikte AFM cantilever voor de gewenste gegevensverzameling en installeer deze volgens de onderstaande stappen.
   1. Monteer met handschoenen de AFM-chip in het glazen blok met behulp van de AFM-chipmontage, pincet en een kleine schroevendraaier. Plaats de AFM-chip voorzichtig op het glazen blok en oriënteer deze zodanig dat deze gecentreerd is. De cantilever, plus een zeer klein deel van de AFM-chip, moet zich in het zichtbare, niet-ondoorzichtige gedeelte van het montageblok bekent.
   2. Zet de chip met de schroevendraaier vast door de schroef aan te draaien totdat de chip tegen het glazen blok zit. Controleer of de AFM cantilever correct is georiënteerd met behulp van een stereo microscoop of een handheld spyglass. Aanpassen als dat nodig is. Eenmaal goed georiënteerd, plaats het glazen blok in de AFM kop in de juiste oriëntatie en vergrendelen op zijn plaats.
      LET OP: De oriëntatie van de AFM-chip in het glazen blok is belangrijk, zodat de systeemlasers op de achterkant van de cantilever richten en correct reflecteren op de fotodetector. Wees voorzichtig niet te overtighten de schroeven tijdens de plaatsing als deze procedure kan leiden tot de AFM chip, cantilever, of tip te breken.
6. Met behulp van de brightfield optie van de confocale microscoop, zoek de onderkant van de kalibratie schotel met behulp van de focus knop. Let op deze z hoogte als de waarde waar de bodem van de schotel zich bevindt met betrekking tot de microscoop doelstelling.
7. Met behulp van het motorbedieningspaneel van het AFM-systeem op de computer die de z steppermotoren bedient, verplaatst u de AFM-cantilever van het monster naar boven 2000 μm.
8. Plaats met beide handen voorzichtig het AFM-hoofd met de AFM-chip op de monsterfase om ervoor te zorgen dat elk van de verticale punten op de AFM-kop stevig in hun aangewezen groeven op het AFM-podium is geplaatst. Zodra de AFM-kop op zijn plaats is, visueel zien hoe dicht de cantilever houder is om de schotel. Als het te dichtbij lijkt te zijn, zodanig dat de AFM-kop in contact is of binnen 1 mm van de bovenkant van de monsterschotel, steun deze dan met behulp van de z-steppermotoren voordat de AFM-tip naar het monster wordt verlaagd.
9. Met behulp van brightfield verlichting, langzaam lager de AFM chip aan de onderkant van de glazen schotel met behulp van de z stepper motor bedieningspaneel op de AFM software. Zoek de handmatige micrometers die x-y of in-plane beweging van de AFM-kop op het instrumentenplatform regelen. Pas de positie van de AFM cantilever binnen het gezichtsveld aan door de AFM-kop te corrigeren terwijl de cantilever in beeld komt.
   1. Aangezien de locatie ten opzichte van de bodem van de schotel is onbekend op dit moment, lager met stappen van 100 – 200 μm om te voorkomen dat crashen de AFM tip in de Petri schotel. Meestal moet de tip worden verlaagd 800 – 2000 μm. Als de tip wordt verlaagd, kijk voor een schaduw te verschijnen op de microscoop software weergave, die aangeeft dat de AFM tip wordt steeds dichter bij de bodem van de schotel.
   2. Verlaag de verhogingen tot 20 – 50 μm. Zorg ervoor dat u de opzoektabellen (LUTs) van het camerabeeld aanpast als de tip in de schotel daalt met behulp van het TTS-paneel op de confocale software. Blijf de AFM-tip verlagen met kleine stappen totdat deze meestal in focus is.
   3. Zorg ervoor dat de tip donker genoeg is, zodat de algemene vorm ervan kan worden gezien en gecentreerd in het gezichtsveld. Zorg er ook voor dat de tip wazig lijkt, wat bevestigt dat het nog niet de onderkant van de schotel heeft ondervonden.
10. Pas de microscoopfocus zodanig aan dat de punt nu scherp is, rekening houdend met de werkafstand van het doel. Voordat u naar een hogere vergrotingsdoelstelling gaat, gebruikt u het meetinstrument voor de microscoop om de breedte en lengte van de AFM-cantilever te verzamelen door toegang te krijgen tot het meetgereedschappaneel op de confocale software. Let op deze metingen.
    OPMERKING: Het is belangrijk om het doel niet in de bodem van de monsterschotel te laten crashen, waardoor de monsterschotel ook in contact kan komen met de AFM-tip, waardoor deze mogelijk beschadigd kan worden.
11. Als aanwezig is, verwijder dan het laserlichtfilter en zorg ervoor dat de AFM-laser is ingeschakeld, zodat het laserlicht zichtbaar wordt in de optiek.
    1. Met behulp van de laser uitlijning wijzerplaten, verplaats de laser in het gezichtsveld en in de buurt van de AFM tip. Zodra de laser zich op deze locatie bevindt, vervangt u het laserlichtfilter.
    2. Plaats de laserwijzerplaat met behulp van de laseruitlijningswijzerplaten op de achterzijde van waar de AFM-tip zich op de cantilever bevindt. Op dit punt moet de laser uitlijning paneel het lezen van een som signaal groter dan 0,0 V. Als er geen somsignaal wordt verkregen, past u de spiegel aan met behulp van de handmatig aangestuurde spiegelknop totdat een somsignaal groter dan 0,0 V op het scherm wordt gelezen.
    3. Verplaats de laser in kleine hoeveelheden in alle richtingen op de AFM cantilever totdat het maximale somsignaal is bereikt, maar de positie is op de AFM tip. Zodra de laserpositie is ingesteld, nul de verticale en laterale afbuiging met behulp van de handmatig geregelde afbuiging wijzerplaten.
    4. Observeer het laseruitlijningspaneel op de AFM-software en gebruik de verticale en laterale afbuigingsknoppen op de AFM-kop, lijn de detector uit zodat het doel gecentreerd is (rode stip in het midden van het vizier) en er is geen verticale of laterale afbuiging.
12. Open het kalibratievenster in de AFM-software. Voer alle experimentspecifieke informatie in. Schakel voordat u de confocale microscooplichtbron kalibreert en sluit de AFM-behuizing, indien van toepassing, om eventuele geluidshinder van het licht of de kamertrillingen te dempen. Druk vervolgens op de kalibratieknop om het systeem automatisch de tip te laten kalibreren. Nadat de kalibratie is voltooid, wordt de stijfheid van de cantilever (N/m) en de gevoeligheid (nm/V) in het kalibratiepaneel geleverd. Let op deze voor latere analyse.
13. Trek de AFM cantilever minstens 2000 μm in met de steppermotoren. Haal het AFM-hoofd van het podium en verwijder de kalibratieschotel. Draai naar of voeg het gewenste doel in. Trek de doelstelling 10% van de werkafstand in als het systeem is geprogrammeerd om hetzelfde brandpuntsvlak tussen de doelstellingen te behouden. Als dit een olie doelstelling, plaats een druppel onderdompeling olie op het oog van het doel.
    OPMERKING: Het intrekken van de doelstelling vermindert de kans dat de doelstelling tijdens de plaatsing contact maakt met de monsterschaal.
14. Om de monsterschaal veilig op zijn plaats te houden, gebruikt u een wattenstaafje om kleine schar van vacuümvet rond de rand van de monsterring binnen de monsterfase aan te brengen of gebruik te maken van monsterclips. Laad de monsterschotel voorzichtig in de monsterfase.
15. Zodra het monster is geplaatst, draai het een paar keer om een goede afdichting van de schotel te garanderen aan de monsterhouder via het vet. Verhoog het doel naar de bodem van de schotel totdat de olie net wieken over het oog van het doel.
16. Met behulp van de microscoop, zonder de AFM hoofd op het podium, focus het beeldvormingssysteem, zodat het monster is in focus. Let op deze z-hoogte ter referentie.
17. Vervang de AFM-kop voorzichtig op het platform.
18. Met behulp van de z stepper motoren, lager de tip naar het monster. Als de AFM-tip wordt verlaagd, past u de opzoektabellen (LUTs) in het brightfield-beeld indien nodig aan. Laat de tip tot bijna scherp. Verplaats met de handmatig bediende AFM-tippositie micrometers de AFM-kop zodat de AFM-tip zich in het midden of links gecentreerd in het gezichtsveld bevindt.
    OPMERKING: Aangezien de z-hoogte van de AFM eerder in stap 3.6 werd genoteerd, kunnen grotere stappen worden genomen om de AFM-tip te verlagen, maar vet is toegevoegd aan de bodem van de schotel en mogelijk olie aan het doel, dus deze waarde is slechts ter referentie. Het wordt aanbevolen om stappen van 50 tot 100 μm te nemen en kleiner aan te passen naarmate de tip in beeld komt
19. Stel de laserpositie aan met behulp van de handmatige micrometers op de AFM-kop. Indien nodig, nul de verticale en laterale afbuigingen door het aanpassen van de respectieve knoppen en opnieuw kalibreren van de AFM cantilever in het monster schotel.
    OPMERKING: Als de cantilever is gekalibreerd in een ander medium dan het monster, moet deze opnieuw worden gekalibreerd in het scanmedium om rekening te houden met een mogelijke wijziging in de brekingsindex. Bovendien kan de laser drijven van de achterkant van de cantilever als gevolg van lawaai of temperatuurveranderingen. Pas de laser alleen aan en herkalibreren indien nodig en in de monsterschaal boven het glazen substraat bij gebruik van contactloze kalibratie. Bij gebruik van contactkalibratie, opnieuw kalibreren binnenkant van de kalibratie schotel met behulp van het monster medium.
20. Om hoogwaardige confocale microscoopbeelden te bereiken, vervangt u het huidige dempende lichtfilter door het filter dat alle AFM-laserlicht blokkeert. Dit lichtfilter zorgt voor geen interferentie door het felle licht van de AFM laser.
21. Met behulp van de automatische aanpak opdracht knop, meestal aangeduid met een naar beneden gerichte pijl, lager de tip naar de onderkant van het monster schotel. Stel de grootte/het gebied van de scan, de resolutie, het setpoint, de z-lengte en de pixeltijd (of gebruik de gekalibreerde/doorgepropte waarden) in op het configuratiescherm en begin met scannen.
22. Nadat een scan is voltooid, tilt u de AFM-chip 50 – 100 μm omhoog voordat u naar een nieuwe meetpositie in de monsterschaal gaat. Zodra een nieuwe locatie is gevonden, nadert u het glas en begint u opnieuw te scannen na de stappen 3.21 en 3.22.
23. Selecteer de optie Automatisch opslaan of sla elk gegenereerd bestand handmatig op uit elke afzonderlijke scan door op Opslaante klikken.

4. Confocale procedure

1. Open de confocale besturingssysteemsoftware. Zorg ervoor dat alle bijbehorende randapparatuur, lichtbronnen en controllers zijn ingeschakeld en normaal functioneren.
2. Draai of voeg een doelstelling van een lage vergroting (10x of 20x) in om het monster weer te geven. Zorg ervoor dat het doel zich op een veilige werkafstand bevindt van waar de monsterschaal zich bevindt en indien nodig, het doel om mogelijke botsingen van het doel met het monster te voorkomen. Met behulp van een wattenstaafje, dep vacuüm vet rond de rand van het monster schotel ring. Bij gebruik van een oliedoelstelling plaatst u een druppel onderdompelingsolie op de voorlens van het doel
3. Plaats het gewenste monster in de monsterfase. Draai het monster een paar keer rond om ervoor te zorgen dat vacuümvet een strakke binding aan de monsterfase heeft gegenereerd en sampleclips heeft gebruikt. Bij gebruik van een olie doelstelling, verhogen het doel naar de bodem van de schotel, zodat de olie gewoon wieken over de glazen bodem. Om overmatig bleken te voorkomen, minimaliseer je omgevingsverlichting.
4. Met behulp van brightfield of epifluorescentie modi via de camera of oculairs, lokaliseren van het monster en met behulp van de focus knop, focus op een gebied van belang met meerdere cellen of een enkele cel. Vaak zal het gezichtsveld binnen de optische microscoop groter zijn dan het x-y scanvenster op het AFM-systeem (100 x 100 μm). Breng de AFM-positie binnen het confocale gezichtsveld aan door gebruik te maken van het motorbedieningspaneel in de AFM-software, zodat de AFM-scan en confocale optiek dezelfde functies weergeven.
   OPMERKING: Binnen het gezichtsveld zijn er meestal slechts een paar cellen, dus het is gemakkelijker om te bepalen welke cel gewenst is om te sonde. Als afm wordt uitgevoerd, wordt de cel zichtbaar op de AFM-software en van daaruit kan de gebruiker specifieke gebieden lokaliseren die van belang zijn om te onderzoeken.
5. Maak desgewenst beelden vast in helder veld of epifluorescentie met behulp van een camera of CLSM-modi op basis van het label van het monster, focusknoppen en legknoppen vast op de microscoopsoftware.
6. Selecteer met behulp van de microscoopsoftware de optie of open het paneel om confocale mogelijkheden mogelijk te maken(bijvoorbeeldlasers en volgende parameters). Deze optie wordt meestal opgemerkt door de laserlijn golflengte waarden.
7. Selecteer de laserlijnen die geschikt zijn voor de kleurstoffen die worden gebruikt voor het beitsen van de monsters. Schakel een of meerdere laserlijnen in om deze functies in het voorbeeld op te wekken en te beelden.
8. Stel de winst in op een waarde die de fluorescentie van de monsters optimaliseert, maar de hoeveelheid ruis beperkt. Een typische startwaarde is een winst van 70.
9. Pas de laserkracht aan om verzadigde pixels te vermijden, maar maximaliseer het dynamisch bereik. Een typisch startbereik voor de laserkracht is 1 – 3 %.
10. Stel de pinhole grootte in op 1 Luchtige eenheid om de resolutie voor de optische sectie te maximaliseren. Als het monster zwak is en de laserkracht al hoog is, opent u het gaatje om het signaal te verhogen ten koste van het verlagen van de z-asresolutie.
11. Stel de tijd van de pixelwoning in(d.w.z.de scansnelheid). Begin met een verblijfstijd van 2 μs en pas indien nodig aan om de helderheid van het monster weer te geven. Kies de pixelgrootte/scangrootte voor de geselecteerde doelstelling door het instrument te laten berekenen via de optieknop Nyquist en het gekozen aantal pixels in de afbeelding.
    OPMERKING: Langere verblijfstijden in dikkere monsters kunnen leiden tot overmatig bleken wanneer z-stacks worden verzameld.
12. Selecteer de optie Scannen op de software van het instrument en begin met het verzamelen van gegevens.
    OPMERKING: Als het instrument meerdere lasers heeft, kunnen ze onafhankelijk van elkaar worden geoptimaliseerd en vervolgens tegelijkertijd worden uitgevoerd voor afbeeldingen met meerdere tl-tl.Note: If the instrument has multiple lasers, each can be optimized independently, and then ran simultaneous for multi-fluorescent images.
13. Gebruik de focusknop om in- en uit te zoomen en het optimale gezichtsveld in het voorbeeld te lokaliseren.
14. Leg afbeeldingen vast met de knop Vastleggen van het systeem en sla alle benodigde bestandsindelingen van het voorbeeld op naar een gewenste locatie/map op de harde schijf van de computer of lokale externe harde schijf.
15. Blijf gain, laserkracht, pinhole grootte, sampling rate en andere waarden dienovereenkomstig aanpassen om de afbeelding te optimaliseren. De pixelverzadigingsindex kan worden geactiveerd om te controleren of pixels oververzadigd zijn. Als deze oververzadiging aanwezig is, kunnen gain en laserkracht worden aangepast om verzadigde pixels te elimineren. Gebruik de LUTs als leidraad om specifieke aanpassingen aan te brengen.
16. Gebruik indien mogelijk de Nyquist-samplingrate van het systeem, die in de software wordt weergegeven als een paneel of knop, om ervoor te zorgen dat afbeeldingen worden verzameld op de maximaal haalbare resolutie.
17. Activeer het z-stack- of afbeeldingsvolumeverzamelingsgereedschap van het confocale systeem. Met behulp van een bottom-to-top optie, met slechts een laser lijn, met name de laser lijn die een functie verlicht in het monster de helderste, stel de start en finish vliegtuigen voor het volume te meten.
18. Gebruik de voorgestelde afstand tussen vlakken in de z-stack, die wordt berekend om te voldoen aan de Nyquist-bemonsteringscriteria voor de best verkrijgbare axiale resolutie die het instrument en de gebruikte laserlijn bieden.
19. Wanneer meerdere laserlijnen worden gebruikt, gebruikt u de kortste golflengte voor de berekening van de afstand. Wanneer de overname is voltooid, slaat u het bestand op in de juiste map.
20. Als a priori kennis van de dikte van het monster bestaat, definieert u ook het volume door het middelste vlak te selecteren, het vlak dat het helderst en het scherpst lijkt. Stel in deze situatie de bovenkant in op de helft van de monsterdikte boven het middelste vlak en de bodem op de helft van de dikte onder het middelste vlak.
21. Nadat de monsterverzameling in dit gezichtsveld is voltooid of het monster is gebleekt, gebruikt u het gemotoriseerde of handmatig gecontroleerde stadium om een andere plaats van belang op het voorbeeld te vinden en de stappen voor het verzamelen van afbeeldingen te herhalen.

5. Saneringsprocedure

1. Zorg ervoor dat alle gegevensbestanden, zowel van de CLSM als van de AFM, worden opgeslagen op de juiste locaties.
2. Trek de AFM-chip in met behulp van de z-steppermotoren van ten minste 2000 μm of de afstand die is afgelegd om bij het monsteroppervlak te komen. Haal het AFM-hoofd van het podium en plaats het voorzichtig op zijn rustplaats.
3. Trek de microscoopdoelstelling in, zodat deze ver weg is van het monster. Indien een oliedoelstelling is gebruikt, moet het doel ver genoeg worden ingetrokken, zodat er geen contact meer is tussen het doel en het monstersubstraat.
4. Verwijder met handschoenen het monster en maak het vet en olie indien van toepassing van de bodem van de monsterschaal schoon. Verwerf een nieuwe, schone, lege petrischaal en vul deze met 70% ethanoloplossing voor de helft tot driekwart vol. Plaats deze in de monsterhouder en vervang de AFM-kop zodat de AFM-chip 5 min in de ethanoloplossing kan weken.
5. Terwijl de AFM-chip doorweekt is, is het raadzaam om te beginnen met het kopiëren van de experimentgegevens naar een externe harde schijf. Na het onderdompelen van de AFM-chip in ethanoloplossing gedurende ten minste 5 minuten, verwijder de AFM-kop en zet deze op zijn rustplaats.
6. Verwijder met handschoenen de AFM-chiphouder en plaats deze in het montagestation. Verwijder de AFM-chip voorzichtig met een pincet met rubberen grepen. Plaats de gebruikte tip terug in de locatie van het vak kwam van georiënteerde off-as aan te geven dat het is gebruikt. Voor toekomstige referentie, let op welke tip werd gebruikt in het experiment.
7. Haal de petrischaal gevuld met de ethanoloplossing uit het systeem en gooi de vloeistof en de schotel weg. Met behulp van handschoenen, lens reiniger, en lens doekjes, voorzichtig reinigen van de olie uit de microscoop doelstelling volgens standaard protocollen. Reinig de monsterhouder door het verwijderen van vet. Gooi alle afvalstoffen volgens bioveiligheidsprotocollen weg en breng gereedschap terug naar hun bekende locaties.
8. Werk het verzamelen van gegevens van de computer(en) af en sluit ze af. Schakel alle instrumenten, accessoires, randapparatuur of andere apparaten die voor het experiment worden gebruikt uit.

Results

De Conpokal-techniek is schematisch vertegenwoordigd in figuur 1A en een afbeelding van de setup wordt weergegeven in figuur 1B. Om biologische structuren via confocale microscopie nauwkeurig te co-lokaliseren met dezelfde structuren in de AFM, is de uitlijning van de twee systemen tijdens de installatie van cruciaal belang. Selecteer gerenommeerde confocale en AFM-fabrikanten die bekend zijn met elkaars ruimtelijke eisen. Daarnaast is een succesvolle implementatie van de techniek afhankelijk van goede kleuringsprocedures, immobilisatie van de biologische structuur en de juiste keuze van afm-tip. De hoogte van levende cellen vormt vaak een uitdaging voor de AFM-beeldvorming. Een AFM-scan boven een levende HEK-cel wordt weergegeven in figuur 2A. De hoogte voor deze specifieke HEK-cel was ongeveer 10 μm, aangetoond door de lijnscan in het groen (Figuur 2B). Een AFM-tip met nulverschuiving (tip is helemaal aan het einde van de cantilever) of de tiphoogte groter dan de celhoogte(bijvoorbeeldde tiphoogte ≥ 10 μm) zal een sterk opgelost beeld van individuele cellen produceren. Een voorbeeld van een slechte scan als gevolg van onjuiste AFM tip keuze is opgenomen in figuur 2C. In deze afbeelding verschenen zwarte pixels aan de top van de cel, wat aangeeft dat de AFM-piëzo buiten bereik is vanwege een grote celhoogte. Het uiteinde van de AFM cantilever verscheen in de afbeelding (een afgerond vierkant) als gevolg van tip offset in combinatie met onvoldoende tip hoogte in vergelijking met celhoogte. Deze artefacten in de AFM-afbeelding geven aan dat een andere AFM-tip moet worden gekozen om de cel in beeld te brengen.

Efficiënte etikettering in fluorescentie vlekken samen met de juiste sonde voor live cel beeldvorming zijn vereist voor deze methode. We hebben een confocale afbeelding van drie kleuren uitgevoerd in figuur 3A met een nucleaire vlek (fluorescerend blauw), een microtubulivlek (fluorescerend groen) en een lipofiele membraanvlek (tlrisch rood). Deze levende celsondes werden gekozen vanwege hun beperkte spectrale overlap en hun compatibiliteit met standaard filterblokjes. We hebben ook het brightfield optische beeld opgenomen in figuur 3B.

Van AFM, analyse van de tip inkepingen samen met een nanomechanisch model, produceert een modulus kaart van het oppervlak. Een voorbeeld van een moduluskaart die is gemaakt met behulp van een Hertz-modelpasta en een parabolisch profiel (straal van 8 nm) voor de tipvorm, wordt bedekt weergegeven op de 3D-reconstructie van de celvorm in figuur 4A (dat zijn dezelfde twee cellen in figuur 3). De overeenkomstige 3D-projectie van de laserconfocale z-stack wordt weergegeven in figuur 4B.

De methode is ook geschikt voor kleinere biologische structuren, met inbegrip van enkele bacteriën waarvan de micro-en nanoscopische kenmerken zijn moeilijk op te lossen met behulp van lichte microscopie. Een lopende studie maakt gebruik van de Conpokal techniek om mechanische mechanismen binnen de celwand die antibioticaresistentie beïnvloeden in Streptococcus mutans.⁷⁴ Manipulatie van de celwand componenten resulteerde in veranderingen in de morfologie en antibioticaresistentie te verkennen. Conpokal faciliteert live, in-solution, dataverzameling(bijvoorbeeldoppervlaktemorfologie, elastische modulus, hechtingsterkte en oppervlakteruwheid) op monsters van dezelfde cel om mechanische eigenschappen te koppelen aan de aanwezigheid of afwezigheid van celwandcomponenten. Figuur 5A,B bevat een AFM-scan en gemeten moduluskaart van een Streptococcus-mutansbacterie. Met de AFM werd op deze schaal een betere resolutie bereikt dan met traditionele confocale microscopie.

Figuur 6 bevat een confocale afbeelding van een kolonie Enterococcus faecalis bevlekt met een groene fluorescerende celstructuur vlek, die hecht aan de celwand. Figuur 5 en figuur 6 tonen de toepasbaarheid aan van de Conpokal-techniek op microben naast eukaryotische cellen.

Figuur 1: De Conpokal setup.
(A) Schematisch conpokaltechniek. (B) Afbeelding van de opstelling van het instrument. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Atomaire krachtmicroscopie van levende cellen.
(A) AFM beeld van twee HEK cellen. (B) Hoogteprofiel (groene lijn in A) van een HEK-cel die de celhoogte aangeeft, is vrij groot op 10 μm. (C) Slechte AFM beeld van een astrocyten cel waar de AFM piëzo is buiten bereik aan de top van de cel en er is bewijs van omgekeerde beeldvorming van de cantilever einde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Confocale en brightfield microscopie van levende cellen.
(A) Laser scanning confocale microscopie van levende HEK cellen bevlekt met een nucleaire vlek (fluorescerende blauw), een microtubuli vlek (fluorescerend groen) en een lipofiele membraanvlek (tl-rood). (B) Overeenkomstige brightfield optisch beeld. Schaalbalken zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van 3D-renderings van AFM en confocale microscopie van levende HEK-cellen.
(A) Modulus kaart gebouwd met behulp van een Hertz model fit en een parabolisch profiel (straal van 8 nm) voor de tip vorm bedekt op de 3D reconstructie van de cel van AFM. (B) De overeenkomstige 3D-projectie van de laser confocale z-stack met een nucleaire vlek (fluorescerend blauw), een microtubbulevlek (fluorescerend groen) en een lipofiele membraanvlek (tl-rood). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: AFM van bacteriënmonster.
(A) AFM scan en (B) gemeten modulus kaart van een Streptococcus mutans bacterie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Confocale microscopie van bacteriënmonster.
Confocal beeld van een kolonie van Enterococcus faecalis met groene fluorescerende membraanvlek. Schaalbalk is 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Conpokal is een geavanceerde, effectieve techniek voor het verzamelen van hoogwaardige beelden en in situ mechanische eigenschappen van levende biomaterialen in een vloeibare omgeving. De mogelijkheid om uitzonderlijke morfologie- en topografiebeelden te verzamelen in combinatie met live-sample mechanische eigenschappen strekt zich uit langs typische elektronen- en lichtmicroscopietechnieken. Afzonderlijk, een confocale microscoop biedt brightfield, epifluorescentie, en laser scannen confocale mogelijkheden om hoge kwaliteit, gedetailleerde fluorescerende beelden van monsters te bereiken. Een AFM zorgt voor mechanische karakterisering, maar zonder hulpoptica wordt het moeilijk om door het monster te navigeren. Met de twee systemen gecombineerd, kan een gebruiker zowel beelden als mechanische eigenschappen van exact dezelfde cel verzamelen tijdens het experiment, wat een groot voordeel is ten opzichte van twee afzonderlijke instrumenten. Het doel van dit manuscript is om gebruikers te informeren en te begeleiden over de uitgebreide mogelijkheden van het gecombineerde Conpokal-systeem voor de toekomst van biologie, techniek en gezondheid. Het protocol omvat de voorbereiding van instrumenten, cultuurmedia, gerechten, selectie van micro-organismen, AFM-procedure, confocale procedure en opruimen. De meest kritieke stappen voor een succesvolle live, in-oplossing, Conpokal sessie zijn monster immobilisatie, oordeelkundige tip selectie, en live vlek uitvoering. De discussiesectie voor dit manuscript zal ingaan op cultuuraanbevelingen, tips voor het oplossen van problemen en operationele richtlijnen en toekomstig werk voor de Conpokal-techniek. Cultuuraanbevelingen hebben betrekking op richtlijnen voor voorbeeldcultuur, immobilisatie en kleuring. Tips en richtlijnen van de AFM, confocale en Conpokal bespreken de selectie en kalibratie, resolutie, beperkingen en bijna gelijktijdige werking. Toekomstig werk omvat de vooruitzichten en het potentieel voor toekomstige onderzoekstrajecten.

Het protocol heeft betrekking op cultuur, indringende, en beeldvorming van zowel levende cel en vaste bacteriën monsters. Een uitdaging aanwezig bij het uitvoeren van AFM in vloeistof komt voort uit cantilever beweging obstructie als gevolg van monster hindrance en hydrodynamische slepen. Als het monster niet goed aan het substraat wordt gehecht, is er potentieel voor vervuiling van de cantilever door delen van het monster die in de vloeistof zweven. In dat geval worden metingen gecompromitteerd omdat ze een veronderstelling zijn van elastische hechting en micromechanische eigenschappen van het monster. De HEK cellen werden niet behandeld met fixatieve, echter, S. mutans en E. fecalis vereisen extra immobilisatie, vergelijkbaar met andere prokaryotische cellen. De gekozen bacteriën vertoonden actieve beweging die celonderzoek en beeldvorming belemmerde, daarom werden de monsters voorzichtig, chemisch bevestigd om immobilisatie te bevorderen. Er zijn alternatieven voor chemische fixatie, zoals filtermembranen die individuele cellen fysiek in poriën⁷⁵vangen.

Tip selectie is ook een essentieel onderdeel van de installatie en werking van de AFM. Wanneer mechanische eigenschappen op basis van vervorming van het biomateriaal worden gezocht, moet men rekening houden met cantilever stijfheid en materiaalstijfheid compatibiliteit, dat is een niet-triviale taak. Het belangrijkste doel is om de stijfheid van het materiaal het beste te matchen met de stijfheid van de geselecteerde cantilever. Als de cantilever veel zachter is dan het monster, zal het te veel afbuiging. Als de cantilever stijver is dan het monster, kan de AFM-detector dergelijke kleine afbuigingen niet kunnen opvangen. Het wordt aanbevolen dat bij het selecteren van een geschikte AFM cantilever, om te kiezen op basis van experimentele toepassing. Om gedetailleerde beelden te verzamelen in intermitterende contactmodus, zijn AFM-tips binnen een bereik van 0,1 - 0,3 N/m voor stijfheid en tipradius binnen 5 nm – 100 nm effectief voor live celbeeldvorming. Kleine conische tips worden aanbevolen. Scherpe tips bieden een klein contactgebied en de mogelijkheid om verdere hulp te krijgen bij het verzamelen van kleine details en functies in monstermorfologie⁷⁶. Scherpe tips kunnen echter ook problematisch zijn omdat ze gevoelig zijn voor het doorboren van monsters wanneer de instellingen(bijvoorbeeldingestelde punt, pixeltijd, naderingssnelheid) te veel inspringing vereisen of de inkeping te snel is. Om effecten met een hoge belasting, lokale spanningsverharding in de buurt van een scherpe punt te voorkomen, of gewoon om het contactgebied en de naderingssnelheid te regelen, kiezen velen ervoor om krachtspectroscopie te gebruiken met een colloïdale tip om een elastische modulus te meten.

AFM-tips binnen een bereik van 0,01 - 1,0 N/m voor stijfheid en tipradius binnen 1 – 5 μm worden aanbevolen om de elastische moduli van levende cellen te meten. Grote tipmaten, meestal glazen colloïden, zorgen voor een bekend contactgebied en zullen de cel waarschijnlijk niet doorboren terwijl ze in contact zijn. Rechthoekige cantilevers hebben de voorkeur boven driehoekige, omdat tijdens de kalibratie de contactvrije methode kan worden gebruikt voor rechthoekige geometrie in vergelijking met op contact gebaseerde kalibratie voor driehoekige geometrieën. Vanwege de delicate aard van afm-tips wordt de operator ook aanbevolen een pincet met rubberen tips te implementeren om de kans op beschadiging van de delicate AFM-chip of montageblok te verkleinen. Andere parameters om in gedachten te houden zijn de naderingssnelheid van de AFM-tip en de hoeveelheid inspringing in het monster. Een goede richtlijn is om de inkeping te houden tot ongeveer 10% van de dikte (of hoogte) van het monster en kies een snelheid die mogelijke hydrodynamische weerstand ervaren door de cantilever³⁸uitsluit.

Ingewikkelde experimentele instrumenten worden meestal geleverd met wegversperringen die het oplossen van problemen vereisen in het opzetten, kalibreren en bedienen van het instrument. Crashen van de AFM tip of cantilever in het monster of monster substraat is een veel voorkomende fout voor nieuwe gebruikers. Om dit probleem te voorkomen, stelt het protocol voor om de cantilever 2000 μm te steunen. Deze stap zorgt ervoor dat de tip niet in contact komt met de bodem van de schotel als de vorige gebruiker vergat de tip terug te trekken bij het opruimen na het experimenteren. De afstand van 2000 μm werd echter gekozen voor de geselecteerde schotelhouder die in dit protocol wordt gebruikt. Afhankelijk van de gebruikte stijl van de schotelhouder moet mogelijk een ander bereik worden gekozen, groter of kleiner. Tijdens de uitlijning van de laser en detector, het protocol noemt aanpassing van een spiegel knop om de som signaal te maximaliseren. Een spiegelverstellingsknop is mogelijk niet op alle AFM's aanwezig. Indien aanwezig, echter, een manier om het instrument te manipuleren om een lage som signaal op te lossen is het aanpassen van de spiegel knop, gebruikt om rekening te houden met het medium waarin scannen zal plaatsvinden; vloeistof (bijvoorbeeldwater, media, PBS) of lucht. Vanwege het verschil in brekingsindex voor licht door de lucht en door vloeistof, moet de spiegelknop mogelijk worden aangepast. De maximale buiggevoeligheid van de AFM cantilever zal zich op de locatie van de AFM-tip bevinden, daarom moet het laserlicht, dat de buigpositie via de plaatsing op een fotodiode terugstuurt, zich op de locatie van de AFM-tip bevinden. Afhankelijk van de gekozen AFM-tip kan de somsignaalwaarde variëren van 0,3 – 3,0 V. Een backside coating op de AFM cantilever zoals Cr-Au of Al verhoogt het somsignaal en de gevoeligheid van de meting.

Tip geometrie is relevant bij het invullen van tip kalibratie tijdens AFM operatie. Er is een goede overeenkomst waargenomen tussen contactloos contact en contactkalibratie. Als de gekozen AFM cantilever niet rechthoekig is, moet contactkalibratie worden uitgevoerd. Houd er rekening mee dat het medium waarin de tip is gekalibreerd, hetzelfde moet zijn als het monstermedium. Als deze vloeistoffen verschillen, moet de gebruiker opnieuw kalibreren. Bij het gebruik van de AFM-tips in vloeistof moet de door het systeem gemeten frequentie een vierde tot een derde zijn van die van de natuurlijke resonantiefrequentie die door de fabrikant wordt aangeduid. Een goede manier om te controleren of het systeem de tip correct heeft gekalibreerd, is door waarden in het gegenereerde thermische ruisbestand te verifiëren. Zorg ervoor dat dit bestand wordt opgeslagen in de juiste map. Als het systeem problemen heeft met het kalibreren of niet-waarschijnlijke waarden naar buiten komen, opnieuw kalibreren of de laserpositie iets aanpassen, dan opnieuw kalibreren.

Een andere oorzaak van slechte som signaal kan te wijten zijn aan AFM cantilever uitlijning. Wanneer de AFM-chip in het glazen blok is gemonteerd, is het essentieel dat de punt van de cantilever binnen het kleine laservenster (glad glasgebied) blijft. Als de chip te ver naar voren is, kan de hoek waarin de cantilever op natuurlijke wijze rust een probleem veroorzaken met de reflectie van de cantilever, waardoor de fotodetector ontbreekt en resulteert in een slecht somsignaal. Als de chip te ver terug is, zal de laser niet in staat zijn om weer te geven uit de achterkant van de cantilever, waardoor een slechte som signaal. Om deze redenen moet de gemonteerde AFM-chip mogelijk worden aangepast. Bovendien treedt een ander probleem op dat kan worden aangetroffen met de hoogte van het monster. Het AFM-instrument dat in dit protocol wordt gebruikt, heeft een maximaal piëzo z-bereik (hoogte) van 15 μm. Als een gebruiker constateert dat de software niet in staat is om de hoogtegegevens te verzamelen en kaarten in een bepaalde pixel te forceren, verschijnt er een zwarte doos die aangeeft dat het systeem buiten bereik is(figuur 2C). Een manier om problemen te schieten dit probleem is om de piëzo hoogte in te stellen op een lagere waarde, zoals 2 of 3 μm, zodat het grootste deel van de 15 μm bereik is toegewijd aan het in kaart brengen van de verwachte hoogte van de cel. Deze techniek moet, in de meeste cel- of bacteriën-gerelateerde experimenten, het probleem in verband met het z-bereik vast te stellen.

Experimentalisten die een uitgebreid z-bereik nodig hebben voor hoge monsters met een hoogte van meer dan 10 – 15 μm, moeten mogelijk een extra module op de AFM volgen. AFM fabrikanten hebben deze optie beschikbaar tegen extra kosten voor de meeste systemen. Door de uitbreiding van het z-bereik, de experimentalist heeft de beschikbaarheid om monsters die worden beschouwd als hoog op de micro-schaal met weinig problemen voor buiten het bereik waarden of AFM piëzo motor modificatie te scannen. Hoewel deze modules extra kosten, kunnen sommige, afhankelijk van de fabrikant, extra hoogte bieden, tot 100 μm in de z-richting. Confocale is nog steeds mogelijk met langere monsters als de gebruiker heeft een lange werkafstand, hoge vergroting doelstelling of is bereid om een lucht doelstelling te gebruiken, misschien een 20x of 40x. Door het verlagen van microscoop objectieve vergroting, de werkafstand toeneemt, het verkrijgen van afstand om de top van een groter monster te bekijken. Deze wijziging van een lagere vergrotingsdoelstelling zal de resolutie opofferen. In de Conpokal-opstelling waarnaar in dit manuscript wordt verwezen, heeft de 60x TIRF (totale interne reflectie fluorescentie) doelstelling een werkafstand van bijna 100 μm voorbij de coverslip van de monsterschotel met glazen bodem.

Met betrekking tot de confocale microscoop waarnaar in dit manuscript wordt verwezen, worden enkele belangrijke bepalingen besproken. Het confocale systeem dat wordt gebruikt voor de productie van de figuren in dit manuscript voerde een 60x TIRF-oliedoelstelling uit met een numeriek diafragma van 1,49. Laserlijnen op 405 nm, 488 nm en 561 nm excitatiegolflengten werden gebruikt voor live celmonster beeldvorming, weergegeven in figuur 3 en figuur 4. De diffractielimiet van de confocale microscoop kan worden bepaald met behulp van de Abbe Resolution-vergelijking, Abbe Resolution(x,y) = λ/2NA, waarbij λ de excitatiegolflengte is voor Alexa 488, op 488 nm, en NA is het numerieke diafragma voor de confocale condensor, die 0,3 is. Daarom wordt een axiale resolutie van 272 nm bepaald. Voor beeldvorming van epifluorescentie worden twee gevallen beschouwd om de resolutie te bepalen waarbij het gaatje is ingesteld op één luchtige eenheid (AU) en 0,5 AU. In het laatste geval wordt het gaatje zodanig gesloten dat er aanzienlijk lichtverlies optreedt, maar neemt de resolutie toe. De confocale software berekent laterale native en axiale native resoluties op 170 nm en 290 nm voor het gaatje bij respectievelijk 0,5 AU en 200 nm en 370 nm voor het gaatje bij 1 AU. Sferische afwijkingen geïntroduceerd in het systeem kan worden verantwoord door middel van een deconvolutie proces om contrast en resolutie in microscoop beelden te verhogen. Vanwege de diffractiebeperkingen die inherent zijn aan confocale microscopen, mist het confocale beeld van de bacteriekolonie in figuur 6 de bijpassende resolutie voor de details van de AFM-scan van bacteriën in figuur 5. De AFM biedt toegang tot nanoschaalfuncties en details die moeilijk te vangen zijn met een confocale microscoop. Afhankelijk van de vereiste fluorescentieresolutie tonen figuur 5 en figuur 6 echter de toepasbaarheid van de Conpokal-techniek op microben naast eukaryotische cellen.

Een voordeel van het gebruik van een confocale microscoop stelt de operator in staat om 3D-beelden van specifieke regio's te verzamelen in een monster met geslepen detail. Deze beelden correleren met de AFM door het oppervlak te bekijken dat via het AFM-beeld en een confocale scan van hetzelfde gebied werd onderzocht. Aangezien de microscoop omgekeerd is, verzamelt een epifluorescentiebeeld lichtinformatie van de andere kant van het monster dat werd onderzocht. Het gaatje binnen het confocale systeem helpt beperken tot een enkel vlak van een bepaalde afstand, terwijl het filteren van licht dat afkomstig is van de rest van het monster of zelfs de kamer. In wezen helpt het gaatje het licht dat terugkomt van het enkele vlak van belang in het monster te isoleren. Typisch, dit vlak van belang moet sterke fluorofoforie markers bevatten, omdat, voor omgekeerde confocale systemen, single molecule detectie zou worden beperkt tot een hogere resolutie confocale microscopen. Epifluorescentie verlichting is minder wenselijk te wijten aan het feit dat in epifluorescentie imaging modus, elk licht van het monster dat wordt weerspiegeld in het doel wordt verzameld en gebruikt om het beeld te genereren, dus onmogelijk om een enkel vlak te isoleren. Confocale technieken bieden een meer geïsoleerde enkelvlak beeld van de steekproef functie in kwestie als gevolg van het gaatje⁷⁷. Als bijvoorbeeld de top van een eukaryotische cel wordt onderzocht door de AFM, kan datzelfde oppervlak worden geïsoleerd met de laserscanning van confocale mogelijkheden van de microscoop, in plaats van met de beeldvormingsmodus van epifluorescentie. Het wordt aanbevolen om de gezondheid/vorm van de cellen tijdens gegevensverwerving te controleren via beeldvorming gelijktijdig in differentiële interferentiecontrastmodus met behulp van de overgebrachte lichtdetector en de 488 nm laserlijn. Bij het vastleggen van een z-stack van het monster, voor de hierboven beschreven procedure, wordt alleen de versterking van de detector aangepast. Elke morfologische verandering in de cellen tijdens de meting, die niet noodzakelijkerwijs zichtbaar is in de tl-kanalen, geeft aan dat artefacten in de meting worden geïntroduceerd.

Ideale afstand tussen vliegtuigen kan worden verkregen door het volgen van de software aanbeveling voor de kortste golflengte gebruikt in de beeldvorming techniek. De native resolutie en de signaal-ruisverhouding in de beeldvolumes kunnen effectief worden verbeterd door gebruik te maken van deconvolution-algoritmen die beschikbaar zijn in de beeldverwerkingsmodule van de acquisitiesoftware. Echter, het uitvoeren van fluorescerende microscopie, selectie van specifieke vlekken en kleurstoffen is van vitaal belang om te voorkomen dat vroeg op de set bleken of crosstalk van overlappende excitatie / emissie spectra. Af en toe kan een gebruiker een storing ervaren in confocale lichtgeneratie. Als een gebruiker een gebrek aan lichtemissie of defecte laserlijnen ervaart, is een manier om problemen op te lossen het systeem opnieuw in te stellen, meestal door de besturingssysteem opnieuw op te starten. Als het probleem zich aanhoudt, kan de overgebrachte lichtdetector niet zijn in of uit de plaats binnen het optische pad van de lichtmicroscoop. Het resetten van de positie van de zenderdetector kan helpen om problemen met het verzamelen van licht of laservorming te verlichten.

De focus van het Conpokal-instrument ligt op het bieden van de mogelijkheid om optische en op kracht gebaseerde informatie over levende biomaterialen in een vloeibare omgeving te verzamelen, gelijktijdig en op dezelfde cel of functie. Dit werk beschrijft expliciet hoe deze experimenten uit te voeren in vloeistof, een natuurlijke thuisbasis voor veel biomaterialen, hoewel, droge experimenten kunnen nog steeds worden uitgevoerd met behulp van de instrumentatie. Met monsters bereid in petrischaaltjes, de schotel hoogte is een beperking. Door de configuratie van het glazen blok dat de AFM cantilever vasthoudt, moeten de zijwanden van de schotels minder dan 10 mm hoog zijn; als de schotel te hoog is, kan het instrument de AFM-tip niet naar het oppervlak van het monster of het substraat laten zakken.

Hoewel er een beperking is voor de grootte van de steekproef, is er geen beperking met het instrument of de softwaremogelijkheden met betrekking tot een vertraging. Gelijktijdig confocale en AFM is mogelijk met de juiste factoren op zijn plaats. De beperking die bijdraagt aan de bijna gelijktijdige capaciteit verwijst naar het geluid dat wordt gegenereerd bij het uitvoeren van bepaalde confocale microscopie functies en atomaire kracht microscopie functies tegelijkertijd. De trillingen van de motoren die de microscoopdoelstelling tijdens het verzamelen van een z-stack bewegen, worden tijdens de beweging aan het signaal van de AFM-sondepunt toegevoegd. Het geluid zal worden versterkt door een oliedoelstelling, terwijl de motoren op en neer bewegen in de z-richting om sequentiële vlakken in het monster te verlichten. Daarom omvat het aanbevolen protocol sequentiële verzameling AFM-scans en confocale z-stackafbeeldingen. Gelijktijdige CLSM en AFM zou vereisen stationaire beeldvorming met de confocale, maar met de huidige techniek, de vertraging tijd voor de twee instrumenten zou kunnen worden zo kort als tientallen seconden. De werkelijke tijd om over te schakelen van AFM-operatie naar confocale beeldvorming was ongeveer 2 – 4 minuten voor de beelden verzameld in figuur 2A en figuur 4B. Deze waarde werd bepaald door de twee perioden van het verzamelen van afbeeldingen af te trekken van de totale tijd van 33 minuten, waaronder de tijd om de AFM-scan te beginnen en te voltooien, om van instrumentmodus te wisselen om confocale beeldvorming te activeren en de confocale image z-stack te starten en te voltooien.

De toekomst van Conpokal is gericht op het verkennen van nieuwe structuur-functie relaties in aanvulling op scherp inzicht in eencellige processen. Bijvoorbeeld, experimenten van in situ medicamenteuze behandelingen op cel- of bacteriële monsters om de effecten van celelasticiteit te bepalen, zou een vooruitgang zijn op het gebied van biomaterialen, biologie en biomechanica. Behandeling therapie in het monster schotel terwijl imaging en indringende zou kennis van hoe het monster reageert op therapeutica in een levende en zorgvuldig gecontroleerde omgeving, na verloop van tijd. Het opnemen van een nieuwe drug of milieu uitdaging zou verbreden het begrip van hoe de cytoskeleton of organelle locatie beïnvloedt bewegingsvrijheid, topologie, stijfheid, enz. Een andere potentiële vooruitgang van Conpokal is de mogelijkheid om volledige milieucontrole van het systeem te hebben. De huidige Conpokal vermeld in dit protocol is gehuisvest binnenkant van een akoestische behuizing ontworpen om lawaai te verminderen van binnenuit het laboratorium. Vooruitgang van deze behuizing zou de mogelijkheid bieden om te testen binnen, misschien, een of een combinatie van factoren, niet beperkt tot die zoals een steriele omgeving, temperatuur-gecontroleerde, of zelfs variabele-zwaartekracht. Zoals het er nu uitziet, biedt de Conpokal-methode een effectieve en nuttige aanpak om levende, in-liquide biomaterialen te karakteriseren, maar de toekomst van de techniek zal deze mogelijkheden alleen maar verder bevorderen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acoustic Enclosure	JPK-Bruker	Acoustic Enclosure	Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Millipore Sigma	SCT142	Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips	NanoAndMore	CP-qp-CONT-BSG-B	Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	ThermoFischer Scientific	D282	Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium	VWR	VWRL0100-0500	Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285601	Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum	Fischer Scientific	45000-736	Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract	Fischer Scientific	BP1422-500	Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish	World Precision Instruments (WPI)	FD35-100	Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain	ThermoFischer Scientific	62249	Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC Global Bioresource Center	CRL-1573	Mammalian cells used in protocol
Matrigel	VWR	47743-716	Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips	Bruker	PFQNM-LC-A-CAL	AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a	JPK-Bruker	NanoWizard 4a	AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	A1 HD25	Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN	VWR	16777-164	Component of cell culture media
PetriDishHeater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips	Nanosensors	qp-BioAC-Cl-10	Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers	Ted Pella Inc.	5051	Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto	BD DIFCO Bacterius Ltd	Bacto-249240	Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate	Thermo Fisher Scientific	V34850	Used to fluorescently label bacterial cell wall