Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

5.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61457

⸱

17 juli 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

In dit artikel

Samenvatting

De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.

Samenvatting

De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2), gecodeerd door de PTPN11 proto-oncogeen, is een belangrijke bemiddelaar van receptor tyrosine kinase (RTK)-gedreven cel signalering, het bevorderen van celoverleving en proliferatie. Daarnaast wordt SHP2 aangeworven door immuuncontrolepuntreceptoren om de activering van B- en T-cellen te remmen. Afwijkende SHP2 functie is betrokken bij de ontwikkeling, progressie, en metastase van vele vormen van kanker. Inderdaad, kleine molecuul SHP2 remmers zijn onlangs opgenomen klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met Ras / Raf / ERK route activering, met inbegrip van tumoren met een aantal oncogene Ras mutaties. Echter, de huidige klasse van SHP2 remmers is niet effectief tegen de SHP2 oncogene varianten die vaak voorkomen in leukemie, en de ontwikkeling van specifieke kleine moleculen die zich richten op oncogene SHP2 is het onderwerp van het huidige onderzoek. Een veel voorkomend probleem met de meeste drug discovery campagnes waarbij cytosolische eiwitten zoals SHP2 is dat de primaire tests die chemische ontdekking rijden zijn vaak in vitro testen die niet de cellulaire doel betrokkenheid van kandidaat-verbindingen verslag. Om een platform te bieden voor het meten van cellulaire doelbetrokkenheid, ontwikkelden we zowel wild-type als mutant SHP2 cellulaire thermische verschuivingstesten. Deze tests detecteren betrouwbaar doel betrokkenheid van SHP2 remmers in cellen. Hier bieden we een uitgebreid protocol van deze test, die een waardevol instrument biedt voor de beoordeling en karakterisering van SHP2-remmers.

Inleiding

Tyrosine fosforylatie speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie in cellen1,2. Deze post-translationele modificatie wordt gekatalyseerd door eiwit tyrosine kinases (PTK's) en omgekeerd door eiwit tyrosine fosfatases (PTPs). Daarom leidt de afwijkende PTK- of PTP-functie tot veel erfelijke of verworven menselijke ziekten3,4,5,6. De Src-homologie 2 (SH2) domein-bevattende fosfatase 2 (SHP2) is een breed uitgedrukte niet-receptor type PTP gecodeerd door de proto-oncogene PTPN117 en is een belangrijke regulator van tal van fysiologische processen die signaal transductie te betrekken door activering van de Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, of JAK / STAT signalering trajecten8. Normaal gesproken is SHP2-activiteit strak geregeld om afwijkende signalering te voorkomen. Onder basale omstandigheden wordt SHP2 autoinhibited door zijn N-terminal SH2-domein, dat de toegang tot de actieve site binnen het katalytische fosfatasedomein blokkeert (figuur 1A)9,10. Bij celactivering rekruteren tyrosine fosforylated bindende eiwitten SHP2, waardoor het zijn actieve conformatie overneemt, waarbij de actieve site nu toegankelijk is voor zijn substraten. Bij veel vormen van kanker is de SHP2-activiteit verhoogd. Somatische gain-of-function (GOF) mutaties in PTPN11 zijn vooral geïdentificeerd in leukemie en voorkomen dat het N-SH2-domein wordt verbonden aan het fosfatasedomein, wat resulteert in constitutief actieve SHP2 (figuur 1B)11. Germline GOF mutaties in PTPN11 zijn verantwoordelijk voor ~50% van de gevallen van het Noonan syndroom, een ontwikkelingsstoornis met een verhoogd risico op maligniteit12. Bij vaste tumoren, waar PTPN11 mutaties zeldzaam zijn, leiden grotere niveaus van fosforgeyleerde bindende eiwitten tot verbeterde SHP2-activiteit(figuur 1C). SHP2 is ook belangrijk voor immuun checkpoint signalering, als checkpoint receptoren zoals BTLA of PD-1 werven SHP2 om key signaling moleculen dephosphorylaat dephosphorylaat dephosphorylaat, het voorkomen van immuuncel activering13,14,15.

Het aanpakken van PTPs met kleine moleculen is een uitdaging geweest, omdat de actieve site van PTP's zeer behouden en zeer geladen is; remmers die zich richten op de actieve site zijn vaak krachtig, maar vertonen een slechte selectiviteit en orale biologische beschikbaarheid16,17,18,19,20,21,22. Inderdaad, veel gemelde SHP2-remmers lijden aan slechte selectiviteit en gebrek aan werkzaamheid in cellen23. Onlangs zijn allosterische remmers van SHP2 met een goede potentie en uitstekende selectiviteit gemeld (bijvoorbeeld SHP09924 en RMC-455025) en hebben hernieuwde interesse gewekt in SHP2-remmers. Verbindingen op basis van SHP099 en RMC-4550 zijn momenteel in fase I klinische proeven voor de behandeling van vaste tumoren met receptor tyrosine kinase (RTK) route activering26,27. Hoewel baanbrekend, deze verbindingen zijn niet effectief tegen veel van de SHP2 oncogene mutanten die leukemogenese rijden bij een aanzienlijk aantal bloedkanker patiënten28,29,30. Dit gebrek aan potentie van SHP099-achtige verbindingen in de richting van de SHP2 oncogene varianten komt voort uit hun unieke allosterische mechanisme, omdat ze de SHP2-activiteit remmen door de inactieve, gesloten conformatie te binden en te stabiliseren, die wordt verstoord in SHP2-mutanten. Verder, op basis van een recent rapport31, adaptieve weerstand mechanismen bij patiënten behandeld met SHP099-achtige remmers zijn heel denkbaar. Bijgevolg is de ontwikkeling van de volgende generatie SHP2-remmers die zich richten op zijn actieve, open staat een onderwerp van intensief onderzoek.

De karakterisering van nieuwe SHP2-remmers in cellen is een essentieel aspect van het leadoptimalisatieproces. Kritisch, bewezen doel betrokkenheid van de remmer onder fysiologische omstandigheden biedt een extra niveau van vertrouwen dat middelen voor medicinale chemie efficiënt worden ingezet op verbindingen met veelbelovende cellulaire werkzaamheid. In het verleden zijn verschillende methoden ontwikkeld om de binding van kleine molecuulremmers aan hun doelen te beoordelen, voornamelijk voor eiwitkinases32. Voor de ontwikkeling van een SHP2 cellulaire doel engagement test, gebruikten we een cellulaire thermische verschuiving test33. Deze test, vergelijkbaar met de in vitro thermal shift (PTS) test voor eiwitten34,bewaakt het doel eiwit thermische stabiliteit, die meestal wordt veranderd door de binding van kleine moleculen. De oorspronkelijke test is een lage doorvoertest die antilichamen gebruikt om doeleiwitniveaus te kwantificeren. Als alternatief hebben we gekozen voor een onlangs gerapporteerde variant van de thermische verschuivingstest die gebruik maakt van een β-galactosidase enzymfragmentcomplementatie (EFC) test(figuur 2)35. Voor deze experimenten wordt het eiwit van belang uitgedrukt in cellen als een N- of C-terminale fusie-eiwit met een verbeterde ProLabel-tag (ePL, een 42 aminozuurfragment van β-galactosidase). Cellen worden vervolgens overgebracht naar 384-well PCR compatibele platen en geïncubeerd met verbindingen van belang. Een thermocycler wordt gebruikt om een temperatuurgradiënt toe te passen op de cellen, waarvan de eiwitten zullen denatureren en aggregaat als de temperatuur stijgt op basis van hun thermische stabiliteit. Het vermogen van een kandidaat-verbinding om het eiwit van belang te binden en te stabiliseren zal resulteren in een verhoogde thermische stabiliteit van dat eiwit. Daarom, na de lysis van de cellen, zullen de gelabelde eiwitten die zijn gestabiliseerd door een kandidaat-verbinding in oplossing blijven bij hogere temperaturen dan gelabelde eiwitten van cellen die zijn geïncubeerd met voertuigcontrole. Reporter enzym acceptor (EA) is in staat om de oplosbare ePL-gelabelde eiwitten aan te vullen, wat resulteert in detecteerbare β-galactosidase activiteit met behulp van een luminescentie substraat.

We hebben onlangs een robuuste cellulaire thermische shift test ontwikkeld voor wild-type SHP2 (SHP2-WT) en een frequente SHP2 oncogenic variant (SHP2-E76K) in een geminiaturiseerde 384-well formaat36. Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol van deze test, die op betrouwbare wijze detecteert doel betrokkenheid door SHP2-remmers in cellen en toont een hoge mate van correlatie tussen remmer potentie en cellulaire thermische verschuiving gegevens. De algemene testworkflow wordt geïllustreerd in figuur 3. Ons platform maakt gebruik van N-terminaal gelabelde full-length ePL-SHP2 fusion eiwitten. Voor de generatie van de overeenkomstige pICP-ePL-N-SHP2-WT en pICP-ePL-N-SHP2-E76K expressie plasmids, verwijzen wij u naar onze recente publicatie36. Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van een thermische gradiënt om SHP2 thermische profielen vast te stellen en SHP2 smelttemperaturen te bepalen in de aanwezigheid of afwezigheid van remmer. Zodra thermische profielen zijn vastgesteld, kan het ook worden uitgevoerd onder isothermale omstandigheden, waardoor remmer dosis-respons beoordeling. Beide soorten experimenten worden hieronder beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van celkweek en reagentia

  1. Formuleer een fles groeimedia van 500 mL met 10% foetaal runderserum, 1x antibioticum/antimicotisch, 20 mM HEPES en 1 mM natriumpyruvaat. Bewaar bij 4 °C.
  2. Dooi cellulaire thermische verschuiving reagentia (EA reagens, lysis buffer, en substraat) van bevroren originele voorraad flessen.
  3. Geef reagentia en buffer af als 2 mL aliquots en bewaar bij -20 °C.
    OPMERKING: Vermijd bevriezing/dooi voor reproduceerbaarheid en gebruik alleen dat volume van het reagens dat nodig is voor de testprocedure.

2. Groei en onderhoud van HEK293T cellen

  1. Verkrijg laagpassageaanhanger HEK293T cellen uit cryo-opslag.
  2. Houd HEK293T cellen in groeimedia op 37 °C, 5% CO2.
  3. Splits cellen elke 4 dagen in een verhouding van 1:14.
    OPMERKING: Voor de beste prestaties mogen HEK293T-cellen niet groter dan 25 keer doorsnee.

3. HEK293T-celvoorbereiding voor tijdelijke transfectie

  1. Maak HEK293T-cellen los van 16 mL-platen met behulp van 3 mL van het cellossagereagens.
  2. Verdun met 12 mL groeimedia. Verzamel cellen door centrifugatie op 1.400 x g gedurende 4 minuten.
  3. Resuspend de pellet in 10 mL groeimedia. Meet de concentratie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauw en een cel teller.
  4. Plaat 7.0 x 105 exponentieel groeiende HEK293T cellen per put in een 6 goed celkweekplaat ongeveer 24 uur vóór transfectie.
    LET OP: Reserveer een goed voor elke plasmid te worden doorgetransfecteerd.
  5. Incubeer voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.

4. Transfectie van HEK293T-cellen

  1. Uit een gezuiverde plasmid voorraad pICP-ePL-N-SHP2-WT of pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) verdun 2 μg plasmide DNA tot 200 μL transfectiebuffer.
  2. Vortex voor 10 s en centrifuge bij 1.400 x g gedurende 4 minuten.
  3. Voeg 4 μL transfectiereagens toe aan het verdunde DNA. Vortex voor 10 s en centrifuge bij 1.400 x g gedurende 4 minuten.
  4. Incubeer bij 23 °C gedurende 10 minuten.
  5. Verwijder de 6 putplaat met groeiende HEK293T cellen uit de couveuse. Voeg het transfectiemengsel toe aan de bijgevoegde cellen in de 6-putplaat. Incubeer voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.

5. Bereiding van de testplaten

  1. Bereid 10 mM voorraadoplossingen voor in DMSO van te testen verbindingen.
  2. Doseeroplossingen in een 384-put lage dode volumebronplaat voor onmiddellijk gebruik.
  3. Spot het gewenste volume van remmers of voertuig (DMSO) met behulp van een vloeistofafhandelaar in 384-goed real-time PCR-platen op een doel eindvolume van minder dan 0,5% DMSO (v/v). Verzegel de plaat met een plaatafdichter met inert gaszuivering.
    OPMERKING: Voor inhibitor dosis-respons testen, zorg ervoor dat DMSO dienovereenkomstig te vullen, zodat gelijke hoeveelheden DMSO worden gebruikt voor elke remmer concentratie. Bewaar voor het beste resultaat platen op 23 °C en gebruik platen binnen 24 uur.

6. Transfected cell detachement and preparation

  1. Preincubate groeimedia en cellossvul reagens in een waterbad van 37 °C. Verwijder transfected cellen uit de couveuse. Voorzichtig aanzuigen media uit de putten van de plaat.
    LET OP: Gebruik een nieuwe aspirator voor elke put die een andere transfected plasmide bevat.
  2. Voeg 0,3 mL van het reagens van de celloslating toe. Wieg de plaat voorzichtig heen en weer om het oppervlak van de plaatbodem grondig af te dekken. Incubeer bij 23 °C gedurende 2 min.
  3. Voeg 1 mL groeimedia toe aan elke put. Voorzichtig pipette media en cellen in de put en breng over naar een 15 mL Falcon centrifuge buis. Verzamel cellen door centrifugatie op 1.400 x g gedurende 4 minuten.
  4. Voorzichtig maar grondig aspirate uit de media.
    OPMERKING: Restfolrood in het reagens van het cellossement kan de test verstoren.
  5. Zorgvuldig resuspend celpellet in 2 mL van groeimedia. Meet de concentratie en levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauw en een cel teller.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel moet > 90% zijn voor de beste resultaten.
  6. Verdun cellen tot een concentratie van 125 cellen/μL. Voor een 5 μL-test is dit bijvoorbeeld ~625 cellen/μL. Voor een optimale levensvatbaarheid houden cellen in suspensie voor niet meer dan 2 uur.

7. Incubatie van cellen met SHP2-remmers

  1. Breng cellen in een steriele eenkanaalsoplossing.
  2. Centrifuge 384-well real-time PCR plaat die is vooraf voorbereid door SHP2 remmer depositie op 2.500 x g gedurende 5 min bij 23 °C.
  3. Verwijder de afdichting van de samengestelde plaat. Voeg met behulp van een 125 μL multichannel pipet 5 μL van de verdunde cellen toe aan de gewenste putten.
  4. Centrifugeren de plaat op 42 x g voor 30 s zonder deksel op de plaat. Bevestig een dekselafdichting aan de plaat nadat de plaat is gedraaid en broed de testplaat uit op 37 °C, 5% CO2 gedurende 1 uur.

8. Bereiding van chemiluminescent reagenscent reagens master mix

  1. Verwijder de benodigde hoeveelheid detectiereagentia (EA-reagens, lysisbuffer en substraat) uit -20 °C-opslag na beplating van cellen. Dooireagentia bij 23 °C.
    OPMERKING: Voor het gemak bij de overdracht, bereid een volume dat is 1,5x het totale volume van de cellen die zijn afgezet op de plaat. Gebruik reagentia niet opnieuw na gebruik.
  2. Bereid een mastermix van de reagentia voor met behulp van voorwaarde EA-10, die als volgt bestaat uit component- en volumefractie: EA-reagens (0,17), lysisbuffer (0,17), substraat (0,67).
    OPMERKING: Reagensratio's zijn gebaseerd op optimalisatie-experimenten die zijn uitgevoerd zoals gespecificeerd in de handleiding van de leverancier.

9. Isothermale of thermische profiel gradiënt warmtepuls

  1. Programmeer de gradiënt geschikt thermocycler voor de levering van warmtepuls.
    1. Voor experimenten met thermische profielgradiënt, de thermocycler voorprogrammeren met de volgende voorbeeldspecificaties:
    2. Hittepuls: 3 min gewenste smelttemperatuur (verticale of horizontale gradiënt +/- 15 °C; bijvoorbeeld 38-68 °C verspreid over 24 putten levert temperatuurschommelingen van 1,25 °C op).
  2. Equilibration recovery step: 3 min 20 °C met hellingssnelheid = 1 °C/s
    1. Voor isothermale experimenten is het protocol ingesteld als volgt:
    2. Hittepuls: 3 min 55 °C. Equilibration recovery step: 3 min 20 °C met hellingssnelheid = 1°C/s
      OPMERKING: Voor verhoogde reproduceerbaarheid, omdat het moeilijk kan zijn om de plaat precies te plaatsen op het moment dat de thermocycler de gewenste temperatuur bereikt, stel het programma in om 15 s af te tellen voordat de 3 min puls begint. Voor de thermocycler die in dit experiment wordt gebruikt zie Tabel van Materialen, wordt het deksel omhoog gehouden tijdens de hittepuls.

10. Lysisdetectie en -meting

  1. Supplement testplaten met lysis detectie master mix door toevoeging van gelijke volumes (5 μL) aan elke put te analyseren met behulp van een multichannel pipet.
  2. Centrifuge de plaat 42 x g voor 30 s. Bewaar op 23 °C in het donker gedurende 30-60 min.
  3. Meet chemiluminescentie met behulp van een microplatelezer die luminescentie in 384-put formaat kan detecteren. Voer luminescentiemeting uit met het plaattype en de integratietijd geoptimaliseerd (integratietijd 1000 ms, afrekentijd 0 s). Meet waarden als tellingen/s en output voor verdere analyse.

11. Gegevensanalyse

  1. Analyseer de luminescentiegegevens met behulp van een wetenschappelijke 2D-grafiek- en statistiekensoftware.
  2. Genereer thermische profielen door het analyseren van de genormaliseerde luminescentie gegevens (genormaliseerd naar de controle van het voertuig) met behulp van niet-lineaire regressie en een Boltzmann sigmoidal model.
    OPMERKING: In thermische profiel experimenten, de berekende V50, de temperatuur die het halverwege punt tussen de bodem en de bovenkant van de curve, definieert de smelttemperatuur van SHP2. In isothermale experimenten definieert EC50 de concentratie van de remmer die half-maximale respons geeft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het thermische gradiëntexperiment voor SHP2-WT resulteerde in een sigmoïdaal cellulair thermisch thermisch profiel met een smalle smeltovergang die typisch en consistent is voor een gevouwen eiwit(figuur 4A). SHP2 bestaat uit drie onafhankelijke domeinen: twee SH2-domeinen en het katalytische domein (figuur 1). In de autoinhibited gesloten conformatie deze domeinen zelf-associate; de smeltovergang die werd waargenomen in het thermische profiel experiment weerspi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een doel betrokkenheid test die kan bevestigen directe binding van kleine moleculen aan de SHP2 fosfor in cellen. De test kan onderscheid maken tussen lage en hoge affiniteitsremmers en, belangrijker nog, een gebrek aan potentie bevestigen door de allosterische remmers van het SHP099-type voor de GOF oncogeen SHP2-E76K mutant. Een kracht van deze geminiaturiseerde test is het vermogen om te worden geïntegreerd in een SHP2 remmer screening campagne. Het vermogen van de test om intracellulaire binding aan SHP2 te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten met de inhoud van dit artikel hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (aan L.T.), Epstein Family Foundation Award (aan N.D.P.C.), en NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Bovendien is dit project geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermeldt het van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties goedkeuring door de Overheid van de V.S. impliceert. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
384-well gradient equipped thermocyclerEppendorf AGX50h
384-well low dead volume microplate Echo qualifiedBeckman Coulter, Inc.LP-0200
6-well cell culture platesGreiner Bio-One657 160Steriel met deksel
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Cell counterThermo Fisher ScientificCountess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo acoustic liquid handlerBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Electronic multichannel pipetteThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES bufferThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse starter kitEurofins DiscoverX Corp.94-4007Componenten omvatten EA buffer, lysis buffer en substraat
Microplate readerTecan Trading AGSpark
Single channel solution troughThermo Fisher ScientificS253012005
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Thermal microplate sealerAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Transfection reagentsPolyplus TransfectionjetPRIME
Trypan blueThermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express reagentThermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR platesEppendorf AG30132734
```

Referenties

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

SHP2 remmersCellular Thermal Shift AssayHEK293 T cellenthermische gradi ntexperimentisotherme titratieSHP099 allostere remmeroncogene SHP2 mutantenchemiluminescentiedetectie
Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.