Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Summary

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Abstract

De hier gepresenteerde methoden kwantificeren enkele parameters van aanhangende celmonolagen van meerdere op de juiste wijze vastgehouden confocale afbeeldingen: hechting aan het substraat als functie van het aantal en de grootte van focale verklevingen en celvorm, gekenmerkt door de celvormindex en andere vormbeschrijvingen. Focale verklevingen werden gevisualiseerd door paxilline kleuring en cel-cel grenzen werden gekenmerkt door knooppunt plakoglobine en actin. De methoden voor celkweek en kleuring waren standaard; afbeeldingen vertegenwoordigen afzonderlijke brandpuntsvlakken; beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare software voor beeldverwerking. De gepresenteerde protocollen worden gebruikt om het aantal en de grootte van focale verklevingen en de verschillen in celvormverdeling in de monolagen te kwantificeren, maar ze kunnen opnieuw worden gebruikt voor de kwantificering van de grootte en vorm van een andere afzonderlijke cellulaire structuur die kan worden gekleurd (bijvoorbeeld mitochondriën of kernen). Het beoordelen van deze parameters is belangrijk bij de karakterisering van de dynamische krachten in de hechtende cellaag, inclusief celhechting en actomyosinecontractiliteit die de celvorm beïnvloedt.

Introduction

Epitheelcelmonolagen fungeren als een collectief waarin celcel- en celsubstraathechting en contractielkrachten en spanningen belangrijke parameters vertegenwoordigen en hun juiste evenwicht bijdraagt aan de algehele integriteit van eenheid^1,2,3. Het beoordelen van deze parameters is dus een manier om de huidige status van de cellaag vast te stellen.

De twee hier beschreven methoden vertegenwoordigen een tweedimensionale analyse van de samenvloeiende monolagen van aanhangende, epitheelcellen (in dit geval MCF7 borstkankercellijn). De analyse wordt uitgevoerd met behulp van confocale afbeeldingen (enkele Z-segmenten) uit verschillende regio's op de Z-as; basaal gebied in de buurt van een substraat voor focale hechting (FA) metingen en apicale regio voor celvorm metingen. De gepresenteerde methoden zijn relatief eenvoudig en vereisen standaard laboratoriumtechnieken en open-source software. Confocale microscopie is voldoende voor dit protocol, dus het kan worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van meer gespecialiseerde TIRF (Total Internal Reflection Fluorescentie) microscopie. Zo zou het protocol kunnen worden geïmplementeerd in een relatief standaard laboratoriumomgeving. Hoewel de nauwkeurigheid van de methoden beperkt is, kunnen ze basisverschillen in brandpuntshechting en celvorm onderscheiden.

Beide hier beschreven methoden bestaan uit de standaard experimentele procedures zoals celverlening, immunostaining, confocale beeldvorming en beeldanalyse uitgevoerd met ImageJ. Echter, elke beeldverwerking software met de juiste functies kan worden gebruikt. De gepresenteerde methoden kunnen veranderingen volgen en vergelijken die zijn veroorzaakt door farmacologische behandeling of minimale genetische modificatie. Het verkrijgen van bepaalde waarden wordt niet aanbevolen, vanwege de beperkte precisie van deze methoden. Twee geautomatiseerde macro's werden opgenomen, om de metingen van vele beelden te vergemakkelijken.

Protocol

1. Voorbereidende stappen

1. Celzaaien om confluent monolagen te verkrijgen
   1. Vóór het zaaien, bestrijk de putten van een 4-putten kamer dia met collageen I (of andere ECM component van keuze). Voor collageen I coating, volg een commercieel protocol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html bij een concentratie van 8 μg/cm².
   2. Zaad 400.000 cellen tot een put van een 4-well kamer dia.
   3. Kweek de cellen 24 uur (of langer, afhankelijk van de experimentele eindpunten) voordat ze vlekken, in een couveuse bij 37 °C, 5% CO₂. Deze stap zorgt voor een rijping van celcelcontacten en de vorming van monolagen.
   4. Gebruik een optische, omgekeerde microscoop om samenvloeiing te verifiëren (ongeveer 90% is vereist) en een algemene conditie van monolagen. Ga niet verder als cellen zweven of gestrest lijken.
2. Immunofluorescerende kleuring
   OPMERKING: Cellen kunnen worden gekleurd met een protocol naar keuze. Hier werd immunofluorescentie uitgevoerd zoals eerder beschreven⁴.
   1. Voor focale hechtingsanalyse, vlek de cellen met een focale hechting eiwit van keuze (in dit protocol paxilline). Voor celvormanalyse vlek met cel-cel junction eiwit van keuze (in dit protocol desmosomal eiwit plakoglobine).
   2. Gebruik voor de procedure 0,5 mL van gespecificeerde oplossingen, tenzij anders gespecificeerd.
   3. Fix cellen in 4% formaldehyde in PBS voor 30 min op ijs.
   4. Incubeer met 0,1 M ammoniumchloride (in PBS) gedurende 10 minuten om autofluorescentie te blussen.
   5. Voeg 0,5% Triton X-100 (in PBS) toe voor 30 min (permeabilisatie).
   6. Blok met 5% melk (of 1% BSA) in TBS-T voor 1 uur.
   7. Incubaal met primair antilichaam bij 4 °C 's nachts (anti-paxillin: konijn, 1:250, anti-plakoglobine: konijn, 1:400)
   8. Incubeer met secundair antilichaam gedurende 30 min (Alexa Fluor 594 geit anti-konijn, 1:500, 1:500)
   9. Vlek met 300 nM DAPI gedurende 1-5 min, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Eventueel kan extra kleuring van actine met fluorescerende phalloïdenconjugaten (conc. 1:400) worden uitgevoerd; phalloidine moet worden toegevoegd in dezelfde stap als het secundaire antilichaam.
3. Confocale beeldvorming
   1. Maak afbeeldingen van enkele Z-segmenten met behulp van een confocale microscoop (bijvoorbeeld Zeiss LSM800).
      OPMERKING: Optionele actin kleuring kan helpen bij het beoordelen van de juiste brandpuntsvlak. Corticale actin kleuring is aanwezig in het apicale gebied, terwijl actin stress vezels aanwezig zijn in het basale gebied, in de buurt van het substraat, zoals geïllustreerd op figuur 1.
   2. Focale adhesiebeeldvorming
      1. Kies Z-segmenten voor focale hechtingsanalyse van het basale gebied, dicht bij het substraat.
      2. Gebruik een doelstelling met het hoogste numerieke diafragma beschikbaar (bij voorkeur 63x N.A.: 1.4).
         LET OP: De vorm van FA is zeer specifiek en gemakkelijk herkenbaar. Het wordt dus aanbevolen om de scan te starten vanaf een brandpuntsvlak onder de cellen en vervolgens langzaam naar hen toe te scannen, totdat FA's duidelijk zichtbaar zijn. Beeldanalyse zal nauwkeuriger zijn van kleinere gezichtsvelden, die meestal uniformer zijn, maar dit impliceert dat minder cellen in één gezichtsveld worden berekend.
   3. Beeldvorming van celcellencontacten
      1. Gebruik een doelstelling van 40x of 63x.
      2. Selecteer kanalen voor nucleaire kleuring en de gewenste kruising eiwit kleuring.
      3. Kies Z-segmenten voor celvormanalyse uit het apicale gebied van de monolagen.
      4. Maak foto's voor ten minste 3 verschillende gezichtsvelden (200-400 cellen).

2. Beeldanalyse

OPMERKING: Op voorwaarde dat macro's optimaal werken op ImageJ-versie 1.50f of nieuwer. Gebruik alleen voor kwantificering van beelden met een hoge signaal-ruisverhouding en zonder onder- of oververzadigde pixels. De beschreven methoden omvatten stappen die handmatige parameteraanpassing vereisen. Zo wordt een blinde analyse/geblindeerde experiment setup aanbevolen. Voor het versleutelen van afbeeldingsbestandsnamen kunnen ImageJ-plug-ins zoals "Blind Analysis Tool" (beschikbaar op: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) worden gebruikt.

1. Focale adhesieanalyse
   OPMERKING: De aanbevolen invoerbestanden voor de volgende methoden zijn: afbeeldingen van FA's die worden weergegeven in 8-bits grijswaarden die zijn opgeslagen in de indeling .tiff.
   1. Open afbeelding met ImageJ.
   2. De schaal van een afbeelding instellen op pixels(Analyseren | Schaal instellen; Schaal verwijderen en de optie Globaal controleren).
   3. Neem de bestandsnaam en het gebied van ROI op in meetopties(Analyseren | Metingen instellen...); de opties Area en Display-label.
   4. Achtergrond aftrekken (Proces | Achtergrond aftrekken; de parameter Rolling ball radius instellen op 50 pixels; check Sliding paraboloid optie). In het geval van pseudocolored RGB-afbeeldingen: split RGB-kanalen, laat het kanaal met FAs geopend, sluit de resterende kanalen (Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen).
   5. Bepaal het gebied van het kleinste interessegebied (ROI). Met behulp van uit de vrije hand of polygoon selecties schetsen de kleinste enkele brandpuntshechting en meet het gebied (Analyseren | maatregel). Herhaal deze stap voor verschillende ROI's (FA's) van een paar willekeurig gekozen afbeeldingen (voor een totaal van 20 ROI's). Bereken en bewaar het gemiddelde van de verkregen resultaten.
      OPMERKING: Deze stap is alleen vereist wanneer een bepaalde set afbeeldingen voor het eerst wordt geanalyseerd (specifieke cellijn, coatingdia's met specifieke extracellulaire matrixcomponenten, verschillende kweekomstandigheden).
   6. Afbeelding converteren naar binair met behulp van een van de volgende methoden:
      1. De algemene drempel instellen (Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde; controleer standaard- en b&w- en donkere achtergrondopties, pas de drempel handmatig aan of stel deze automatisch in).
      2. De lokale drempel instellen (Afbeelding | Aanpassen | Automatische lokale drempelwaarde...; stel methode in op Phansalkar en controleer Witte objecten op de optie zwarte achtergrond. Vervolgens de afbeelding omkeren (Bewerken | Omkeren).
   7. Meet het aantal en het gebied van ROI's. Selecteer Analyseren | Deeltjes analyseren; Pixeleenheden, Weergaveresultaten, Resultaten wissen en Opties voor samenvatten, de parameter Grootteinstellen , als een ondergrens gebruiken het gemiddelde van de kleinste ROI's vanaf stap 2.1.5. De bovenste grens kan worden ingesteld op 25% van een typisch celgebied.
   8. Overdrachtsgegevens (waaronder afbeeldingsnaam, aantal FA's, totaal en gemiddeld gebied van FA's; respectievelijk Slice, Aantal, Totaalgebied, Gemiddelde grootte)van het overzichtsvenster naar het gegevensbeheerprogramma naar keuze.
   9. Bepaal het aantal cellen per afbeelding door de met DAPI-gekleurde kernen te tellen. Tellen kan handmatig worden gedaan (Plugins | Analyseren | Celteller)of zoals in beschikbare protocollen zoals: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Als alternatief, om het tellen van de FA's te vergemakkelijken, gebruik de bijgevoegde ImageJ macro (FAs.ijm).
       1. Verplaats .ijm-bestand met de macro naar plug-ins of macro's map in ImageJ bronbestanden mappen.
       2. Bepaal een gebied met de kleinste ROI zoals beschreven in stap 2.1.4.
       3. Macrobestand openen (Plug-ins | Macro's | Edit...).
       4. Voordat de macro wordt uitgevoerd, stelt u de waarde van drie variabelen in: vulwaarde van area_of_the_smallest_region_of_interest met een getal dat is verkregen tijdens stap 2.1.4. Stel threshold_type waarde in op handmatig of automatisch.
       5. Wijzigingen opslaan (de macro moet klaar zijn voor gebruik).
       6. Bel de macro vanuit het deelvenster ImageJ of maak er een snelkoppeling naar. De macro begint met het standaard geopende dialoogvenster. Selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt.
          OPMERKING: In het geval van handmatige drempelaanpassing is handmatige bevestiging van de drempelwaarde vereist (voorkom wijzigingen met de knop Toepassen in het dialoogvenster Drempelwaarde, gebruik in plaats daarvan het aangepaste dialoogvenster Actie vereist). De resultaten die worden verkregen door met de macro te werken, zijn dezelfde als die beschreven in stap 2.1.8 (opgenomen in het dialoogvenster Samenvatting). Bovendien wordt in het geval van handmatige drempelaanpassing het lagere drempelniveau weergegeven in een dialoogvenster Logboek, omdat deze waarde het mogelijk maakt om verkregen resultaten in de toekomst te reproduceren indien nodig. Aanvullende cijfers S1 en S2 werden opgenomen als trainingsdataset voor de FAs.ijm macro.
2. Celvormanalyse
   1. Handmatig
      1. Open een afbeelding in ImageJ of een andere software voor beeldverwerking met een vergelijkbare set functies (verdere instructies hebben betrekking op ImageJ). Kies de parameters die moeten worden gemeten door te selecteren in het menu Analyse | Stel Metingen en aanvinkende vormbeschrijvingen in het selectievakje in.
      2. Verwijder handmatig celranden, gemarkeerd door knooppunteiwit(s) naar keuze, met behulp van het pictogram Selecties uit de vrije hand. De gekozen parameters worden automatisch berekend voor elke cel. Sla de resultaten op nadat u elke cel hebt uiteengezet door op Bewerken te klikken | Selectie | Toevoegen aan manager. Alleen volledige, volledig zichtbare cellen, met ononderbroken randen moeten worden geteld.
      3. Wanneer alle cellen in het gezichtsveld worden beschreven, maakt u de meting door alle getallen te markeren die in het linkervak van de ROI-manager (overeenkomend met cellen) worden weergegeven en op Meten klikken De resultaten worden weergegeven in het vak Resultaten en kunnen worden overgebracht naar de spreadsheet naar keuze.
   2. Geautomatiseerde
      OPMERKING: Om de kwantificering van celvormbeschrijvingen (CSI, aspect ratio, rondheid, degelijkheid) te vergemakkelijken is een ImageJ macro opgesteld en aan dit artikel gehecht (CSI.ijm). De macro is voornamelijk gebaseerd op ImageJ plugin genaamd MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. De macro voert de volgende stappen uit: 1) Uitbreiding van elke rand van de afbeelding met 10 zwarte pixels [MorpholibJ]; 2) Rondes van dilataties en erosies - morfologische filter [MorpholibJ]; 3) Generatie van binair beeld van cellengrenzen door morfologische segmentatie [MorpholibJ]; 4) Verwijding van celgrenzen; 5) Inversie van pixelswaarde; 6) Het genereren van selecties en het meten van het gebied en de omtrek van cellen op de afbeelding; en 7) Afbeelding opslaan met geschetste cellen en ImageJ ROI-selecties in een nieuw bestand.
      1. Verplaats het .ijm-bestand met de macro naar de map plug-ins of macro's in de mappen van ImageJ-bronbestanden. Bel de macro vanuit het deelvenster ImageJ of maak er een snelkoppeling naar.
      2. Bepaal vóór de kwantificering van een nieuwe gegevensset de waarden van de kleinste en grootste regio's van belang. Overzicht (uit de vrije hand of polygoon selectie) een paar (3-10) voorbeelden van de kleinste en de grootste cellen op de afbeelding en vervolgens meten hun gebied (Analyseren | maatregel).
      3. U ook de macro uitvoeren met standaardinstellingen (de limiet voor de lagere grootte is ingesteld op 0 en de bovengrens is ingesteld op oneindig), wacht tot de macro is voltooid en selecteer De optie Celgroottegrenzen instellen. Meet het gebied van de kleinste en grootste cellen door op hun label te klikken en druk vervolgens op Meten in de ImageJ ROI Manager. Stel de waarde in van the_smallest_cell- en the_biggest_cell variabelen. Sla wijzigingen op, sluit alle macrodialoogvensters en voer de macro opnieuw uit.
         OPMERKING: De macro kan worden gebruikt zonder ROI-groottegrenzen in te stellen, maar wordt niet aanbevolen omdat het de kans op het meten van ongepaste celfragmenten of celclusters aanzienlijk vergroot.
      4. Start de macro met het standaard dialoogvenster Openen. Selecteer de afbeelding die moet worden verwerkt (grijswaarden).
      5. Analyseer de resultaten. De uitvoer die door de macro wordt geleverd, bestaat uit: tabel van de resultaten (cellabel, afbeeldingslabel, celgebied [pixels²], celomtrek [pixels^2],circulariteit [CSI], beeldverhouding, rondheid, stevigheid), afbeelding met overzichtse cellen en ROI-selectieslijst (die ook in nieuw bestand in de submap Resultaten wordt opgeslagen). De resultatentabel wordt automatisch gekopieerd naar het klembord van de gebruiker.
         LET OP: Aanvullende cijfers S3 en S4 zijn opgenomen als trainingsdataset voor de CSI.ijm macro.

3. Kwantificering

1. Kwantificering van DE's
   1. Bereken het gemiddelde FA's-getal en de gemiddelde FA-grootte per cel/kern.
      OPMERKING: Voor sommige cellijnen is het mogelijk om FA's afzonderlijk te tellen in afzonderlijke cellen. Voor cellijnen die sterke celcelcontacten hebben en groeien als monolagen zoals MCF7, kunnen het aantal en de grootte van FA's per cel worden berekend door de waarden die zijn verkregen uit FA's te delen door het aantal kernen in de hele afbeelding.
   2. Statistische significantie van potentiële verschillen tussen populaties (experimentele groepen) beoordelen. Afhankelijk van de verdeling en variantie van de gegevens, voor de vergelijking van de twee verschillende groepen gebruiken Student t-test (normale verdeling) of niet-parametrische U-test (Mann-Whitney). Voor de vergelijking van meerdere groepen gebruik maken van one-way ANOVA of Kruskal-Wallis in combinatie met de juiste post-hoc tests.
2. Celvormanalyse
   1. Berekening van vormbeschrijvingen
      1. Handmatige analyse: Bereken de cel shape-index (CSI, ook wel circulariteit of celvorm genoemd) in de keuzespreadsheet voor elke gemeten cel vanuit het juiste gebied en omtrek met behulp van de formule:
         
         OPMERKING: CSI gaat uit van waarden tussen 1 (cirkelvormig) en 0 (langwerpig). De voorbeelden van verschillende celvormen (met hetzelfde gebied) en hun respectieve CSI's worden gepresenteerd in figuur 2. In geautomatiseerde analyse worden de waarden van vormbeschrijvingen (aangeworven en hieronder gedefinieerd) automatisch berekend en in het resultaatvak weergegeven:
         (1) CSI = 4π*gebied/(perimeter)²
         (2) AR = belangrijke as/kleine as
         (3) Rondheid = 4*oppervlakte/π*(belangrijke as)²
         (4) Stevigheid = oppervlakte/bolle gebied
   2. Histogrammen van celvormverdeling
      1. Plot celvormverdeling als histogram van circulariteit (CSI). Classificeer cellen op basis van hun CSI-waarde (berekend voor het minimum van 200-400 cellen), tot een van de tien uniforme intervallen (bereik: 0-1, bakbreedte: 0,1). Het histogram geeft het aantal cellen in elke categorie weer.
         OPMERKING: Het histogram met vormverdeling van de typische MCF7-cellaag toont een piek van ongeveer 0,7-0,8 CSI. Als de vorm van de cellen wordt vervormd door een bepaalde factor (bijvoorbeeld paclitaxel behandeling, die G2/M fase arrestatie veroorzaakt en in het gevolg meer cellen zijn rond) moet worden weerspiegeld op het histogram.
   3. Cumulatieve verdelingskavels
      1. Vergelijk cumulatieve CSI-distributies voor elke celregel, omdat dit de beste manier is om statistisch belangrijke verschillen in celvormveranderingen (of andere wijzigingen in de distributie) te beoordelen. Het kan bijvoorbeeld worden toegepast om de veranderende verdeling van DE's bij te houden.
      2. Bereken de cumulatieve distributiefunctie (CDF) om distributies te vergelijken. CDF kent voor een bepaalde CSI-waarde (uitgezet op X-as) het percentage (of relatieve telling) toe waarvoor alle waarden kleiner of gelijk zijn aan deze CSI-waarde (uitgezet op de Y-as). Naarmate de CSI-waarde hoger wordt, wordt het percentage van de set waarden dat minder of gelijk is aan deze waarde ook hoger. CDF kan worden berekend door de statistische software van keuze, of handmatig.
      3. Voor statistische analyse, gebruik Kolgomorov-Smirnov niet-parametrische test.

Results

Focale adhesieanalyse
De knockdown van het HAX1-gen bleek eerder van invloed te zijn op focale verklevingen⁶. Cellen werden gekweekt op collageen I-gecoate oppervlak voor 48 uur. Beelden van de MCF7 controlecellen en MCF7 cellen met een HAX1 knockdown(HAX1 KD) van drie onafhankelijke experimenten gekleurd met focale adhesie eiwit paxilline werden verkregen met behulp van een confocale microscoop (afbeelding van single focal plane / Z-slice basale regi...

Discussion

Celcel- en celsubstraathechting vormen inherente kenmerken van de epitheelcellen en spelen de cruciale rol in weefselmorfogenese en embriogenese. In volwassen weefsels is de juiste regulatie van mechanische eigenschappen van de cellaag cruciaal bij het handhaven van homeostase en het voorkomen van pathologische reacties zoals tumorprogressie en metastase. De grootte en het aantal brandpuntsverklevingen zijn afhankelijk van de sterkte van de hechting van het celsubstraat, terwijl de celvorm afhankelijk is van contractiele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	geit anti-konijn, 1:500
Ammoniumchloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collageen van kalfshuid	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), kleuring van nucleïnezuur
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvaat	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobine	Cell Signaling	2309S	konijn, 1:400
Laminair-stroomkastje klasse 2	Alpina		standaarduitrusting
MCF7-gebaseerdeHAX1KD-cellijn	Cellijn opgesteld in het Nationaal Instituut voor Oncologie, Warschau, beschreven in Balcerak et al., 2019		MCF7-cellijn metHAX1knockdown
MCF7-cellijn (CONTROLE)	ATCC	ATCC HTB-22	epitheliale, adherente borstkankercellijn
Olympus CK2 lichtmicroscoop	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	konijn, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC-conjugaat	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actinelabeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma-base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocale microscoop	Zeiss