Methodenartikel

Geoptimaliseerde DNA-extractie van hoge kwaliteit uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde menselijke atherosclerotische laesies

DOI:

10.3791/61452

⸱

12 februari 2021

 ,  , 
1Department for Vascular and Endovascular Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technical University Munich, 2partner site Munich Heart Alliance, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung (DZHK), 3Department of Vascular Surgery, University Hospital Zurich, 4Department of Experimental Cardiology, German Heart Centre, Technical University Munich

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor semi-geautomatiseerde DNA-extractie uit formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde laesies van menselijke halsslagaders. De weefsellysis wordt uitgevoerd zonder giftig xyleen, gevolgd door een geautomatiseerd DNA-extractieprotocol, inclusief een tweede lysisstap, binding van DNA aan paramagnetische deeltjes voor binding op basis van cellulose, wasstappen en DNA-elutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels vormen een waardevolle bron voor moleculaire analyses en klinische genomische studies. Deze weefsels zijn vaak arm aan cellen of moeilijk te verwerken. Daarom moeten nucleïnezuren zorgvuldig worden geïsoleerd. In de afgelopen jaren zijn er verschillende methoden voor DNA-isolatie ontwikkeld voor weefsels van vele ziekten, meestal kanker. Helaas wordt genomisch DNA dat uit FFPE-weefsels wordt geëxtraheerd, sterk afgebroken als gevolg van de verknoping tussen nucleïnezuurstrengen en eiwitten, evenals willekeurige breuken in de sequentie. Daarom is de DNA-kwaliteit van deze monsters aanzienlijk verminderd, waardoor het een uitdaging wordt voor verdere moleculaire stroomafwaartse analyses. Andere problemen met moeilijke weefsels zijn bijvoorbeeld het ontbreken van cellen in verkalkte menselijke atherosclerotische laesies en vetweefsel, kleine huidbiopsieën, en als gevolg daarvan een lage beschikbaarheid van de gewenste nucleïnezuren zoals ook het geval is in oude of gefixeerde weefsels.

In onze laboratoria hebben we een methode ontwikkeld voor DNA-extractie uit formaline-gefixeerde atherosclerotische laesies, met behulp van een semi-geautomatiseerd isolatiesysteem. We vergeleken deze methode met andere in de handel verkrijgbare extractieprotocollen en richtten ons op verdere downstream-analyses. De zuiverheid en concentratie van het DNA werden gemeten door middel van spectrometrie en fluorometrie. De mate van fragmentatie en de algehele kwaliteit werden beoordeeld.

De hoogste DNA-kwantiteit en -kwaliteit werd verkregen met het gemodificeerde bloed-DNA-protocol voor het geautomatiseerde extractiesysteem, in plaats van het commerciële FFPE-protocol. Met dit stapsgewijze protocol waren de DNA-opbrengsten van FFPE-monsters gemiddeld vier keer hoger en faalden minder exemplaren niet voor het extractieproces, wat van cruciaal belang is bij het omgaan met biopsieën van kleine vaten. Amplicongroottes van 200-800 bp konden worden gedetecteerd door PCR. Deze studie toont aan dat hoewel DNA verkregen uit ons FFPE-weefsel sterk gefragmenteerd is, het nog steeds kan worden gebruikt voor succesvolle amplificatie en sequencing van kortere producten. Concluderend, in onze handen lijkt de geautomatiseerde technologie het beste systeem voor DNA-extractie, vooral voor kleine FFPE-weefselmonsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formalinefixatie gevolgd door paraffine-inbedding (FFPE) is een standaardprocedure voor het langdurig bewaren van pathologische monsters in biobanking1. Deze monsters vormen een waardevolle bron voor histologische studies en moleculaire analyses, met name genetische studies2. Verdere voordelen van FFPE-tissues zijn een betere langdurige opslag, lagere kosten en eenvoudigere bewaarcondities. Onze bedoeling hier is om een betrouwbaar en gebruiksvriendelijk protocol te bieden voor reproduceerbare nucleïnezuurisolatie uit kleine hoeveelheden FFPE-secties, aangezien DNA-extractie van hoge kwaliteit de eerste cruciale stap is in een breed scala aan moleculaire technieken en FFPE-weefsels de meest beschikbare bron van monsters zijn.

Nieuwe wetenschappelijke benaderingen, zoals next-generation sequencing (NGS) en "omics" onderzoeksbenaderingen, vereisen een hoge kwaliteit van nucleïnezuren 3,4,5. Het extraheren van DNA uit FFPE-weefselmonsters blijft een uitdagende onderneming. DNA uit FFPE-monsters kan sterk variëren in kwaliteit en kwantiteit, afhankelijk van de leeftijd en fixatieomstandigheden. Formaline, de meest gebruikte verbinding, leidt tot DNA-eiwitverknoping 6,7,8 en veroorzaakt niet-specifieke willekeurige breuk in de nucleotidesequentie9. Dit kan een aanzienlijke invloed hebben op downstream genomische analyses, aangezien verknoping de amplificatie van de polymerasekettingreactie (PCR) kan uitschakelen 6,10. Vanwege verontreinigingen tijdens het fixatieproces is de zuiverheid van het DNA dat uit FFPE-monsters is geïsoleerd vaak beperkt. In de afgelopen jaren zijn er verschillende methoden voor DNA-isolatie ontwikkeld, meestal uit kankerweefselmonsters 2,11,12,13.

Over het algemeen kunnen protocollen voor de extractie van nucleïnezuren uit FFPE-weefsel worden onderscheiden in drie hoofdgroepen. De eerste, meest gebruikte groep methoden omvat in de handel verkrijgbare kolomsystemen op basis van silica14. De tweede groep omvat handmatige extractiemethoden in de organische fase met fenol en chloroform, voor het eerst beschreven door Joseph Sambrook en David W. Russell15. Als derde groep zijn de afgelopen jaren geautomatiseerde systemen opgezet, zoals systemen voor de behandeling van vloeistoffen en systemen op basis van paramagnetische deeltjes16. Elk van de drie genoemde systemen heeft verschillende voor- en nadelen, zoals gevaarlijke chemicaliën (d.w.z. xyleen, fenol, chloroform), hoge kosten17, mankracht18 en tijdsbesteding19. Vooral voor het moeilijke weefselmonster en analyses met een hoge doorvoer zijn standaardisatie, reproduceerbaarheid, relatief lage tijdsconsumptie, mankracht en kosten de meest relevante kenmerken bij het vinden van een geschikte methode voor nucleïnezuurisolatie20. Van geautomatiseerde extractiemethoden is bekend dat ze beter reproduceerbare resultaten opleveren en gevoeliger zijn voor kleine biopsieën. Bovendien is er minder weefsel of bloed nodig en wordt het risico op verstopping van het systeem door grote hoeveelheden paraffine verkleind. Hoewel machines voor geautomatiseerde nucleïnezuurextractie en de benodigde kits duurder zijn in vergelijking met handmatige methoden, zijn ze nog steeds overtuigend vanwege minder problematische extractieprocessen. Literatuuronderzoek levert veel publicaties op die een directe vergelijking illustreren tussen handmatige, kolomgebaseerde en geautomatiseerde DNA- en RNA-extractiemethoden uit verschillende weefsels en organismen, zoals planten, dieren en mensen, evenals cellen in cultuur 20,21,22. Er zijn ook bewijzen aanwezig in de literatuur om aan te tonen dat DNA en RNA geïsoleerd uit 10 jaar oud ingevroren weefsel kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyses zoals PCR, kwantitatieve PCR, NGS, methylatieanalyses en klonen 9,23,24,25,26.

Het grootste probleem met bijvoorbeeld verouderd menselijk vaatweefsel, evenals kleine weefselbiopsieën, vooral met betrekking tot FFPE-monsters, is het gebrek aan cellen in de sterk verkalkte atherosclerotische laesies, wat bijgevolg leidt tot lage concentraties nucleïnezuren1. Hoewel er al verschillende methoden voor DNA-extractie uit FFPE-weefsel zijn vastgesteld en veel worden gebruikt, vereisen de handmatige monstervoorbereidingsmethoden een lange hands-on tijd27 en zijn toxische reagentia zoals xyleen of fenol nodig voor deparaffinisatie2. Zoals beschreven is het deparaffinisatieproces een cruciale tijdrovende stap (bijv. ongeveer 30 minuten) die een aanzienlijke invloed heeft op de kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde DNA (bijv. toxische effecten op DNA, zoals fragmentatie en degradatie van deparaffinisatieoplossing en hoge temperaturen)28. Recent ontwikkelde nieuwe DNA-extractieprotocollen richten zich op het gebruik van andere niet-toxische deparaffinisatieoplossingen, reparatiestrategieën en geautomatiseerde kralentechnologieën. In het bijzonder is aangetoond dat geautomatiseerde en semi-geautomatiseerde methoden succesvol zijn bij DNA-extractie met efficiënt herstel, gebrek aan kruisbesmetting en gemakkelijke prestaties29. We hebben een protocol opgesteld dat deze beperkingen overwint. Als gevolg hiervan maakt onze techniek een vermindering van de verwerkings- en hands-on tijd mogelijk tegen de hoogste kwantitatieve en kwalitatieve normen.

Vooral voor reproduceerbare high-throughput analyses zoals genotypering, epigenomische studies en RNA-sequencing is de behandeling van FFPE-monsters met kolomgebaseerde zuiveringssystemen vaak moeilijk en tijdrovend (bijv. lange deparaffinisatiestappen, verstopping van de kolom en lange hands-on tijden). Verstopping van de silicamembranen door de hoge hoeveelheid paraffine is het grootste probleem. Andere omstandigheden die de isolatie van hoogwaardige nucleïnezuren kunnen verslechteren, zijn kleine hoeveelheden weefsel zoals microbiopten van de huid, klein muizenweefsel, zeer vet of verkalkt weefsel zoals plaques, verbente weefsels en verouderde monsters. Vooral op het gebied van diagnose en forensisch onderzoek zijn geautomatiseerde en semi-geautomatiseerde systemen zoals vloeistofbehandeling of extractiemethoden op basis van paramagnetische deeltjes de afgelopen jaren steeds belangrijker geworden30,31, voornamelijk vanwege de relatief korte hands-on tijden en de mogelijkheid van standaardisatie. De meeste van de reeds gepubliceerde protocollen werken perfect voor gladde weefsels met hoge of gemiddelde hoeveelheden cellen, zoals tumorbiopten of plantenweefsels 13,22,32. Literatuur over methoden voor semi-geautomatiseerde op deeltjes gebaseerde methoden die worden gebruikt voor het isoleren van DNA uit relatief moeilijk te hanteren weefsel, zoals gefixeerde afzonderlijke cellen, verkalkte vaten, collageenrijk weefsel en vetweefsel met een laag aantal cellen, is slechts slecht beschreven33.

In deze studie wordt een geoptimaliseerde semi-geautomatiseerde methode voor DNA-isolatie van vasculaire paraffine ingebedde secties beschreven, vergeleken met twee handmatige kolomgebaseerde protocollen. Voor validatie werden de kwantiteit, zuiverheid en mate van fragmentatie van DNA gebruikt. Het in de handel verkrijgbare bloed-DNA-protocol werd als uitgangspunt gebruikt en de handmatige stappen van het semi-geautomatiseerde systeem werden vervolgens geoptimaliseerd voor het gebruik van FFPE en vers ingevroren weefselmonsters van menselijk en dierlijk weefsel, waarbij stappen uit het FFPE en het weefselprotocol werden gecombineerd. De geautomatiseerde stap van dit protocol is vooraf geïnstalleerd op het instrument en is afhankelijk van de gebruikte kit (hier de bloed-DNA-kit). Met het beschreven semi-geautomatiseerde cartridge-gebaseerde systeem is het mogelijk om DNA te isoleren uit bloed, vers ingevroren weefsel, formaline-gefixeerd weefsel en zelfs afzonderlijke cellen met hetzelfde protocol, dezelfde machine, dezelfde kit en verbruiksartikelen, in plaats van verschillende protocollen en kits voor het instrument te gebruiken, zoals aanbevolen door het bedrijf. Er zijn slechts kleine verschillen in de protocollen, zoals één buffer en enkele incubatietijden voor de verschillende toepassingen, wat dit protocol zeer bruikbaar maakt voor het extraheren van DNA uit allerlei soorten weefsels. Ons protocol is in de eerste plaats geoptimaliseerd voor verkalkt, arm aan cellen en vezelig menselijk vaatweefsel, maar kan uiteraard worden gebruikt en verder geoptimaliseerd voor alle soorten moeilijke weefsels die hierboven zijn genoemd.

Samengevat, voor onderzoekers op cardiovasculair gebied die werken aan atherosclerose (bijv. aorta, halsslagaders, kransslagaders) bieden we een gebruiksvriendelijk, puntsgewijs protocol voor semi-geautomatiseerde DNA-extractie uit vasculaire FFPE-monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toestemming om atherosclerotische monsters van menselijke halsslagaders te verzamelen in onze biobank werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie van het ziekenhuis (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, München, Duitsland). Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki.

1. Weefsel preparatie

  1. Bereid 5-8 weefselcoupes van 10 μm van het FFPE-monster voor met het microtoom en breng het over in een buisje van 1,5 ml. Het is niet nodig om de overmaat aan paraffine uit het blok te verminderen.
    OPMERKING: Dunnere afzonderlijke secties in plaats van één grote sectie versnellen de bufferreactie. Gooi de eerste secties weg vanwege de blootstelling aan O2 . Voor grotere monsters is het ook mogelijk om minder secties te gebruiken.
  2. Centrifugeer deze buisjes in een tafelcentrifuge, ingesteld op 5.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om elk monster op de bodem van de buis te verzamelen.
    LET OP: Te lang centrifugeren leidt tot stolling van het monster en bemoeilijkt de lysis.

2. Lipide oplossen en deparaffinisatie

OPMERKING: Deze stap is nodig voor deparaffinisatie en lipidenvertering. De gebruikte buffer is minder giftig dan commerciële deparaffinisatieoplossingen.

  1. Voeg 300 μL van de in de handel verkrijgbare incubatiebuffer en 6 μL 1-thioglycerol toe aan elk buisje.
    OPMERKING: Gebruik niet meer dan 300 μL, aangezien dit het maximale volume van de cartridge van het automatiseringssysteem is.
  2. Vortex gedurende 10 s en incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 80 °C en 500 tpm in een verwarmingsblok om paraffine op te lossen.
    LET OP: Het weefsel moet aan het einde volledig zijn opgelost. Indien nodig, vortex meerdere keren tijdens de incubatie.

3. Monster- en eiwitvertering

OPMERKING: Inheemse spijsvertering met protease K is cruciaal om schone DNA-extracten zonder eiwitten te hebben. Het vermindert ook de aanwezige vervuilende eiwitten. Bovendien worden nucleasen ook vernietigd om het DNA te redden34. Deze nachtelijke stap is ook nodig voor een volledige vertering van het monster.

  1. Laat het monster afkoelen tot 60 °C en voeg dan 30 μL van de meegeleverde proteïnase K-oplossing toe.
  2. Draai opnieuw en incubeer het mengsel een nacht (4-20 uur) bij 65 °C en 500 tpm in een verwarmingsblok. Draai de monsters tijdens de incubatie van tijd tot tijd voor een volledige vertering van het monster.
    OPMERKING: 's Nachts incubatie leidt tot betere resultaten. Mengstappen worden aanbevolen om de 30-60 minuten. Uiteindelijk mag er geen visueel weefselstukje in de buis zitten.

4. Cel lyse

  1. Voeg 400 μL van de lysisbuffer toe, meegeleverd in de bloedkit en vortex kort.
  2. Incubeer het monster opnieuw bij 65 °C gedurende 30 minuten met 500 tpm.
  3. Laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur. De paraffine zal aan de bovenkant uitharden.
    LET OP: Niet opnieuw wervelen om de paraffine gescheiden te houden van het monster. Anders wordt de paraffine gemengd met het weefsel, waardoor het monster wordt vernietigd. Het monster wordt verzameld in stap 6.1.

5. Voorbereiding van de voorgedoseerde cartridges

  1. Zet de machine en de bijbehorende tabletcomputer aan.
  2. Start de software-app en klik op de knop Deur om het instrument te openen.
  3. Verwijder het rek van het instrument en plaats de voorgevulde cartridge in het sonderek. Zorg ervoor dat de cartridge twee keer op zijn plaats klikt en verwijder de afdichtfolie.
  4. Voeg de zuiger toe in het laatste (8) putje van de cartridge. Het dient als pipetpunt in het instrument.
  5. Vul de meegeleverde elutiebuizen van 0.5 ml met 65 μL elutiebuffer, die bij de kit wordt geleverd. Laat de buisjes open en plaats ze in de daarvoor bestemde positie aan de voorkant van het rek, na de cartridge.
    OPMERKING: Het minimale volume voor elutie is 60 μL. Het systeem verliest 5-10 μL van het toegevoegde elutievolume.

6. Geautomatiseerde DNA-extractie

  1. Prik voorzichtig de paraffine bovenop de tube van 1.5 ml uit stap 4.3 om bij het schone monster op de bodem van de tube te komen zonder het opnieuw met paraffine te mengen.
  2. Breng het hele mengsel (730 μl) van het voorbereide monster over in het eerste putje van de patroon.
  3. Plaats het rek in de geautomatiseerde DNA-extractiemachine. Zorg ervoor dat het rek eerst aan de achterkant van de machine wordt vergrendeld en daarna aan de voorkant.
  4. Start de run door op de oranje Start-knop linksboven in de software te klikken. Er wordt een venster geopend met verschillende vooraf geïnstalleerde protocollen. Selecteer Bloed-DNA-protocol op het instrument. Controleer of de zuiger, elutiebuis en het monster zijn toegevoegd door in de software op ja te klikken. De deur van het instrument sluit automatisch en de run begint (het lampje wordt groen). De run duurt ongeveer 38 minuten. Er is geen verdere kalibratie nodig.
    OPMERKING: Let op totdat het systeem de plunjers voor alle monsters in het rek heeft opgepakt. Als dit niet gebeurt, stopt het systeem automatisch en moet het machineprotocol opnieuw worden opgestart.
  5. Zorg ervoor dat het systeem de geautomatiseerde lysisstap uitvoert in de eerste put van de cartridge, gevolgd door de wasstappen in de putjes 3 tot en met 7. Er is geen verdere programmeerstap nodig. Het volledige programma is vooraf geïnstalleerd door het bedrijf.
  6. Als u klaar bent, zorgt u ervoor dat het systeem het DNA in de voorbereide elutiebuisjes eluleert via de toegevoegde zuiger. De magnetische deeltjes blijven in de plunjer. De zuiger gaat aan het einde terug naar het laatste putje van de patroon.

7. Maak de run af

  1. Wanneer de run is voltooid (de machine toont een groen knipperend lampje), opent u het instrument door op de knop voor openen te klikken (deurbord) en verwijdert u het rek uit het systeem.
  2. Gooi de cartridges weg.
  3. Plaats het lege rek terug in het instrument en sluit de deur via de deurknop in de rechterbovenhoek. Sluit de software-app en schakel de machine uit, evenals de tabletcomputer.
  4. Bewaar eluaten bij -20 °C voor langdurige opslag of bij 4 °C voor kortstondige opslag of gebruik het direct voor downstream-analyse of concentratiemetingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het opstellen van het protocol werden 5 FFPE-weefselblokken gebruikt van patiënten met atherosclerose van de halsslagader. DNA werd geïsoleerd met een geoptimaliseerd semi-geautomatiseerd protocol (kit C) en met twee in de handel verkrijgbare handmatige kolomgebaseerde protocollen (kit A en kit B, zie materiaaltabel). DNA-extractie met kit A en B werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. De enige wijziging die werd aangebracht in het protocol van de twe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-extractiemethoden voor FFPE-weefsel variëren in kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerd DNA, wat onvermijdelijk van invloed is op de prestaties van verdere stroomafwaartse analyses. Automatisering wordt dus noodzakelijk om de workflow en standaardisatie te verbeteren, evenals het kwaliteitsbeheer. Daarom werd in de huidige studie een semi-geautomatiseerde methode voor DNA-extractie uit FFPE-monsters geëvalueerd die betere resultaten opleverde dan de andere geteste handmatige kolomgeba...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De totstandkoming van het protocol voor geautomatiseerde DNA-extractie werd ondersteund door Dr. Paul Muschler van het bedrijf Promega. Wij danken Paul Muschler voor zijn steun en wetenschappelijke bijdrage. We danken ook onze collega Dr. Moritz von Scheidt (Duits Hartcentrum München) voor het ter beschikking stellen van het Maxwell-instrument en voor het ondersteunen van het experimentele gedeelte. Alle experimenten werden uitgevoerd in de laboratoria van het Duitse Hartcentrum (München, Duitsland) en Klinikum rechts der Isar (München, Duitsland). Het onderzoek werd gefinancierd door DFG (PE 900/6-1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ml tubes for sample incubationEppendorf, Hamburg, Duitsland30120086
1-ThioglycerolPromega, Walldorf, DuitslandA208
Agilent tape station software 3.2Agilent, Waldbronn, Duitsland
dsDNA HS KitThermoFisher Scientific, Schwerte, DuitslandQ32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)Norgene Biotek, Heidelberg, Duitsland47400
FFPE tissue samples n=5Munich Vascular Biobank, München, Duitsland
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)Qiagen, Hilden, Duitsland180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°CVWR, Darmstadt, Duitsland460-0250
High Sensitivity D5000 reagentsAgilent, Waldbronn, Duitsland5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTapeAgilent, Waldbronn, Duitsland5067-5592
Incubation BufferPromega, Walldorf, DuitslandD920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase KPromega, Walldorf, DuitslandAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega, Walldorf, DuitslandAS8500
MicrocentrifugeEppendorf, Hamburg, Duitsland
NanoDrop 2000c SpectrometerThermoFisher Scientific, Schwerte, DuitslandND-2000C
Optical capsAgilent, Waldbronn, Duitsland401425
Optical tube stripsAgilent, Waldbronn, Duitsland401428
Pipettors and pipette tipsEppendorf, Hamburg, Duitsland
Prism 6 for statistics, version 6.01GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher Scientific, Schwerte, DuitslandQ33216
TapeStation 4200Agilent, Waldbronn, Duitsland
Tecan Infinite M200 ProTecan, Männedorf, ZwitserlandIN-MNANO

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52(2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455(2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17(2016).
  22. Harada, S. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , Springer. 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706(2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198(2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186(2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494(2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215(1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FFPE weefselgeautomatiseerde isolatieprotocol voor bloed DNADNA zuiveringDNA fragmentatiePCR amplificatiespectrometeranalysefluorometrische beoordeling
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen