Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Flowcytometriebenadering om fagocytische eigenschappen van acuut geïsoleerde volwassen microglia en hersenmacrofagen in vitro te karakteriseren

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

23 juni 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

In dit artikel

Samenvatting

Beoordeling van fagocytische eigenschappen van microglia en hersenmacrofagen kan een waardevolle functionele dimensie bieden aan moleculaire profileringsstudies. We beschrijven een gevalideerd protocol dat flowcytometrie gebruikt om snel en betrouwbaar fagocytose van fluorescerende microsferen en amyloïde bètafibrillen te kwantificeren door acuut geïsoleerde microglia en hersenmacrofagen uit muismodellen.

Samenvatting

Microglia en centrale zenuwstelsel (CZS)-infiltrerende macrofagen, gezamenlijk CZS mononucleaire fagocyten (CZS-MP's) genoemd, spelen een centrale rol bij neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie en beroerte. CZS-MP's zijn betrokken bij de fagocytaire klaring van pathologische eiwitten, puin en neuronale synapsen, elk met verschillende onderliggende moleculaire routes. Het karakteriseren van deze fagocytische eigenschappen kan een functionele uitlezing opleveren die de moleculaire profilering van microglia aanvult met behulp van traditionele flowcytometrie, transcriptomics en proteomics-benaderingen. Fagocytische profilering van microglia is gebaseerd op microscopische visualisatie en in vitro culturen van neonatale microglia bij muizen. De eerste benadering lijdt aan beperkte bemonstering, terwijl de laatste benadering inherent een slechte afspiegeling is van de werkelijke in vivo toestand van volwassen CZS-MP's. Dit artikel beschrijft geoptimaliseerde protocollen voor het fenotype van fagocytische eigenschappen van acuut geïsoleerde muizen CZS-MP's door middel van flowcytometrie. CNS-MP's worden acuut geïsoleerd uit de hersenen van volwassen muizen met behulp van mechanische dissociatie gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie, geïncubeerd met fluorescerende microsferen of fluorescerende Aβ-fibrillen, gewassen en vervolgens gelabeld met panels van antilichamen tegen oppervlaktemarkers (CD11b, CD45). Met behulp van deze benadering is het mogelijk om fagocytische eigenschappen van microglia in de hersenen te vergelijken met CZS-infiltrerende macrofagen en vervolgens het effect van veroudering en ziektepathologie op deze fagocytische fenotypes te beoordelen. Deze snelle methode heeft ook het potentieel om acuut geïsoleerde menselijke CZS-MP's te fenotyperen uit postmortale of chirurgische hersenmonsters. Bovendien kunnen specifieke mechanismen van fagocytose door CZS-MP-subgroepen worden onderzocht door bepaalde fagocytische routes te remmen.

Inleiding

De aangeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) bestaan voornamelijk uit microglia en infiltrerende monocyten/macrofagen, samen de CZS-mononucleaire fagocyten (CZS-MP's) genoemd1. CZS-MP's zijn betrokken bij neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), neuro-inflammatoire aandoeningen en beroerte 2,3,4. CZS-MP's hebben, samen met astrocyten, pericyten en ependymale cellen, fagocytische functies 5,6. In hun homeostatische toestand zijn CZS-MP's betrokken bij constante bewaking van de lokale micro-omgeving, samen met fagocytische klaring van apoptotisch celafval en eiwitten, en synaptisch snoeien om neuronale verbindingen te hermodelleren 7,8,9,10. Bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals AD nemen CZS-MP's verschillende ziekte-geassocieerde moleculaire en functionele fenotypes aan die pathologische rollen kunnen spelen, waaronder klaring van geaggregeerde amyloïde-bèta (Aβ) en neuronale elementen, evenals inflammatoire cytokine- en factorafgifte, wat resulteert in complexe pro-inflammatoire, schadelijke en ontstekingsremmende, beschermende rollen 11,12,13,14. Fagocytose van macrodeeltjes, cellulair afval, eiwitten en andere infectieuze deeltjes door CZS-MP's wordt gemedieerd door verschillende receptoren die op hun oppervlak tot expressie komen9. Verstoring van deze fagocytische routes kan leiden tot defecte klaring en progressieve accumulatie van Aβ, wat uiteindelijk leidt tot progressieve neuronale schade in AD 4,9. Hoewel de vooruitgang in moleculaire profilering van CZS-MP's met behulp van transcriptomische en proteomische benaderingen onschatbare inzichten heeft opgeleverd in de moleculaire heterogeniteit binnen CZS-MP's bij neurologische aandoeningen15,16, ontbreekt momenteel functionele karakterisering van de fagocytische eigenschappen van CZS-MP's en hun subsets. Functionele karakterisering van de fagocytische eigenschappen van CZS-MP's kan moleculaire profileringsstrategieën aanvullen, betere functionele fenotypering mogelijk maken en helpen bij het beoordelen van de werkzaamheid van therapieën die defecte fagocytose in ziektemodellen kunnen corrigeren17.

Traditionele fagocytosetesten voor CZS-MP's omvatten het incuberen van primaire microglia samen met fluorescerende substraten zoals Aβ of latex/polystyreendeeltjes. Fagocytose wordt vervolgens bestudeerd als een functie van de opname van het fluorescerende substraat met behulp van immunofluorescentiemicroscopie 18,19,20. Het is algemeen bekend dat CZS-MP's, wanneer ze in lange culturen worden gehouden, hun morfologie en transcriptieprofielen drastisch kunnen veranderen21,22. Dit belemmert het bestuderen van de fagocytische eigenschappen van CZS-MP's in hun representatieve toestand in het CZS. Een functionele flowcytometrietest om acuut geïsoleerde levende CZS-MP's te profileren, kan een snelle beoordeling van fagocytische eigenschappen bieden en kan een veel grotere pool van CZS-MP's bemonsteren dan microscopiebenaderingen 9,23. Bovendien elimineert flowcytometrie de noodzaak om de CZS-MP's in cultuur te houden en biedt het een platform om fagocytotische eigenschappen in verschillende subpopulaties van CZS-MP's te bestuderen. Dit manuscript beschrijft geoptimaliseerde protocollen voor het fenotype van fagocytische eigenschappen van acuut geïsoleerde muizen CZS-MP's door middel van flowcytometrie. Het aanpassen van fagocytosetesten met behulp van flowcytometrie maakt een snelle multiplexing van het fagocytische fenotype van CZS-MPS mogelijk in combinatie met immuunfenotypering, waardoor inzicht wordt verkregen in de heterogeniteit van fagocytische eigenschappen binnen CZS-MPS bij de resolutie van één cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle muizenstudies werden uitgevoerd na goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Emory University, en in strikte overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health.

1. Voorbereiding op de dag van isolatie

  1. Bereid een ijsemmer voor om alle reagentia, buffers en celsuspensies koud te houden tijdens de isolatieprocedure.
  2. Plaats de fles met 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (minimaal 1 L) gedurende 30 minuten tot 1 uur voorafgaand aan de perfusie op 4 °C en bewaar 1× PBS op ijs tijdens de perfusie- en isolatieprocedure.
  3. Bereid de werkconcentratie van het dichtheidsgradiëntmedium voor (aangeduid als 35% SIP, zie materiaaltabel).
  4. Label alle conische en flowcytometriebuizen die in het experiment zijn gebruikt voorafgaand aan de celisolatie om vertragingen in de verwerkingstijden te voorkomen. Verzamel bovendien alle andere benodigdheden die nodig zijn voor de isolatie voorafgaand aan de perfusie, zoals 40 μm celzeefjes, spuiten en naalden.

2. Acute isolatie van volwassen muizenmicroglia

  1. Verdoof een volwassen muis door de muis in een glazen inductiekamer met isofluraan (5 ml) te plaatsen totdat de muis stopt met ademen en niet meer reageert op het beknellen van de achterpoot.
  2. Gebruik een naald van 26 g en een spuit van 10 ml om hartperfusie uit te voeren met 30 ml ijskoude 1× PBS totdat er geen zichtbaar bloed meer is.
  3. Onthoofd de muis met een chirurgische schaar. Gebruik een kleine schaar om de huid te knippen en de schedel bloot te leggen. Verwijder de schedel zonder het hersenweefsel te beschadigen zoals beschreven24. Verwijder de hersenen onmiddellijk en breng ze over naar een steriele celzeef van 40 μm die bovenop een conische buis van 50 ml wordt geplaatst.
  4. Gebruik de achterkant van de zuiger van een spuit van 3 ml om de hersenen door de zeef te duwen en het hele hersenweefsel mechanisch te dissociëren. Was de celzeef en zuiger tijdens de dissociatie met tussenpozen met 2 ml ijskoude 1× PBS elke keer om ervoor te zorgen dat al het weefsel door de zeef gaat.
  5. Schraap met de zuiger over de bodem van de celzeef om eventuele resterende suspensie in de conische suspensie op te vangen. Spoel de celzeef grondig met ijskoude 1× PBS en giet de suspensie in de conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Bij het in serie verwerken van meerdere dieren de celsuspensies op ijs plaatsen tot verdere verwerking.
  6. Voeg ijskoud 1× PBS toe om het celsuspensievolume op 30 ml te brengen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 × g bij 4 °C.
  7. Giet het bovenstaande af zonder de pellet te verstoren en suspendeer de pellet opnieuw in 6 ml 35% SIP met een serologische pipet van 10 ml. Breng het mengsel van celsuspensie + 35% SIP over in een nieuwe conische buis van 15 ml en centrifugeer bij 800 × g gedurende 25 minuten bij 15 °C zonder rem.
    LET OP: Wees extra voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan tijdens het opnieuw ophangen. Overmatige bubbels kunnen schadelijk zijn voor de celopbrengst.
  8. Verwijder voorzichtig de conische buis van 15 ml uit de centrifuge zonder de lagen te verstoren en zuig de bovenste zwevende myelinelaag op.
  9. Breng het mengsel van celsuspensie + 35% SIP met behulp van een serologische pipet van 10 ml over in een nieuwe conische buis van 50 ml met 30 ml ijskoude 1× PBS en centrifugeer bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het bovenstaande voorzichtig weg en laat de celpellet achter samen met 500-800 μL 1× PBS.
  10. Suspendeer de celpellet opnieuw door voorzichtig op en neer te pipetteren met een p1000-pipet en breng over naar een buis met ronde bodem van 5 ml. Voeg 2 ml ijskoude 1× PBS toe aan de ronde bodembuis en centrifugeer 2 minuten bij 1.400 × g bij 4 °C. Giet het supernatant snel af, zodat de celpellet met CZS-MPS ongeveer 100 μL 1× PBS bevat (Figuur 1).

3. Opstelling van fagocytose en flowcytometrische kleuring

  1. Breng 20 μL (≈200.000 cellen) van de opnieuw gesuspendeerde CNS-MP's over naar een verse buis van 5 ml met ronde bodem en voeg 80 μL ijskoude 1× PBS toe. Voeg geen fluorescerende substraten of flowcytometrie-antilichamen toe aan deze buis. Deze cellen dienen als negatieve controle om de achtergrondfluorescentie van CZS-MP's te bepalen voor flowcytometrie-analyses.
  2. Om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde CZS-MP's vast te stellen, gebruikt u op amine gebaseerde levende/dode kleurstoffen (bijv. fixeerbare blauwe UV).
    1. Resuspendeer de rest van de celpellet in 500 μl 1× PBS en voeg 1 μl van de gereconstitueerde kleurstof toe aan elke monsterbuis, met uitzondering van de negatieve controle.
    2. Draai voorzichtig vortex, bedek de buizen met folie en incubeer ze 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 ml 1× PBS toe aan elke buis en draai voorzichtig.
    3. Centrifugeer de cellen bij 1.400 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Giet het bovenstaande snel af en suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μL 1× PBS.
      OPMERKING: Op amine gebaseerde kleurstoffen binden zich aan de extracellulaire Aβ-fibrillen, waardoor de resultaten van fagocytose worden verstoord. Andere levende/dode indicatoren kunnen de fluorescentie van Aβ-fibrillen/microsferen verstoren. Daarom wordt geadviseerd om de Live/dead indicator alleen te gebruiken in voorbereidende experimenten om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde CZS-MP's vast te stellen.
  3. Draai de buis met PE-polystyreenmicrosferen grondig door en voeg 2 μL (≈200 microsferen/cel) toe aan 100 μL celsuspensie in flowbuizen, met uitzondering van de negatieve controle. Draai elke buis voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van het substraat met de cellen te garanderen en plaats de buizen met ronde bodem 30 minuten in een steriele bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 .
    1. Draai en incubeer de negatieve regelbuis voorzichtig om vergelijkbare experimentele omstandigheden tussen positieve en negatieve monsters te garanderen.
      OPMERKING: Als u Aβ-fibrillen gebruikt in plaats van PE-microsferen, bereid dan fluorescerende HiLyte488 Aβ-fibrillen voor zoals eerder beschreven9. De uiteindelijke concentratie van Aβ-fibrillen is 200 μM, die vervolgens wordt verdund om verse 20 μM-bouillon in PBS van fluorescerende Aβ-monomeren te bereiden. Voeg 12,5 μL van de 20 μM voorraad Aβ-monomeren toe aan elk buisje met geïsoleerde cellen.
  4. Verwijder de cellen uit de broedmachine en voeg 1 ml 1× PBS toe aan elke buis en draai voorzichtig. Centrifugeer de cellen bij 1.400 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C en giet het supernatant snel af. Herhaal de wasbeurt met 1 ml 1× PBS, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.400 × g , giet de bovenstaande af en suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μl 1× PBS.
    OPMERKING: Na elke draaiing is het belangrijk om de cellen op ijs te houden om de voortdurende opname van fagocyten te remmen.
  5. Vortex de flowcytometrie-antilichamen en centrifugeer ze gedurende 10 s in een microcentrifuge. Voeg aan elke celsuspensiebuis 1 μL CD11b-APC/Cy7 en CD45-PE/Cy7 toe voor Aβ-fagocytosetest, of CD45-FITC voor PE-microsfeerfagocytose. Draai elke buis voorzichtig voort en broed 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Gebruikers kunnen ook een aparte buis met krachtige fagocytische cellen zoals gekweekte BV2-microglia of peritoneale macrofagen als positieve controle opnemen en deze behandelen met PE-microsferen en flowcytometrische antilichamen zoals hierboven beschreven. Gegevens van dit monster kunnen worden gebruikt om de positieve controle te definiëren die echte fagocytose aangeeft in voorbereidende experimenten.
  6. Terwijl de cellen zich in de incubatie bevinden, stelt u compensatiebuizen in met behulp van vier ronde bodembuizen van 5 ml. Draai de compensatieparels grondig door en voeg 1 druppel toe aan elke buis. Voeg 1 μL CD11b-APC/Cy7 toe aan de eerste buis en CD45-FITC aan de tweede buis. Voeg 1 μL PE-polystyreen toe aan de derde buis en houd ongekleurde compensatieparels in de vierde buis. Gebruik deze vierde buis als negatieve controle om een compensatiepaneel op de flowcytometer in te stellen.
    OPMERKING: Wanneer Aβ-fibrillen worden gebruikt om fagocytose te bestuderen, voeg dan CD45-PECy7 toe aan de tweede buis in plaats van CD45-FITC. Voeg 1 μL afzonderlijk FITC-gelabeld flowcytometrie-antilichaam of FITC-secundair antilichaam (elke soort) toe aan de derde compensatiebuis. Dit is belangrijk omdat de kralen niet kunnen binden aan Aβ-fibrillen en worden weggespoeld bij het wassen van de compensatiebuisjes.
  7. Laat de compensatiekorrels gedurende ten minste 10 minuten met hun respectievelijke antilichamen incuberen. Voeg na de incubatie 1 ml 1× PBS toe aan elke buis, centrifugeer bij 1.400 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en giet snel het supernatant af. Plaats de compensatiebuizen op ijs en bedek ze met de folie tot flowcytometrie.
  8. Was de gekleurde cellen na incubatie met flowcytometrie-antilichamen met 1 ml 1× PBS. Draai de cellen voorzichtig voort en centrifugeer ze gedurende 2 minuten bij 1.400 × g bij 4 °C. Giet het bovenstaande snel af en herhaal de wasbeurt met 1 ml 1× PBS. Giet na het centrifugeren het bovenstaande af en suspendeer de celpellet opnieuw in 100 μl 1× PBS.
  9. Plaats de monsterbuisjes op ijs en bedek ze met de aluminiumfolie tot flowcytometrie.
    OPMERKING: Gebruik 1× PBS (pH 7,0) zonder Ca2+/Mg2+ als stroombuffer gedurende het hele experiment. Zorg ervoor dat foetaal runderserum (FBS) in de flowbuffer wordt uitgesloten om mogelijke microgliale activering te voorkomen.

4. Flowcytometrie en -analyse

  1. Instellen en compenseren van instrumenten
    OPMERKING: De experimenten in dit manuscript werden uitgevoerd op een flowcytometer met ultraviolette, violette, blauwe, geelgroene en rode lasers. Dit experiment kan ook worden aangepast aan flowcytometers met drie lasers met alleen blauwe, geelgroene en rode lasers. Gebruikers moeten een formele training volgen voordat ze het instrument kunnen hanteren.
    1. Vul de buffertank van de debietmantel bij en zet de cytometer aan. "Prime" de cytometer met een ronde bodembuis van 5 ml met ddH2O. Log in op de analysesoftware op de computer die is aangesloten op de flowcytometer. Maak een "experiment" en selecteer FSC, SSC, FITC, PECy7 en APC-Cy7 als parameters. Als u PE-microsferen gebruikt, selecteert u PE in plaats van PECy7 in het parameterpaneel.
    2. Maak een geschikt compensatiepaneel.
      OPMERKING: In onze experimenten liggen de FSC/SSC-spanningen voor compensatieparels doorgaans rond de 350/280, terwijl de FSC/SSC-spanningen voor CNS-MP's rond de 320/260 liggen. Deze waarden kunnen variëren tussen twee verschillende cytometers en moeten voorafgaand aan het eigenlijke experiment worden gekalibreerd.
    3. Reconstitueer elke compensatie- en celsuspensiebuis met 500 μL 1× PBS, draai kort en plaats op ijs. Laat de negatieve controle/niet-gekleurde kralenbuis draaien om de juiste spanningen in te stellen zodat de piek op elk fluorofoorhistogram lager is dan 102. Laat de andere eenkleurige compensatiebuizen draaien om hun duidelijke positieve pieken te identificeren.
      OPMERKING: Er moet ten minste een half log (grondtal 10) verschil zijn tussen de positieve en negatieve pieken van elke fluorofoor.
    4. Registreer 5000 gebeurtenissen van elke compensatiebuis zodat de computer de compensatie-instelling automatisch kan berekenen. Koppel de compensatie-instelling aan het huidige experiment25.
    5. Maak een nieuwe "buis" onder het tabblad Sample. Draai voorzichtig en laat de negatieve stuurbuis met ongekleurde CNS-MP's draaien. Pas de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsspanningen aan om de populatie van interesse vast te leggen. Neem de gebeurtenissen op en sub-gate op de live CNS-MP's zoals hieronder vermeld.
    6. Leg gebeurtenissen van alle volgende buizen vast en registreer ze als afzonderlijke bestanden, waarbij de parameters en spanningen consistent blijven. Draai elke buis voorzichtig voordat u ze op de flowcytometer laat lopen.
  2. Afschermingsstrategie en meting van fagocytose
    1. Teken een eerste mononucleaire poort om alle CNS-MP's te vangen. Deze levende mononucleaire cellen moeten in de volgende grafiek worden afgeschermd om alleen afzonderlijke cellen te bevatten, met uitzondering van coupletten en drietallen.
    2. Projecteer de gated single, live CNS-MPS-populatie op een volgende grafiek die CD11b- en CD45-fluoroforen weergeeft.
      OPMERKING: Microglia in de hersenen zijn meestal CD11b+CD45-intermediair, terwijl infiltrerende macrofagen CD11b+CD45 hoog zijn. Aanvullende markers zoals Ly6c kunnen in het panel worden opgenomen om inflammatoire monocyten (Ly6choog en CD45hoog) verder met vertrouwen te scheiden van microglia (Ly6claag CD45intermediair).
    3. Pas de juiste poorten toe om fagocytose in de respectieve populaties verder te bestuderen, zoals weergegeven in figuur 2F.
      OPMERKING: Fagocytose bij CZS-MP's wordt gemeten als functie van hun Hilyte488/Alexa488 (Aβ) of PE (microsfeer) fluorescentie-opname. Een duidelijke positieve piek op hun respectievelijke histogrammen geeft aan dat de CZS-MP's het substraat hebben gefagocyteerd. De hoeveelheid gefagocyteerd materiaal is recht evenredig met de intensiteit van de fluorescentie. Daarom moet de aanwezigheid van meerdere pieken worden geïnterpreteerd als hogere fagocytose. Deze kunnen vervolgens worden bevestigd door immunohistochemie.
    4. Nadat u alle monsterbuisjes op de flowcytometer hebt geregistreerd, exporteert u de gegevensbestanden in .fcs-formaat voor verdere analyse.
  3. Analyse van statistische gegevens
    1. Gebruik elke software voor flowcytometrie-analyse samen met spreadsheets en statistische analysesoftware voor alle gegevensanalyses.
    2. Voeg de .fcs-bestanden toe aan de analysesoftware en dubbelklik op het eerste bestand. Een grafiek met alle opgenomen
      Evenementen verschijnen. Volg een vergelijkbare poortstrategie zoals weergegeven in figuur 2 om vervolgens enkele, levende mononucleaire cellen te gaten en fagocytose te bestuderen op een specifieke populatie, bijvoorbeeld CD11b+CD45intermediaire microgliale cellen (Figuur 2H).
      OPMERKING: De fagocytaire index wordt beoordeeld op basis van het percentage cellen dat fluorescerende Aβ-fibrillen of ≥1-microbolletjes) internaliseert. Zoals eerder gedefinieerd, is fagocytose op laag niveau de opname van ten minste 1 microsfeer en is fagocytose op hoog niveau >1 korrelopname 8,9. Op basis van eerdere experimenten remt remming van actine-afhankelijke processen door cytochalasine D de opname van >1 kralen volledig en remt gedeeltelijk de opname van 1 kralen9, evenals de opname van Aβ volledig, wat de actine-afhankelijke fagocytische opname bevestigt in plaats van passieve binding aan het celoppervlak. Immunocytochemie bevestigt ook dat elke sequentiële piek in de microsfeertest representatief is voor een unitaire toename van het aantal gefagocyteerde kralen 8,9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om typische resultaten van fagocytische opname van microsferen en Aβ42-fibrillen door acuut geïsoleerde CZS-MP's te illustreren, werden acuut geïsoleerde CZS-MP's verkregen uit de ipsilaterale hemisfeer na voorbijgaande middelste cerebrale arteriële occlusie (MCAO)8. Voor details over fagocytische eigenschappen van CNS-MP's in het MCAO-model, verwijzen wij u naar eerdere publicaties8. In het kort, na een herstel van 72 uur werden CZS-MP's a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Flowcytometrie is een techniek die de expressie van eiwitten of markers van belang op het celoppervlak of in intracellulaire compartimenten kan detecteren met behulp van fluorescerend gelabelde sondes (meestal antilichamen) om deze markers van belang te labelen. Celoppervlak- of intracellulaire antilichamen worden meestal geconjugeerd met laser-exciteerbare fluorochromen die unieke emissiespectra hebben. Cellen die met deze antilichamen zijn geïncubeerd, kunnen worden gecategoriseerd in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De studie werd ondersteund door NIH-prijzen aan Dr. Rangaraju (NINDS K08 NS099474-1 en R01 NS114130-01A1) en Dr. Rayaprolu (NIA F32AG064862). Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Emory Flow Cytometry Core (EFCC), een van de Emory Integrated Core Facilities (EICF) en wordt gesubsidieerd door de Emory University School of Medicine. Aanvullende ondersteuning werd geboden door de Georgia Clinical & Translational Science Alliance van de NIH (UL1TR002378). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)ThermoFisher14065056Bewaar bij 4 °C. Gebruikt om SIP te maken zoals beschreven in het protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)ThermoFisher14175095Bewaar bij 4 °C. Gebruikt om 35% SIP te maken zoals beschreven in het protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Bewaar 10xPBS bij kamertemperatuur. Bereid vers 1xPBS door één deel 10xPBS te verdunnen tot negen delen MilliQ dH20 en bewaar het een uur bij 4 °C voor gebruik. Zorg ervoor dat de pH van de 1xPBS 7,0 is vóór koeling.
35% SIPOm 20 mL van 35% SIP te maken, gebruik 7 mL van SIP en 13 mL van ijskoud 1× HBSS. Bewaar op ijs tot verdere verwerking
APC-Cy7 rat anti-CD11bBD Pharmingen557657Bewaar bij 4 °C of bewaar op ijs tijdens gebruik. Bescherm tegen licht. Flow cytometry verdunning - 1:100
FITC rat anti mouse CD145BD Pharmingen553080Bewaar bij 4 °C of bewaar op ijs tijdens gebruik. Bescherm tegen licht. Flow cytometry verdunning - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermoFisherL34961Bewaar bij -20 °C. Voeg 50ul DMSO toe aan één buis van de kleurstof, meng goed en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 1 min. Maak 10µL aliquoten en bewaar deze bij -20 °C. Gebruik een vers aliquot voor elk experiment en voeg toe aan de monsters bij een verdunning van 1:500.
OneComp eBeads compensatiebeadsThermoFisher01-1111-42Bewaar bij 4 °C, meng de buis grondig door voordat u het toevoegt aan de monsterbuis(sen), bewaar op ijs tijdens gebruik.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145BD Pharmingen552848Bewaar bij 4 °C of bewaar op ijs tijdens gebruik. Bescherm tegen licht. Flow cytometry verdunning - 1:100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP1644Bewaar bij 4 °C. Om 10 mL Standard Isotonic Percoll (SIP) te maken: Gebruik 9 mL koude Percoll en 1 mL koude 10× HBSS.
Phycoerythrine-geconjugeerde microspheresThermoFisherF13083Bewaar bij 4 °C of bewaar op ijs tijdens gebruik.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - gelabeld, HumanAnaSpecAS-60479-01De uiteindelijke concentratie van Ab fibrils is 200µM die vervolgens wordt verdund voor gebruik. Bewaar bij -20 °C. Bereid voor elk experiment een verse werkoplossing.

Referenties

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van microgliamononucleaire fagocyten van het centrale zenuwstelselmechanische dissociatiedichtheidsgradi ntcentrifugatiefluorescente microsferenlabeling van oppervlaktemarkersCD11b CD45
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.