Een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een geoptimaliseerd weefseldissociatieprotocol toe te passen op een muismodel van ruggenmergletsel en de aanpak voor eencellige analyse door stroomcytometrie te valideren.

Samenvatting

We beschrijven de implementatie van ruggenmergletsel bij muizen om detrusor-sluitspierdysynergie, een functionele obstructie van de blaasuitlaat en daaropvolgende herinrichting van de blaaswand uit te lokken. Om de beoordeling van de cellulaire samenstelling van de blaaswand bij niet-gewonde controle en ruggenmerggewonde muizen te vergemakkelijken, ontwikkelden we een geoptimaliseerd dissociatieprotocol dat een hoge levensvatbaarheid van de cel ondersteunt en de detectie van discrete subpopulaties door stroomcytometrie mogelijk maakt.

Dwarslaesie ontstaat door volledige transsectie van het thoracale ruggenmerg. Op het moment van weefseloogst wordt het dier doordrenkt met fosfaatgebufferde zoutoplossing onder diepe anesthesie en worden blaasjes geoogst in de buffer van Tyrode. Weefsels worden gehakt voorafgaand aan incubatie in de spijsverteringsbuffer die is geoptimaliseerd op basis van het collageengehalte van de muisblaas, zoals bepaald door ondervraging van openbaar beschikbare genexpressiedatabases. Na het genereren van een suspensie met één cel wordt materiaal geanalyseerd door stroomcytometrie voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, het celnummer en specifieke subpopulaties. We tonen aan dat de methode celpopulaties oplevert met een levensvatbaarheid van meer dan 90% en een robuuste weergave van cellen van mesenchymale en epitheeloorsprong. Deze methode maakt een nauwkeurige downstream-analyse van discrete celtypen in de muisblaas en mogelijk andere organen mogelijk.

Inleiding

Verstoringen van de normale urineblaasfunctie kunnen voor veel mensen leiden tot een verminderde kwaliteit van leven. Om een beter inzicht te krijgen in hoe letsel of ziekte de normale blaasfunctie ontspoort, is het belangrijk om de normale biologische toestand van cellen in de blaas te onderzoeken en hoe ze veranderen bij experimentele verstoring. Tot op heden zijn de specifieke celpopulaties die zich in de urineblaas bevinden en hoe ze veranderen met letsel, echter onvolledig gekarakteriseerd.

Eencellige profileringsmethoden zoals flowcytometrie of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) hebben het potentieel om licht te werpen op specifieke celtypen in de blaas. Om deze benaderingen informatief weefsel te laten zijn, moet echter worden verteerd op een manier die de levensvatbaarheid, genexpressie en representatieve celpopulatiepercentages van het geoogste weefsel niet beïnvloedt. Protocollen die enzymatische disaggregatie toepassen, kunnen de expressie van oppervlaktemarkers beïnvloeden door willekeurige proteaseactiviteit¹, waardoor de celidentificatie door stroomcytometrie wordt beïnvloed, terwijl het dissociatieproces zelf kan leiden tot de inductie van onmiddellijke vroege genen, zoals onlangs beschreven door Van den Brink en collega's². De auteurs toonden aan dat hoewel de door dissociatie aangetaste subpopulatie klein was, het een sterk vervuilend signaal kon veroorzaken in bulkexpressiestudies vanwege de hoge expressieniveaus van onmiddellijke vroege genen. Bovendien, de duur van de dissociatie protocol beïnvloed gedetecteerd bulk expressie niveaus van genen aangetoond dat uniek zijn voor sommige subpopulaties. Zo kunnen gegevenssets met één cel die worden gegenereerd zonder rekening te houden met de impact van het dissociatieprotocol genexpressieveranderingen opleveren die voortvloeien uit de dissociatiemethode, in tegenstelling tot de onderliggende biologie. Deze observaties suggereren dat gepubliceerde transcriptomics-gegevens met één cel met voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd en dat de resultaten met onafhankelijke methoden moeten worden gevalideerd.

Hoewel harde en langdurige dissociatiemethoden de genexpressie in cellen²kunnen veranderen ; effectieve isolatie van cellen is essentieel om een nauwkeurige weergave van de aanwezige celtypen te verkrijgen. Aangezien de blaas een complex orgaan is dat uit meerdere celtypen bestaat, kunnen sommige populaties zoals urotheliale of stromale cellen relatief ondervertegenwoordigd zijn, terwijl andere celtypen zoals fibroblasten bestaan binnen de extracellulaire matrix en een uitdaging kunnen zijn om te isoleren. Dissociatie wordt nog uitdagender als de blaas een aanzienlijke remodellering en fibrose heeft ondergaan, zoals die waargenomen bij dwarslaesie^3,4 of obstructie van de blaasuitlaat^5,6.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde weefseldissociatiemethode voor downstream eencellige analyse in de gewonde muisblaas van het ruggenmerg. Met behulp van flowcytometrie vergeleken we vier enzymatische spijsverteringsprotocollen voor hun vermogen om een suspensie met één cel op te leveren, de levensvatbaarheid van cellen te ondersteunen en het juiste aandeel celpopulaties te behouden. Op basis van deze analyse concluderen we dat het minimaliseren van celdood, cellulaire aggregaten, niet-cellulaire nucleïnezuren en potentiële remmers van downstream-analyse van cruciaal belang zijn voor het bereiken van hoogwaardige gegevens.

Protocol

De procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de Nationale Gezondheidsinstituten. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van het Boston Children's Hospital.

OPMERKING: Muizen werden gehuisvest in een AAALAC-geaccrediteerde dierenfaciliteit met ad libitum-toegang tot voedsel en water. Vrouwelijke muizen op de leeftijd van 8\u201212 weken oud werden gebruikt voor deze experimenten. Gezien de aard van de verwonding werd extra voedingsverrijking verstrekt aan muizen om hun welzijn te garanderen.

1. Lage thoracale ruggenmergtranssectie bij muizen

1. Voorbereiding vóór de transsectie van het ruggenmerg
   OPMERKING: De chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze procedure zijn micro-ontledende veerschaar, micro-ontledende tang, micro hechtnaald driver, hemostaten en 7-0 polyglactine 910 hechtingen. Andere chirurgische benodigdheden die nodig zijn, zijn chirurgische gordijnen, steriele vellen voor chirurgisch veld, gaassponzen, katoenen puntaplicatoren en 1 ml spuiten met 25 G naalden.
   1. Autoclaaf de chirurgische instrumenten en voorraden voorafgaand aan de operatie.
   2. Reinig de chirurgische ruimte en de verwarmingskussens met alcoholdoekjes. Het ene verwarmingskussen wordt gebruikt tijdens de operatie en het andere voor de onmiddellijke postoperatieve periode om de lichaamstemperatuur van het dier te behouden totdat het weer volledig in activiteit is.
   3. Gebruik vergroot loepen (2,5x of meer) om de chirurgische ingreep uit te voeren.
   4. Schakel de verwarmingskussens, de lichtbron en de glazen kraalsterilisator in om tijdens de procedure klaar te zijn voor gebruik.
   5. Open de chirurgische gordijnen en de instrumenten. Gebruik steriele handschoenen om het chirurgische veld te draperen en plaats de instrumenten in het chirurgische veld.
2. Voorbereiding van de dieren
   1. Breng de muizen naar de ingreepkamer en breng ook een schone kooi mee voor de ruggenmerg gewonde muizen.
   2. Dien anesthesie toe door de muis in de inductiekamer te plaatsen met isofluraanstroom ingesteld op 3,0%, zuurstofstroom op 1 L/min en zuiging op 20 mmHg totdat er geen pootknijperrespons is.
   3. Weeg het dier onmiddellijk en plaats het dier vervolgens in de voorovergebogen positie op het verwarmingskussen.
   4. Plaats de verdovingskegel goed over de neus van de muis, schakel de gasstroom van de inductiekamer naar de neuskegel en stel de isofluraanstroom in op 2% en de zuurstofstroom op 1 L/min.
   5. Bevestig dat het dier voldoende verdoofd is met de afwezigheid van respons op pootknijpen. Plak de dierlijke ledematen vast aan het verwarmingskussen. Plaats een opgerold stuk gaasspons onder de onderste borst om de onderste borstwervels te verheffen en te buigen.
   6. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op beide ogen. Toedienen van pijnmedicatie (Meloxicam, 10 mg/kg, subcutaan) en antibioticum (Enrofloxacine, 5 mg/kg, subcutaan).
      OPMERKING: Eindgebruikers moeten de pijnmedicatie en antibiotica gebruiken die worden aanbevolen door hun lokale dierenverzorgings- en gebruikscommissie.
   7. Palpate het meest prominente stekelige proces in de thoracale wervelkolom dat meestal overeenkomt met T13 spinous proces⁷. Scheer een lengterechthoekgebied op de achterkant van de muis van de onderhals tot net onder het meest prominente spineuze proces (T13) en gedurende 1 cm aan elke kant van de middellijn.
3. Chirurgische ingreep
   1. Bereid het geschoren gebied voor met 10% povidone jodiumoplossing en 70% ethanol drie keer als alternatief op een cirkelvormige manier vanaf de incisieplaats die naar buiten werkt en bedek het dier vervolgens met steriele 4 x 4 gaasspons met een raam in het midden boven het chirurgische veld.
   2. Maak 1,5 cm incisie in de middellijn van de rug met een fijne schaar die eindigt bij het meest prominente stekelige proces (T13). De incisie moet de huid en oppervlakkige fascia omvatten. Het gebruik van een schaar scheidt de huid en oppervlakkige fascia aan weerszijden om de stekelige processen en de omliggende paraspinous spieren bloot te leggen.
   3. Het gebruik van scherpe en stompe dissectie scheidt de spieren van de stekelige processen en de laminae van T9, T10 en T11 wervels.
   4. Verdeel de interspinous ligamenten scherp tussen T9 en T10 en tussen T10 en T11 met behulp van een fijne schaar en verwijder vervolgens het spineuze proces van T10 en voer T10-laminectomie zorgvuldig bilateraal uit om het ruggenmerg bloot te leggen. Zorg ervoor dat de laminae volledig wordt verwijderd.
   5. Transect het ruggenmerg met een fijne schaar. Minimale bloedingen treedt meestal op dit punt op als gevolg van de transsectie van de ruggenmergvaten. Comprimeer het bloedingsgebied met een steriele katoenen applicator om hemostase te bereiken. Na bevestiging van volledige hemostase, sluit de huid met 7-0 polyglactine 910 continue hechtingen.
   6. Dien 1 ml zoutoplossing subcutaan toe om postoperatieve uitdroging te voorkomen.
4. Postoperatieve zorg
   1. Plaats het dier op een verwarmingskussen totdat volledig herstel heeft plaatsgevonden en breng vervolgens over naar een kooi voor alleen gewonde ruggenmergmuizen.
   2. Postoperatieve zorg omvat het dagelijks observeren en wegen van de dieren en het controleren van de incisieplaats op tekenen van infectie gedurende maximaal 7 dagen. Dien 1 ml zoutoplossing, pijnstillend (meloxicam 10 mg/kg) en antibioticum (enrofloxacine 5 mg/kg) allemaal subcutaan dagelijks gedurende 3 dagen toe.
      OPMERKING: Eindgebruikers moeten de pijnmedicatie en antibiotica gebruiken die worden aanbevolen door hun lokale dierenverzorgings- en gebruikscommissie.
   3. Voer elke 12 uur handmatige blaasexpressie (Credé-manoeuvre) uit totdat het dier zelfstandig kan plassen (meestal in 10 tot 14 dagen). Houd het dier met één hand vast en masseer de onderbuik met de andere hand, voel en druk vervolgens zachtjes de opgezweste urineblaas samen met de wijsvinger en duim. Zachte voorbijgaande compressie moet worden afgewisseld met ontspanning. Na handmatige expressie wast u de onderbuik met kraanwater en droogt u voorzichtig met een keukenpapier zonder overmatig wrijven.
      OPMERKING: Een kleine omvang van de blaas voor het begin van de expressie en bevochtiging van de onderbuik met urine zijn aanwijzingen dat het dier het vermogen heeft gekregen om zelfstandig leeg te maken.
   4. Om gewichtsverlies te minimaliseren, biedt u voedingsverrijking aan muizen in de vorm van voedzame gel en andere voedzame lekkernijen (spek softies, fruit crunchies en vegetarische beten) geplaatst op de vloer van de kooi voor gemakkelijke toegang OPMERKING: In deze studie werden muizen doordrenkt en blaasjes verkregen na 8 weken na SCI.
5. Postoperatieve complicaties
   1. Minimaliseer de kans op ruptuur van de blaas als gevolg van overijverige handmatige blaasexpressie door de blaas niet volledig uit te drukken.
   2. Voorkom excoriatie van de perineale huid door continue blootstelling aan urine dribbelen van incompetente sluitspier door het wassen van het perineale gebied met kraanwater. Minimaliseer ontsteking door toepassing van drievoudige antibioticazalf.
      OPMERKING: Uretritale obstructie als gevolg van bloedstolsel tijdens de periode van voorbijgaande hematurie of van spermacoagulum als gevolg van retrograde ejaculatie bij mannelijke muizen kan optreden na dwarslaesie. Volledige uretrale obstructie bij mannelijke muizen culmineert vaak in blaasruptuur en de dood. In onze ervaring was de frequentie van uretritale obstructie bij mannelijke muizen die tot de dood leidde 10%.

2. Perfusie en weefselaankoop

OPMERKING: Voor downstream analyses van bepaalde celtypen zoals immuuncellen in perifere weefsels is het gunstig om bloed te verwijderen door perfusie op het moment van weefseloogst, zoals hieronder beschreven.

1. Dien anesthesie toe zoals vermeld in de chirurgische procedure (stap 2.2) en bevestig dat het dier voldoende is verdoofd zonder forepaw-pinch-respons (het dier is verlamd, daarom hebben de achterpoten een verminderd gevoel en wordt de reactie van de achterpoot-pinch irrelevant).
2. Plaats het dier in de liggende positie en veeg de buik en borst uit met 70% ethanol om de vacht nat te maken om te voorkomen dat het op de operatielocatie komt.
3. Voer een midline laparotomie uit van het bekken tot het middenrif. Snijd het middenrif weg van de ribben.
   OPMERKING: Na deze stap is snelheid belangrijk omdat het thoracale drukverschil niet meer bestaat en de longen niet kunnen opblazen, dus het dier begint te stikken.
4. Snijd de thorax open langs de ribben aan de linker- en rechterkant na de botkraakbeenrand op een lijn evenwijdig aan het borstbeen, beginnend bij het middenrif en tot aan de eerste rib.
5. Plaats de volledige voorste borstwand over het hoofd van het dier en bevestig deze in deze positie met behulp van handdoekklemmen. Snijd de voorste thoracale wand niet af, omdat dit ernstige bloedingen uit de twee inwendige thoracale slagaders zal veroorzaken.
6. Snijd het pericard weg met een fijne schaar.
7. Sluit een naald van 23 G aan op het perfusieapparaat en steek deze vervolgens in de linkerventrikel en langzaam in de aorta, zorg ervoor dat u deze niet doorboort.
   OPMERKING: Het perfusieapparaat bestaat uit een perfusiepomp en een spuit van 50 ml die zijn aangesloten op intraveneuze slangen.
8. Start de perfusie en maak snel een kleine snede met de punt van een fijne schaar in het rechter atrium voor drainage. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen inlaat tijdens een vloeistofinfusie.
9. Voer perfusie uit met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op 15 ml/min. Perfusie is voltooid wanneer drainage helder is en lichtere kleur van de lever wordt bereikt (figuur 1).
   OPMERKING: De gemiddelde tijd voor perfusie was 3,5-4 min. Onvoldoende perfusie manifesteert zich als langzame progressie van het blancheren van weefsels en is meestal te wijten aan een onjuiste positionering van de naald in de linkerventrikel. Het aanpassen van de naald en het verlengen van de duur van de perfusie met 1 tot 2 minuten zorgt voor voldoende doordringing van weefsels.
10. Stop de perfusie en ontleed de blaas vrij van de vasculaire pedicles en urethra en plaats deze in een microcentrifugebuis met ijskoude Tyrode's oplossing.

3. Vertering van urineblaas in controle en ruggenmerggewonde muizen

OPMERKING: Om een efficiënt spijsverteringsmengsel te formuleren dat is afgestemd op de urineblaas van de muis, hebben we geprobeerd de eenheid enzymen aan te passen die worden gebruikt om de overheersende extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen en hyaluronzuur af te breken. Daarom gebruikten we openbaar beschikbare RNA-sequencinggegevens gegenereerd door het Mouse ENCODE-project (BioProject: PRJNA66167) om reads per kilobase per miljoen (RPKM) en Tabula Muris⁸ te extraheren voor de beoordeling van ruimtelijke expressie binnen de blaas. Collageen 1, 3 en 6 waren de drie meest uitgedrukte genen onder 42 verschillende collageens (figuur 2A). De expressie van die collageens en hyaluronan synthase 1 (Has1) werd meestal waargenomen in spiercellen en fibroblasten van de blaaswand (figuur 2B).

1. Voorbereiding van buffers en oplossingen
   1. Bereid natrium Tyrode-oplossing volgens tabel 1 in een schone fles van 500 ml. Voeg 300 ml ddH₂O toe. De oplossing is zuur na bereiding. Pas de pH aan op 7.4 met NaOH. Breng het volume op 500 ml met behulp van dubbel gedestilleerde H₂O, vervolgens aliquot en bewaar bij -20 °C.
      OPMERKING: Deze buffer behoudt de pH- en osmotische balans in de spijsverteringsbuffer en voorziet de cellen van water en essentiële anorganische ionen. Het bevat magnesium, evenals glucose als energiebron. Het kalium in de oplossing biedt beschermende effecten op de elektromechanische activiteit in de geïsoleerde celoplossing. Zouten in poedervorm zijn hygroscopisch en moeten worden beschermd tegen vocht. De volledige inhoud van het mengsel moet onmiddellijk na de bereiding worden gebruikt. Het bereiden van een geconcentreerde zoutoplossing wordt niet aanbevolen, omdat er neerslag kan ontstaan. Sterilisatie met behulp van filtratie (0,22 μm filter) kan worden uitgevoerd als de cellen na analyse worden gekweekt.
   2. Bereid enzymatische vergistingsoplossing voor in een conische buis van 15 ml door aanbevolen volumes en hoeveelheden voor elk onderdeel toe te voegen (tabel 2). Voeg natrium Tyrode-oplossing toe tot 2,5 ml. Vortex grondig op te lossen.
      OPMERKING: Papaïne is een sulfhydryl protease van Carica papaya latex. Papaïne heeft een brede specificiteit en het zal de meeste eiwitsubstraten afbreken⁹. Papaïne is minder schadelijk en effectiever gebleken dan andere proteasen in celdissociatieprotocollen¹⁰. We geven details over de vier dissociatieprotocollen in tabel 2; we hebben protocol sectie 3 geobserveerd om de hoogste levensvatbaarheid te ondersteunen (93%) van celsuspensies bereid uit de muisblaas.
2. Dissociatieprocedure en voorbereiding van celsuspensie
   1. Verzamel de blaas van muizen na de perfusie.
   2. Prik de blaas door om eventuele inhoud vrij te geven.
   3. Voeg 100 μL van de oplossing van Tyrode toe aan een lege centrifugebuis en tarra van 1,5 ml. Plaats de blaas in de buis en weeg opnieuw om een nauwkeurig blaasgewicht te bepalen.
   4. Leg de blaas op een Petrischaal van 10 cm op het ijs en voeg 100 μL van Tyrode's oplossing toe om te mincing.
   5. Snijd met behulp van een chirurgische schaar stukken zo klein mogelijk en minimaliseer de snijtijd tot niet meer dan 2 \u20123 min per blaas. Als het bundelen van blaasweefsel van meerdere dieren, gehakt de blaas in één keer.
   6. Breng het gehakte blaasweefsel met behulp van een pipettip met brede boring over in 2,5 ml spijsverteringsbuffer voor elke blaas. Pas het volume aan als meerdere blazen zijn samengevoegd. Incubeer het weefsel in de spijsverteringsoplossing bij 37 °C in een incubator op een notenmixer gedurende 40 minuten.
   7. Verwijder aan het einde van de incubatieperiode de spijsverteringsbuis uit de incubator. Triturate (pipet op en neer) digestieoplossing met behulp van een pipet van 5 ml gedurende 1 minuut.
   8. Centrifugeren gedurende 10 min bij 350 x g bij 4 °C. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 ml celloslatingsoplossing. Plaats in een incubator van 37 °C gedurende 10 minuten op de notenmixer.
   9. Centrifugeren gedurende 10 min bij 350 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 1 ml RBC lysebuffer (1x). Incubeer gedurende 1 minuut.
   10. Voeg 9 ml PBS toe om de RBC-buffer te verdunnen en de RBC-lyse te stoppen.
   11. Passeer cellen door een celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml, gebruik de zuiger uit een spuit om de celzeef lichtjes te schrapen om volledige celpassage te garanderen. Zorg ervoor dat u de vloeistof verzamelt die door de zeef gaat, maar mogelijk aan de onderkant van de zeef wordt gevangen.
   12. Centrifugeren gedurende 10 min bij 350 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 200 μL celkleuringsbuffer (PBS met 2% FBS).
   13. Tel de cellen.
3. Immunolabeling van specifieke cellen voor flowcytometrie
   OPMERKING: Om verschillende soorten cellen in de blaas te detecteren, hebben we een multi-color flow cytometriepaneel ontworpen. Om compensatie uit te voeren en een geschikte gatingstrategie uit te ontwikkelen, nemen we niet-vastgehouden en fluorescentie minus één (FMO)-besturingselementen op. FMO-controles zijn belangrijk voor de positieve populatie, vooral wanneer de positieve fractie zwak is. De kleuringsprocedure is als volgt.
   1. Blokkeren van FcγRII/III receptoren op cellen
      OPMERKING: We raden aan om niet-specifieke binding van monoklonale antilichamen te blokkeren door voorin incubatie van cellen met monoklonale anti-Fc-receptorantilichamen, of recombinant Fc-eiwit.
      1. Was de cellen door middel van centrifugeren op 350 x g gedurende 5 min bij 4 °C en voeg celkleuringsbuffer toe.
      2. Gooi supernatant weg en blokkeer FcγRII/III-receptoren op cellen om niet-specifieke antilichaamkleuring te voorkomen door CD16- en CD32-antilichamen toe te voegen in celkleuringsbuffer bij verdunning van 1:100.
      3. Incubeer 10 minuten op ijs.
         OPMERKING: Het is niet nodig om de cellen te wassen; cellen kunnen direct na deze fase worden gekleurd.
   2. Kleuring voor MMO's
      OPMERKING: Een fluorescentie minus één (FMO) controle is een buis van alle fluorchromen die worden gebruikt in het experiment dat alle fluorchromen bevat, behalve één.
      1. Als men bijvoorbeeld 4 verschillende fluorchromen (A, B C en D + Annexin V en propidiumjodide (PI) heeft, bereidt u de FMO-buizen als volgt voor. FMO-buis 1: antilichamen geconjugeerd met B,C, D-fluorchromen + (bijlage V en PI); FMO-buis 2: antilichamen geconjugeerd met A, C, D fluorchromen + (bijlage V en PI); FMO-buis 3: antilichamen geconjugeerd met A, B, C fluorchromen + (bijlage V en PI); FMO-buis 4: antilichamen geconjugeerd met A, B, C, D-fluorchromen + (bijlage V); FMO Tube 5: Antilichamen geconjugeerd met A, B, C, D fluorochromen + (PI).
      2. Overweeg de aard van het geconjugeerde fluorchrome voor het annexine V-antilichaam.
   3. Vlekken op de geblokkeerde cellen met de gewenste antilichamen
      1. Incubeer geblokkeerde cellen met geschikte mastermixen van fluorfore-geconjugeerde antilichamen tegen de gewenste eiwitten gedurende 20 minuten op ijs beschermd tegen licht. Vergeet niet om VBO's op te nemen.
      2. Was cellen met 1 ml celkleuringsbuffer toegevoegd aan elke buis en centrifugeer vervolgens opnieuw op 350 x g gedurende 5 minuten bij 10 °C.
      3. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de celkorrel in 200 μL celkleuringsbuffer. Blijf in het ijs totdat fluorescentiegegevens kunnen worden verkregen met behulp van een flowcytometer.
   4. Breng bijlage V/PI-vlek aan.
      1. Bereid een werkende oplossing van PI (100 μg/ml) in 1x annexinebindende buffer zoals beschreven in het protocol van de fabrikant voor de dode cel apoptose kit.
      2. Bepaal de celdichtheid en noteer de buffer en het volume waarin ze zijn opgeslagen.
      3. Centrifugeer monsters bij 350 x g gedurende 5 minuten, gooi de supernatant weg en resuspendeer cellen in 1x Annexin-bindende buffer tot een dichtheid van ~1 x 10⁶ cellen/ml in een volume van 100 μL.
      4. Voeg FITC-Annexin V (5 μL) en PI-werkoplossing (1 μL) toe aan elk monster (100 μL), zoals beschreven in het protocol van de fabrikant, en broed gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Voeg 400 μL 1x annexinebindende buffer toe aan monsters, meng door inversie en houd op ijs tot flowcytometrie.
4. FACS-kalibratie
   1. Flowcytometrie en zuiverheidscontrole
      1. Start de cytometrieanalyse van de stroom door de niet-opgeslagen cellen te meten om de celmorfologie en de troggen van de fluorchromen af te bakenen.
      2. Pas de zijverstrooiing (SSC) en voorwaartse spreiding (FSC) aan door de spanningen van elke fluorescentieparameter aan te passen. Meet de fluorescentie-emissie bij 530 nm (bijlage V) en >575 nm (PI).
      3. Definieer de negatieve populatie in het eerste decennium met behulp van de rasters op elke puntplot. Plaats elke FMO-controle in de cytometer en corrigeer de spectrale overlapping totdat de negatieve en positieve populatiemedianen zijn uitgelijnd.
      4. Meet 100.000 evenementen. Meet cellen bevlekt met specifieke markers en maak poorten voor celpopulaties van belang.
5. Data-analyse
   1. Verzamel de gegevens van de flowcytometer. Open de software om de werkruimte te visualiseren voor analyse.
   2. Een werkruimte maken
      1. Importeer FCS-bestanden door ze naar de werkruimte te slepen. Bestanden zijn zichtbaar in het voorbeeld- en groepsgedeelte van de werkruimte. Dubbelklik in de voorbeeldnaam om het bestand te openen.
      2. Gebruik zijverstrooiingsgebied (SSC-A) voor het y-as- en voorwaartse spreidingsgebied (FSC-A) voor de x-as (figuur 3A). Klik op het pictogram voor polygoon gating.
      3. Maak een poort rond de celpopulatie die van belang is voor de stipplot door te klikken om een poortknooppunt te maken en klik vervolgens door rond de celpopulatie totdat deze is voltooid; dubbelklik om de poort te sluiten.
      4. Geef de poort een naam op basis van de gevangen populatie (bijv. "Alle cellen") en klik op OK.
         OPMERKING: Dubbelklikken binnen de poort "Alle cellen" opent een nieuw grafiekvenster met alleen de gebeurtenissen in "Alle cellen".
      5. Pas de y-as van de nieuwe stipplot aan op SSC-H (zijverstrooiingshoogte) door in de zwarte pijl te klikken en selecteer om de y-as te wijzigen.
         OPMERKING: Deze poort is geschikt voor enkele cellen (singlets) en sluit doubletten of grotere aggregaten uit (figuur 3B). Aangezien afzonderlijke cellen proportionele breedte en lengte hebben, moeten ze worden weergegeven als een populatie op de diagonaal. Cellen die buiten deze diagonale poort vallen, zijn doubletten of grotere aggregaten.
      6. Dubbelklik op de poort om necrotische (PI-positieve), vroege apoptotische (Annexin V-positieve, PI-negatieve) en late apoptotische (Annexin V-positieve, PI-negatieve) cellen te analyseren (figuur 3C).
      7. Label de x-as als bijlage V en de y-as als PI.
         OPMERKING: In sommige gevallen, waar de signaalintensiteit laag is, kunnen celpopulaties negatieve fluorescentiewaarden lijken te hebben, als gevolg van correctie voor achtergrond. In dit geval wordt aanbevolen om een bi-exponentiële transformatie uit te voeren. Klik hiervoor op de T naast de y-as en kies As aanpassen. Wijzig in het nieuwe venster de schaal in bi-exponentieel (Biex), voeg negatieve waarden toe aan de assen door de breedtebasis te vergroten en klik op Toepassen. Dit zal de resolutie van gebeurtenissen met een lage signaalintensiteit verbeteren.
      8. Gegevens weergeven als een tellingsplot. Gebruik het tabblad Optie net onder de x-as en selecteer tellerplot in het menu.
      9. Teken een Quat-poort op het perceel om 4 afzonderlijke doelpopulaties te definiëren.
      10. Klik bovenaan het venster om de lay-outeditor te openen door in De lay-outeditor te klikken en populaties naar elk afzonderlijk gebied te slepen.
      11. Plaats plots in de lay-outeditor door populaties van de werkruimte naar het venster van de lay-outeditor te slepen en neer te zetten.
   3. Visualiseren met behulp van histogrammen
      1. Kies histogram op het tabblad Opties.
      2. Breng een poort aan om Annexin V-positieve cellen te selecteren; als alternatief kunnen positieve en negatieve populaties worden gedefinieerd met behulp van de bisectorale tool. In de voorbeeldsectie moeten nu de verschillende populaties worden weergegeven die zijn vorm en hun hiërarchie.
      3. Als u voorbeelden wilt vergelijken, sleept u alle histogrammen over elkaar heen; klik met de rechtermuisknop op het histogram en kies in het histogram Stagger Offset.
   4. Statistische analyses toevoegen
      1. Open het tabblad Statistiek door te dubbelklikken op de interessepopulatie. Selecteer de functie die u wilt toepassen en de betrokken parameter.
      2. Herhaal dit met andere populaties door het Sigma-pictogram naar de populatienaam te slepen.
      3. Pas de analyse toe op alle monsters door de gatingstrategie uit de interessesteekproef te selecteren en naar de groep te slepen die is gedefinieerd door de markering van belang, bijvoorbeeld bijlage V.
      4. Maak poorten in de FMO-controlemonsters en definieer negatieve en positieve populaties; deze gatingstrategie zal op het gehele experiment worden toegepast (figuur 3D\u2012F).
         OPMERKING: Controleer elk monster afzonderlijk om er zeker van te zijn dat de gating correct is en wijzig waar nodig.
      5. Als cellen zijn bevlekt met markerantilichamen (bijv. CD45), gebruik dan de bijbehorende FMO en poort dienovereenkomstig.
      6. Als u de lay-out wilt exporteren, klikt u op Bestand | Afbeelding exporteren | Selecteer bestandsformaat (bijv. jpg, pdf).
      7. Klik op Tabel maken om een venster te openen met de definitieve versie van de tabel.
      8. De tabel exporteren door Bestand | te selecteren Opslaan als | Bestandsnaam.

Resultaten

Chirurgische ingreep
Het succes van thoracale ruggenmergtranssectie wordt bepaald door beoordeling van een aantal parameters, waarvan hindlimbverlamming de meest voor de hand liggende is. Het dier beweegt alleen met behulp van zijn voorpoten en sleept zijn achterpoten. Anders zijn activiteitsniveaus, waaronder voeding, verzorging en alertheid, meestal normaal. Bovendien verliezen dieren de wilskrachtige blaascontrole, wat resulteert in de noodzaak van handmatige blaasexpressie door de onderzoeker om de 12 uur totdat reflex voiding terugkeert op 10 tot 14 dagen na letsel. Na euthanasie hebben extra tekenen van het succes van de verwonding voornamelijk betrekking op de toename van de verhouding tussen blaas en lichaamsgewicht, wat wijst op weefselremodellering. Histologische analyse onthult hyperplasie in zowel de urotheliale als gladde spiercompartimenten³.

Voorbereiding van eencellige suspensie
Aan de hand van openbaar beschikbare expressiegegevens werd de verrijking van blaasweefsel voor extracellulaire matrixeiwitten bepaald (figuur 2) en gebruikt om de formulering van de spijsverteringsmix te informeren. Aangezien collageens belangrijke componenten van de blaaswand^11,12zijn, probeerden we eerst de meest voorkomende collageen(s) in de muisblaas te bepalen met behulp van RNA-profileringsgegevenssets gegenereerd door het Mouse ENCODE-project^13. Onze analyse toonde aan dat collageen 1A1, collageen 3A1, collageen 1A2 en collageen 6A1 de meest voorkomende collageentypen zijn binnen de muisblaas(figuur 2A). We gebruikten ook de Tabula Muris (een compendium van eencellige transcriptoomgegevens van muis (Mus musculus))⁸ om het mRNA-expressieniveau van collageen 1, 3, 6 en hyaluronan te bepalen. De gegevens maken een directe en gecontroleerde vergelijking mogelijk van genexpressie in celtypen die tussen weefsels worden gedeeld. Uit deze analyse bleek dat de expressie van deze extracellulaire matrixcomponenten vaker voorkomt in de mesenchymale celtypen in plaats van urothelium (figuur 2B).

Effect van dissociatie op de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen van de blaas
Flowcytometrie analyse toonde aan dat enzymatische spijsvertering met behulp van de 4 verschillende protocollen een levensvatbaarheid van respectievelijk 83%, 86%, 93% of 90% opleverde. Protocol sectie 3 werd dus het meest waardevol geacht voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen. We merkten ook op dat ongeveer 4% van de cellen necrotisch was (PI⁺/Annexin V^-) (figuur 4A). Deze observaties benadrukken de efficiëntie van het spijsverteringsprotocol en het daaruit voortvloeiende voordeel voor de levensvatbaarheid van cellen.

Effect van dwarslaesie op verschillende populaties cellen in de blaas
We zagen een significante toename van het totale aantal cellen in blazen van SCI-muizen in vergelijking met controles. Het patroon van de stippercelen verkregen uit SCI-blazen was ook iets anders in overeenstemming met de lopende orgaanremodellering als gevolg van dwarslaesie (figuur 4B: eerste kolom). In vergelijking met controles vertoonden de blaasjes van SCI-dieren een aanzienlijke toename van CD45-positieve cellen.

Figuur 1: Representatieve perfusie voltooiing met lichtere kleur van de lever. (A) Toont de leverkleur aan het begin van de perfusie. (B) Toont de lichtere leverkleur aan het einde van de perfusie. De muis in (A) had ruggenmergtransection twee weken vóór perfusie resulterend in blaashypertrofie en zijn uitsteeksel uit het bekken in tegenstelling tot de muis in (B) die geen dwarslaesie had; in dit geval is de blaas klein en verborgen in het bekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Transcriptomische expressie van extracellulaire matrix (ECM) componenten in de muisblaas. (A) Staafdiagram van 43 verschillende collageentypen. De uitdrukking wordt vermeld door Reads Per Kilobase van transcriptie, per miljoen toegewezen reads (RPKM) (gegevens worden verzameld uit BioProject: PRJNA66167)¹⁴. (B) Vioolplots van genexpressie in celtypen verkregen uit microfluïdische druppeltelling op basis van 3'-eindtellingen in een pool van mannelijke en vrouwelijke gescheiden urineblaasmonsters (mannen en vrouwen). Tellingen werden voor elke cel genormaliseerd met behulp van de natuurlijke logaritme van 1+ tellingen per miljoen ln (CPM+1)⁸. Een pseudocount van 1 CPM werd toegevoegd voordat logaritmen werden genomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gatingstrategie en FMO-controles om fluorescentiespreiding te bepalen. (A) Selectie van celpopulatie. (B) Gating strategie voor singlets. (C) Gating voor necrotische, en vroege en late apoptotische cellen met behulp van PI en Annexin V antilichaam. (D\u2012F) Een schematisch stipplot van multicolor flowcytometrie (bijv. antilichamen geconjugeerd met A, B, C, D fluorchromen + (bijlage V en PI). Dit toont de fluorescentie verspreid in het antilichaam met fluorchroom A-kanaal weergegeven door de FMO-controle in vergelijking met een niet-bevlekte controle. Oranje stippellijn vertegenwoordigt FMO gating grens in vergelijking met niet-opgeslagen grens in rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Flowcytometrie van verschillende celtypen in de blaas. (A) Annexin V/PI dubbele kleuring stroomdiagrammen. De verschillende combinaties van enzymen en chemicaliën die voor elk protocol worden gebruikt, worden weergegeven voor het overeenkomstige levensvatbaarheidsperceel. Deze gegevens tonen aan dat de hoogste levensvatbaarheid is verkregen met protocolsectie 3. (B) Representatieve histogrammen die de intensiteit illustreren van Ly-6A/E (Sca-1) en CD326 (Ep-CAM) gedetecteerd in afzonderlijke kanalen. (C) Effect van SCI op de celpopulatie van de muisblaas. Het bovenste paneel toont de resultaten van vlekken op drie gescheiden blaasjes verkregen uit controle niet-chirurgische muizen en het onderste paneel toont de resultaten van vlekken op drie dieren met SCI. De eerste kolom is de totale celpopulatie. De tweede kolom toont de selectie van singlet gating. De derde kolom toont de subpopulatie van levende cellen die negatief zijn voor B-cellen, T-cellen en NK-cellen. De vierde kolom toont de kleuring voor levende cellen positief voor CD45. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Component	Hoeveelheid (voor 500 ml)	Molariteit
Nacl	4.091 g	140 mM
Kcl	0,186 g	5 mM
MgCl2	0,0476 g	1 mM
D-Glucose	0,9 g	10 mM
HEPES	1,19 g	10 mM

Tabel 1: Componenten voor de bereiding van de oplossing van Tyrode. De aangegeven componenten zijn voor de bereiding van de oplossing van 500 ml Tyrode.

Component	Bedrag	Protocol sectie 1	Protocol sectie 2	Protocol sectie 3	Protocol sectie 4
Bsa	5 mg	Ja	Ja	Ja	Ja
CaCl2	0,03 mM	Ja	Ja	Ja	Ja
Collagenase Type I	132,5 eenheden	Ja	Ja	Ja	Ja
Collagenase Type III	96.4 eenheden	Ja	Ja	Ja	Ja
Collagenase Type VI	50 eenheden	-	-	Ja	-
DNase	10 eenheden	Ja	Ja	Ja	-
Papaïne	115 eenheden	-	-	Ja	Ja
Pan Collagenase	50 eenheden	-	-	Ja	Ja
Hyaluronidase	10,5 eenheden	-	-	Ja	Ja
Dispase II	1.25 eenheden	Ja	Ja	-	-
Oplossing voor celdissociatie	1 ml	Ja	-	Ja	-
Recombinant enzym	1 ml	-	Ja	-	Ja

Tabel 2: Componenten voor de voorbereiding van de vergistingsbuffer. De geïndiceerde componenten zijn voor de bereiding van 2,5 ml vergistingsmix (1 U katalyseert de hydrolyse van 1 μmol per substraat per minuut bij 37 °C. Raadpleeg het productinformatieblad voor de definitie van de eenheid van elk enzym).

Discussie

Het hier beschreven letselmodel van het ruggenmerg van de muis biedt een reproduceerbare methode om een functionele obstructie van de blaasuitlaat te creëren als gevolg van verlies van coördinatie tussen blaascontractie en externe uretthrale sluitspierontspanning. Dit roept op zijn beurt al 2 weken na de verwonding een grondige remodellering van de blaaswand op, gekenmerkt door uitbreiding van urotheliale en gladde spiercompartimenten. Kritieke stappen in de implementatie van het SCI-model bij knaagdieren omvatten (i) strikte aandacht voor handmatige blaasexpressie tijdens de periode van spinale shock die volgt gedurende 10 \u201214 dagen na letsel; ii) voedingsverrijking om gewichtsverlies tot een minimum te beperken; en iii) beperking van het potentieel voor urineverbranding, met name voor experimenten die verder gaan dan de terugkeer van reflexleegte. Beperkingen van het model omvatten het potentieel voor uretritale occlusie bij muizen uit bloedstolsels tijdens de periode van voorbijgaande hematurie, en bovendien bij mannelijke muizen uit spermacoagulum na retrograde ejaculatie na een operatie.

De hier beschreven weefseldissociatiebenadering illustreert het belang van het overwegen van structurele veranderingen in weefsels die voortvloeien uit de experimentele belediging, in dit geval significante weefselremodellering na SCI die downstreamanalyses kan beïnvloeden. Met de toename van eencellige analyses is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat verschillen in genexpressie niet alleen het gevolg zijn van dissociatie-geïnduceerde verstoringen, maar echt representatief zijn voor onderliggende biologische veranderingen die relevant zijn voor het ziektemodel. Het gebruik van openbaar beschikbare expressiegegevens stelde ons in staat om de formulering van vergistingsbuffers aan te passen om een effectieve vertering van extracellulaire matrix te garanderen en tegelijkertijd de levensvatbaarheid te maximaliseren. Aanvullende wijzigingen die in toekomstige toepassingen kunnen worden overwogen, zijn onder meer de toevoeging van actinomycine D, om transcriptie van onmiddellijke vroege genen die gevoelig zijn voor het dissociatieprotocol¹⁵te stoppen .

Pipetting techniek is cruciaal bij het dissocieren van weefsel of het overbrengen van cellen die al in suspensie zijn. Om fysieke schade aan cellen door afschuifkrachten te verminderen, is het belangrijk om zacht en langzaam te pipetten tijdens celreuspensie. Het wordt over het algemeen aanbevolen om pipetpunten met brede boring te gebruiken. Als u standaardtips gebruikt, is het vooral belangrijk om celsuspensies voorzichtig te pipetten om afschuifkrachten te voorkomen die anders cellen zouden beschadigen. Het gebruik van celstammen is onvermijdelijk in dit protocol, maar de celconcentratie kan met 20% of meer dalen, vergezeld van een volumeverlies van 100 μL of meer. We raden aan om de celconcentratie na het persen te bepalen om een nauwkeurig aantal cellen te garanderen.

In flowcytometrie bieden FMO-controles een meting van de achtergrond als gevolg van het bloeden van signalen van overlappende emissiepieken. Ze zijn geen maat voor niet-specifieke antilichaambinding of achtergrondvlekken die aanwezig kunnen zijn wanneer een antilichaam in dat kanaal wordt opgenomen. Om rekening te houden met de niet-specifieke antilichaambinding, moet men passende isotypecontroles opnemen; voor de achtergrondkleuring moet men negatieve controles opnemen. Samen zorgen deze controles voor een nauwkeurige meting van celpopulaties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia