Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Injectie van Hydrogel Biomaterial Steigers naar de hersenen na een beroerte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemische beroertes en worden gedefinieerd als de plotselinge verstopping van een vat dat bloed naar de hersenen levert. Binnen enkele minuten na de blokkade beginnen cellen af te sterven en resulteren in onherstelbare weefselschade. De huidige therapeutische behandelingen richten zich op het verwijderen van stolsels of lysis om de reperfusie mogelijk te maken en ernstiger hersenletsel te voorkomen. Hoewel voorbijgaande hersenplasticiteit een deel van het beschadigde weefsel in de loop van de tijd kan redden, blijven aanzienlijke fracties van patiënten achter met neurologische tekorten die nooit zullen verdwijnen. Er is een gebrek aan therapeutische opties om neurologische tekorten veroorzaakt door een beroerte te behandelen, met de nadruk op de noodzaak om nieuwe strategieën te ontwikkelen om deze groeiende patiëntenpopulatie te behandelen. Injecteerbare biomaterialen worden momenteel ontworpen om de plasticiteit van de hersenen te verbeteren en het endogene herstel te verbeteren door de afgifte van actieve stoffen of stamcellen. Een methode om deze benaderingen te testen, is door een knaagdierslagmodel te gebruiken, het biomateriaal in de beroertekern te injecteren en de reparatie te beoordelen. Het kennen van de exacte locatie van de beroertekern is noodzakelijk voor de nauwkeurige behandeling na een beroerte, daarom heeft een beroertemodel dat resulteert in een voorspelbare beroertelocatie de voorkeur om de noodzaak van beeldvorming voorafgaand aan injectie te voorkomen. Het volgende protocol behandelt hoe een fototrombotische beroerte kan worden geïnduceerd, hoe een hydrogel op een gecontroleerde en nauwkeurige manier kan worden geïnjecteerd en hoe de hersenen kunnen worden geëxtraheerd en gecryopteerd terwijl het biomateriaal intact blijft. Daarnaast zullen we belichten hoe dezelfde hydrogelmaterialen kunnen worden gebruikt voor de co-afgifte van stamcellen. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar het gebruik van andere injecteerbare biomaterialen in de slagkern.
Inleiding
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemisch, terwijl een meerderheid van de resterende 13% hemorragisch is2. Een ischemische beroerte wordt gedefinieerd als de blokkering van de bloedstroom in een slagader naar het omliggende weefsel. Deze occlusie resulteert in zuurstofgebrek en daaropvolgende necrose die vaak leidt tot permanente invaliditeit bij overlevende patiënten. Hoewel er een daling is geweest in het sterftecijfer van beroerte3,zal de prevalentie ervan naar verwachtin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met IUCAC aan de Duke University en de University of California Los Angeles. 8 tot 12 weken oude mannelijke C57Bl / 6J-muizen werden gebruikt in deze studie. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C), met een licht-donkercyclusperiode van 12 uur en toegang tot gepelletiseerd voedsel en water ad libitum. Analgesie- en sedatieprotocollen worden beschreven als goedgekeurd door de IUCAC, maar kunnen verschillen van protocollen die in andere laboratoria worden gebruikt.
Dieren kunnen voortijdig worden geëuthanaseerd als ze overmatige rusteloosheid, vocalisatie (w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het doel van deze methode was om aan te tonen hoe biomaterialen in de hersenen kunnen worden geïnjecteerd na een beroerte. Een fototrombotisch model met rose bengal en een 520 nm laser werd gebruikt voor een gecontroleerde oriëntatie van de beroerte laesie in zowel grootte als locatie. Vijf dagen na een beroerte kon het infarct worden gevisualiseerd tijdens de operatie(figuur 1B)en door TTC en beeldvorming van IHC-gekleurde dia's(figuur 2). Een toename van de la.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier demonstreren we een gemakkelijk reproduceerbaar, minimaal invasief, permanent beroertemodel en beschrijven we hoe een biomateriaal vijf dagen na de beroerte in het infarct kan worden geïnjecteerd. Het gebruik van de fototrombotische kleurstof Rose Bengal en een 520 nm gecollimeerde laser verbonden met het stereotaxische apparaat geeft ons de mogelijkheid om de slag op de motorische cortex van de muis met verbeterde precisie te positioneren. Vijf dagen na de beroerte is de locatie van het infarct met het oog zichtbaa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat TS een van de oprichters is van Tempo Therapeutics, dat MAP-hydrogels wil commercialiseren.
Dankbetuigingen
We erkennen graag de National Institutes of Health en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke voor financiering (R01NS079691).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | Voor blokkeringsbuffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Spuiten gebruikt om biomaterialen te injecteren |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laserstraaluitbreider |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | Voor perfusies |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | Om alles te bedekken dat reflecteert bij het gebruik van laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weken oud |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Lang, diameter 6mm, 4 pack - voor het bevestigen van laser aan sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | Voor het maken van een boorgat |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Montageoplossing voor dia's |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | Voor gelatine coating van dia's |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | Voor het maken van 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Nodig voor het opzetten van de laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Nodig voor het verbinden van laser met Kopf-as |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Voor het kleuren van dia's |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Bruine lenzen, 35% zichtbaar licht (ook versies van googles beschikbaar) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pomp voor perfusies |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | Voor TTC-sneden |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Aansluiten op stereotaxisch apparaat voor het injecteren van biomateriaal |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Gebruikt om uw mW laseruitvoer te meten |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | Voor het aansluiten van laser op stereotaxisch apparaat |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Gebruikt met power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | Voor het aansluiten van laseruitbreider |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | Om rose bengal te injecteren |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | Voor het kleuren van dia's |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 |
Referenties
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke stati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
