Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Summary

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Abstract

De hier gepresenteerde methoden kwantificeren enkele parameters van aanhangende celmonolagen van meerdere op de juiste wijze vastgehouden confocale afbeeldingen: hechting aan het substraat als functie van het aantal en de grootte van focale verklevingen en celvorm, gekenmerkt door de celvormindex en andere vormbeschrijvingen. Focale verklevingen werden gevisualiseerd door paxilline kleuring en cel-cel grenzen werden gekenmerkt door knooppunt plakoglobine en actin. De methoden voor celkweek en kleuring waren standaard; afbeeldingen vertegenwoordigen afzonderlijke brandpuntsvlakken; beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare software voor beeldverwerking. De gepresenteerde protocollen worden gebruikt om het aantal en de grootte van focale verklevingen en de verschillen in celvormverdeling in de monolagen te kwantificeren, maar ze kunnen opnieuw worden gebruikt voor de kwantificering van de grootte en vorm van een andere afzonderlijke cellulaire structuur die kan worden gekleurd (bijvoorbeeld mitochondriën of kernen). Het beoordelen van deze parameters is belangrijk bij de karakterisering van de dynamische krachten in de hechtende cellaag, inclusief celhechting en actomyosinecontractiliteit die de celvorm beïnvloedt.

Introduction

Epitheelcelmonolagen fungeren als een collectief waarin celcel- en celsubstraathechting en contractielkrachten en spanningen belangrijke parameters vertegenwoordigen en hun juiste evenwicht bijdraagt aan de algehele integriteit van eenheid^1,2,3. Het beoordelen van deze parameters is dus een manier om de huidige status van de cellaag vast te stellen.

De twee hier beschreven methoden vertegenwoordigen een tweedimensionale analyse van de samenvloeiende monolagen van aanhangende, epitheelcellen (in dit geval MCF7 borstkankercellijn). De analyse wordt u....

Protocol

1. Voorbereidende stappen

1. Celzaaien om confluent monolagen te verkrijgen
   1. Vóór het zaaien, bestrijk de putten van een 4-putten kamer dia met collageen I (of andere ECM component van keuze). Voor collageen I coating, volg een commercieel protocol: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html bij een concentratie van 8 μg/cm².
   2. Zaad 400.000 cellen tot een put van een 4-well kamer dia.
   3. Kweek de cellen 24 uur (of langer, afhankelijk van de experimentele eindpunten) voordat ze vlekken, in een couveuse bij 37 °C, 5% CO₂. Deze stap zorgt voor een rijping van celc....

Results

Focale adhesieanalyse
De knockdown van het HAX1-gen bleek eerder van invloed te zijn op focale verklevingen⁶. Cellen werden gekweekt op collageen I-gecoate oppervlak voor 48 uur. Beelden van de MCF7 controlecellen en MCF7 cellen met een HAX1 knockdown(HAX1 KD) van drie onafhankelijke experimenten gekleurd met focale adhesie eiwit paxilline werden verkregen met behulp van een confocale microscoop (afbeelding van single focal plane / Z-slice basale regi.......

Discussion

Celcel- en celsubstraathechting vormen inherente kenmerken van de epitheelcellen en spelen de cruciale rol in weefselmorfogenese en embriogenese. In volwassen weefsels is de juiste regulatie van mechanische eigenschappen van de cellaag cruciaal bij het handhaven van homeostase en het voorkomen van pathologische reacties zoals tumorprogressie en metastase. De grootte en het aantal brandpuntsverklevingen zijn afhankelijk van de sterkte van de hechting van het celsubstraat, terwijl de celvorm afhankelijk is van contractiele.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss