Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie. In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doelproteïnen met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM). SIM is een patroon-licht verlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van breed-veld microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nm. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.
Inleiding
Het begrip en de mening van de synaps is enorm veranderd sinds de eerste beschrijving door Foster en Sherrington in 18971. Sindsdien is onze kennis van neuronale communicatie en de moleculaire processen erachter exponentieel gegroeid2. Het is duidelijk geworden dat synapsen kunnen worden gezien als een systeem met twee compartimenten: een pre-synaptisch compartiment met vesikels voor het vrijkomen van neurotransmitters en een post-synaptisch compartiment met receptoren3. Deze simplistische visie, in de afgelopen twintig jaar, is uitgegroeid tot een complex netwerk van de eiwitten die nodig zijn om....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Primaire culturen
- Cultuur muis hippocampal primaire neuronen in chambered coverslips (zoals Ibidi μ-Slide 8 Well of Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) die overeenkomen met de objectieve eis voor #1,5 (0,17 mm) coverslip dikte.
- Coat chambered coverslips met 100 μL poly-L-lysine (100 μg/mL).
- De volgende dag was je de chambered coverslips twee maal met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Om muis primaire neuronen te verkrijgen, isoleren hippocampi van P1-P4 pups23.
- Plaats ontleed hippocampi in 10 mL dissectie media (Tabel 1) en laat ze storten aan de onderkant van de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We presenteren hier de standaard workflow om neuronale eiwitten co-lokalisatie te bestuderen. We kalibreerden eerst de microscoop en vervolgens voerden we SIM-analyse van de monsters uit. Om het systeem te kalibreren, gebruikten we fluorescerende microsferen met een diameter van 0,1 μm. Bij het verkrijgen van super-opgeloste 3D-SIM beelden van de kralen, de onderliggende beeldgegevens zijn Fourier-getransformeerd om ze opnieuw om te zetten in een ruimtelijke frequentie representatie. In figuur 2A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in de normale staat, synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze ook ten grondslag liggen aan complexe neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer32. Het hier beschreven protocol dient om de colokalisatie van neuronale eiwitten te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie genaamd S.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Edoardo Micotti bedanken voor de opbouwende kritiek op het manuscript. Deze studie werd ondersteund door BrightFocus A2019296F, door Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), door Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) en door het Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (JK).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.4% Trypan blue oplossing | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemisch |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Uitgeruste |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antilichaam |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antilichaam |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemisch |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemisch |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemisch |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Uitgeruste |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antilichaam |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylaat-gemodificeerde microspheres, 0.1 μm, geel-groen fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Uitgeruste |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemisch |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemisch |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemisch |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemisch |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antilichaam |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemisch |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemisch |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolutie Microscoop | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemisch |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemisch |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemisch |
| fosfaat-gebufferde saline | Gibco | 10010023 | Chemisch |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemisch |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemisch |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antilichaam |
| Ronde dekglas | Thermo | 12052712 | Uitgeruste |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antilichaam |
| Synaptophysine | Merck | S5768 | Antilichaam |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemisch |
| Trypsine-inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemisch |
Referenties
- Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
