Methodenartikel

Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking

DOI:

10.3791/61478

⸱

25 juni 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora capsici is een verwoestende oomycete ziekteverwekker die veel belangrijke solanaceous en cucurbit gewassen veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen in de plantaardige productie jaarlijks beïnvloedt. Phytophthora capsici is bodemgedragen en een hardnekkig probleem in groentevelden als gevolg van de langlevende overlevingsstructuren (oospores en chlamydosporen) die verwering en afbraak weerstaan. De belangrijkste methode van verspreiding is door de productie van zoösporen, die eencellige, gevlagde sporen die kunnen zwemmen door dunne films van water aanwezig op oppervlakken of in met water gevulde bodem poriën en kan zich ophopen in plassen en vijvers. Daarom kunnen irrigatievijvers een bron zijn van de ziekteverwekker en de eerste punten van ziekte-uitbraken. Detectie van P. capsici in irrigatiewater is moeilijk met behulp van traditionele cultuur gebaseerde methoden, omdat andere micro-organismen aanwezig in het milieu, zoals Pythium spp., meestal overwoekeren P. capsici waardoor het niet op te sporen. Om de aanwezigheid van P. capsici sporen in waterbronnen (irrigatiewater, afvloeiing, enz.) te bepalen, ontwikkelden we een handpompgebaseerde filterpapier (8-10 μm) methode die de sporen van de ziekteverwekker (zoösporen) vangt en later wordt gebruikt om het DNA van de ziekteverwekker te versterken door middel van een nieuwe lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) assay ontworpen voor de specifieke versterking van P capsici. Deze methode kan versterken en detecteren DNA uit een concentratie zo laag als 1,2 x 102 zoösporen / mL, dat is 40 keer gevoeliger dan conventionele PCR. Er werd geen kruisversterking verkregen bij het testen van nauw verwante soorten. LAMP werd ook uitgevoerd met behulp van een colorimetrische LAMP master mix kleurstof, het weergeven van resultaten die kunnen worden gelezen met het blote oog voor on-site snelle detectie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere ziekteverwekkers die zich bevinden, accumuleren of verspreid zijn via verontreinigde irrigatiesystemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het recyclen van water in boerderijen en kwekerijen wordt steeds populairder door de stijging van de waterkosten en de milieuproblemen achter het watergebruik. Er zijn veel irrigatiemethoden ontwikkeld voor telers om de verspreiding en het optreden van plantenziekten te verminderen. Ongeacht de bron van het water (irrigatie of neerslag), afvloeiing wordt gegenereerd, en veel groente-en kwekers hebben een vijver te verzamelen en te recyclen runoff1. Hierdoor ontstaat een reservoir voor mogelijke pathogene accumulatie ten gunste van de verspreiding van ziekteverwekkers wanneer het gerecycleerde water wordt gebruikt om gewassen te irrigeren2,3,4. Oomycete plant pathogenen in het bijzonder profiteren van deze praktijk als zoösporen zal zich ophopen in water en de primaire dispersieve spore is zelf-motile, maar vereist oppervlaktewater5,6,7. Phytophthora capsici is een oomycete pathogene die een aanzienlijk aantal solanaceous en cucurbit gewassen op verschillende manieren beïnvloedt8. Vaak zijn de symptomen demping-off van zaailingen, wortel en kroonrot; echter, in gewassen zoals komkommer, pompoen, meloen, pompoen, watermeloen, aubergine en peper, hele oogsten kunnen verloren gaan als gevolg van fruitrot9. Hoewel er bekende methoden zijn om deze plantenpathogen te detecteren, vereisen de meeste een infectie die al heeft plaatsgevonden, wat te laat is om preventieve fungiciden een significant effect te hebben10.

De traditionele methode om irrigatiewater te testen op de detectie en diagnose van gerichte micro-organismen is een verouderde aanpak wanneer snelheid en gevoeligheid cruciaal zijn voor succes en winstgevende gewasproductie11,12. Plantweefsel dat gevoelig is voor de beoogde ziekteverwekker (bijvoorbeeld aubergine voor P. capsici)is bevestigd aan een gemodificeerde val die gedurende langere tijd in een irrigatievijver wordt opgehangen voordat het wordt verwijderd en gecontroleerd op infectie. Monsters van het plantenweefsel worden vervolgens verguld op semi-selectieve media (PARPH) en geïncubeerd voor groei van de cultuur, dan morfologische identificatie wordt uitgevoerd met behulp van een samengestelde microscoop13. Er zijn andere soortgelijke detectiemethoden voor andere plantpathogenen met behulp van selectieve media en plating kleine hoeveelheden verontreinigd water voor sub-culturing14,15. Deze methoden vereisen overal van 2 tot 6 weken, verschillende rondes van sub-culturing om het organisme te isoleren, en ervaring op Phytophthora diagnostiek te kunnen de belangrijkste morfologische kenmerken van elke soort te herkennen. Deze traditionele methoden werken niet goed voor de detectie van irrigatiewater besmet door P. capsici als gevolg van factoren zoals interferentie door andere micro-organismen die ook aanwezig zijn in de waterbronnen. Sommige snelgroeiende micro-organismen zoals Pythium spp. en door water overgedragen bacteriën kunnen overwoekeren op de plaat waardoor P. capsici niet op te sporen16,17.

Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een gevoelige en specifieke moleculaire methode die kan worden gebruikt in zowel veld- als laboratoriumomgevingen om P. capsici zoosporen in irrigatiewater te detecteren. Het protocol omvat de ontwikkeling van een nieuwe lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) primer set in staat om specifiek versterken P. capsici, gebaseerd op een 1121-base paar (bp) fragment van P. capsici18,19. Een eerder ontwikkelde LAMP primer van Dong et al. (2015) werd gebruikt in vergelijking met de test die werd ontwikkeld voor deze studie20.

De LAMP-test is een relatief nieuwe vorm van moleculaire detectie waarvan is aangetoond dat deze sneller, gevoeliger en specifieker is dan conventionele polymerasekettingreactie (PCR)21. In het algemeen kunnen conventionele PCR-tests niet onder 500 kopieën (1,25 pg/μL) worden gedetecteerd; in tegenstelling, eerdere studies hebben aangetoond dat de gevoeligheid van LAMP kan 10 tot 1.000 keer hoger zijn dan conventionele PCR en kan gemakkelijk detecteren zelfs 1 fg/μL van genomische DNA22,23. Bovendien kan de test snel worden uitgevoerd (vaak in 30 minuten) en on-site (in het veld) met behulp van een draagbaar verwarmingsblok voor versterking en een colorimetrische kleurstof die van kleur verandert voor een positief monster (waardoor de noodzaak van elektroforese wordt verwijderd). In deze studie hebben we de gevoeligheid van PCR- en LAMP-tests vergeleken met behulp van een filterextractiemethode. De voorgestelde detectiemethode stelt onderzoekers en extensiemiddelen in staat om de aanwezigheid van P. capsici sporen uit verschillende waterbronnen in minder dan twee uur gemakkelijk te detecteren. De test is bewezen gevoeliger te zijn dan conventionele PCR en werd ter plaatse gevalideerd door de aanwezigheid van de ziekteverwekker in het irrigatiewater te detecteren dat door een teler wordt gebruikt. Deze detectiemethode zal telers in staat stellen om de aanwezigheid en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker in verschillende waterbronnen te schatten die worden gebruikt voor irrigatie, waardoor verwoestende uitbraken en economische verliezen worden voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. On-site detectie van Phytophthora capsici uit irrigatiewater met behulp van draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking

  1. Het instellen van de pomp en het filter
    1. Bevestig een filterfles aan een buis die is aangesloten op een handpomp, zodat wanneer de pomp wordt geactiveerd, de lucht via de mond van de filterfles naar binnen wordt getrokken.
    2. Plaats de Buchner trechter in de rubberen stop in de mond van de filterfles en plaats het juiste formaat stuk filterpapier in de Buchner trechter, zodat de lucht door het filterpapier wordt getrokken. Het filterpapier moet een retentiegrootte van 15 μm hebben.
      LET OP: Het filterpapier moet aan de randen van de Buchner trechter passen, zodat er minimaal water over het filterpapier stroomt.
  2. Waterbemonstering en -filtering
    1. Neem watermonsters van de beoogde bron. Water kan kleine hoeveelheden puin hebben, maar geen significant sediment of bodem.
    2. Giet tot 1.000 mL (1 liter) testwater over het filterpapier dat langzaam genoeg in de Buchnertrechter is geplaatst om overloop te voorkomen, terwijl de handpomp (of vacuüm) wordt gebruikt om een zuigkracht te creëren om het water erdoorheen te trekken.
      OPMERKING: Er is geen minimale hoeveelheid water die kan worden getest met behulp van deze methode, en hoewel het ten minste 50 mL wordt voorgesteld, 1000 mL is het maximum voor deze methode.
    3. Verwijder met behulp van tangen het filterpapier uit de Buchner trechter en snijd het in kleine stukjes met steriele schaar. Voeg zoveel stukken (8-12) toe als kan worden ondergedompeld in de hoeveelheid extractiebuffer (400 μL voor magnetische op kralen gebaseerde extractie) die door het protocol vereist is in een buis van 1,5 mL. Bewaar resterende stukjes filterpapier voor verwerking nadat de eerste set is geëxtraheerd.
    4. Vortex of anderszins roeren de stukken van filter papier en extractie buffer voor 10 s elke minuut gedurende 5 min. Verwijder vervolgens met behulp van tangen het filterpapier dat zo min mogelijk van de extractiebuffer verliest. Herhaal deze stap met de resterende stukjes filterpapier totdat alle stukken zijn vortexed / geagiteerd en gedrenkt in de extractie buffer.
  3. Magnetische kraal-gebaseerde extractie van DNA uit filterpapier
    1. Voeg aan de 1,5 mL-buis (die nu ongeveer 200-300 μL extractiebuffer bevat) 20 μL proteinase K en 10 μL van 10 ng/μL RNase toe.
    2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, vortex of schud de buis om de 3 minuten.
    3. Voeg 500 μL magnetische kralen met de bindingsbuffer toe aan het monster en meng goed door te schudden. Dan incubeer voor 5 min bij kamertemperatuur.
    4. Plaats de buis in het magnetisch scheidingsrek gedurende 2 min totdat alle kralen aan de magneet zijn getrokken. Verwijder en gooi de supernatant weg.
    5. Verwijder de buis van de magnetische afscheider. Voeg 500 μL wasbuffer 1 toe en schort kralen opnieuw op door de buis krachtig te schudden. Wacht op 30 s en plaats de buis terug in de magnetische afscheider. Wacht 2 min tot alle kralen naar de magneet zijn getrokken voordat u de supernatant verwijdert en weggooit.
      OPMERKING: In afwachting van de magnetische kralen te magnetiseren aan de separator, raden wij aan omkeren van de buis, die magnetische kralen vast aan de dop en de zijkanten van de buis kan verjagen en resulteren in een groter aantal kralen worden bevestigd.
    6. Herhaal stap 1.3.5 met 500 μL wasbuffer 2.
    7. Herhaal stap 1.3.5 met 500 μL ethanol.
    8. Luchtdroge de magnetische kraalpellet gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (18-27 °C) met het deksel open. Als de temperaturen het niet toelaten, uitbroeden in een gehandschoende hand met de dop open voor 15 min.
    9. Verwijder de buis van de magnetische afscheider. Voeg 50 μL elutiebuffer toe en hang de kralen opnieuw op door 1 min op en neer te pipetten.
    10. Plaats buis terug in een magnetische afscheider. Wacht 2 minuten voordat u de supernatant overzet zonder de kralen te storen aan een aparte buis voor DNA-opslag.
      OPMERKING: Hier kan het experiment worden onderbroken voordat het verder gaat. Geëxtraheerd DNA moet worden opgeslagen op ijs of in een vriezer van -20 °C.
  4. Toepassing van nieuw ontwikkelde LAMP-test
    1. Bereid lamp primer mix met 0,2 μM van elke F3 en B3 primer, 0,8 μM van elke Loop-F en Loop-B primer, en 1,6 μM van elke FIP en BIP primer (Tabel 2).
    2. Voeg de volgende LAMP-oplossing toe aan één PCR-buis, of aan elke afzonderlijke buis in de 8-buisstrip: 2,5 μL primermix (stap 1.4.1), 12,5 μL LAVA LAMP mastermix, 1 μL geëxtraheerd DNA en 9 μ L ddH2O. Het totale volume is 25 μL.
      OPMERKING: Als u het draagbare versterkingsinstrument (bijvoorbeeld Genie III) met colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) gebruikt, raadpleegt u punt 2.4.2- 2.4.3.
    3. Wijs twee buizen aan als positieve en negatieve controles. Voor de positieve controle, gebruik maken van een controle die door de LAVA LAMP kit, of een bekende positieve DNA-monster. Gebruik voor de negatieve controle ddH2O. Voor beide, vervang de 1 μL van geëxtraheerd DNA voor 1 μL van de positieve controle of ddH2O.
    4. Zet de monsters in een warmteblok (of draagbaar versterkingsinstrument) ingesteld op 64 °C gedurende 45 minuten.
      LET OP: Andere extractiemethoden kunnen hier worden gebruikt in plaats van magnetische kraalgebaseerde extractie. CTAB en een commerciële DNA-extractiekit werden beide met succes getest met behulp van de standaardprotocollen en vervangen de filterpapierstukken voor het plantenmonster24,25. De resultaten werden vergeleken in tabel 2. Als de concentratie van DNA kan worden gekwantificeerd, gebruik tussen 1-10 ng genomic DNA.
  5. Visualisatie van resultaten
    1. Als deze in een laboratoriumomgeving wordt uitgevoerd, bekijkt u de versterkingsproducten door 5 μL van elk monster in een 1% agarosegel te laden, ze in een gelelektroforesemachine te laten draaien en ze in een UV-beeldmachine te plaatsen.
    2. Als een colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) is gebruikt, bekijkt u de kleurwijziging om de resultaten als positief of negatief te bepalen.
    3. Als een draagbaar versterkingsinstrument (bijvoorbeeld Genie III) is gebruikt, bekijkt u de versterkingsgrafiek op het scherm om de resultaten te bepalen.
  6. Toepassing van eerder ontwikkelde PCR-test
    OPMERKING: Als u een conventionele PCR-test gebruikt, blijven stappen 1-3 hetzelfde en moeten de volgende stappen worden toegepast in plaats van de stappen 1.4 en 1.5.
    1. Voeg 1 μL van elke DNA-extractie toe aan afzonderlijke buizen met de volgende componenten: 12,5 μL groene PCR-mastermix, 9,5 μL ddH2O en 1 μL voorwaartse en omgekeerde primers (tabel 2).
    2. Spin down elk monster met behulp van een microcentrifuge en plaats buizen in een thermische cycler.
    3. Gebruik de volgende thermische cycler-instellingen overeenkomstig de vorige publicaties: 94 °C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 94 °C voor 30 s, geannealing bij 54 °C voor 30 s, uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, en definitieve verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
    4. Voer het product in een 1% agarose gel. Observeer de aanwezigheid van banden onder UV-licht waar positieve reacties een bandgrootte van ~ 508 bp zullen hebben.
  7. Traditionele detectiemethode
    OPMERKING: Er zijn meerdere methoden voor selectieve beplating voor pathogene detectie, en het volgende is een algemeen protocol voor P. capsici.
    1. Verkrijg eerst een gezonde auberginevrucht (een vatbare gastheer voor P. capsici)en versteriliseer het oppervlak door het fruitoppervlak te wassen met 70% isopropylalcohol.
    2. Plaats de auberginevruchten in melkkratten met een drijfapparaat (polyethyleenschuim of andere) en zet in irrigatievijvers. Zet elke aasval op één punt en laat de vallen in het waterreservoir (gerecycleerd irrigatiewater) gedurende ten minste 7 dagen of totdat de symptomen van fruitrot worden waargenomen. Verzamel het fruit en transport het naar het laboratorium.
    3. Spoel en droog de vrucht in een steriele kap voordat u kleine stukjes geïnfecteerde weefsels verwijdert en leg ze op een plaat van PARPH medium gewijzigd met 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0,0005% pimaricine, 250 mg/L ampicilline, 10 mg/L rifampicin en 50 mg/L hymexazol. Incubeerplaten bij 25 °C gedurende 5 dagen.
    4. Bekijk platen onder een samengestelde microscoop voor traditionele morfologische identificatie op 4 dagen na isolatie.

2. Bepaling van de detectiegrens van de concentratie van zoösporen

  1. Het maken van zoospore schorsing
    1. Incubate P. capsici op V8 agar (100 mL V8 sap, 900 mL ddH2O, 1 g CaCO3) platen gedurende 1 week bij 26 °C. Meerdere platen kunnen worden gebruikt om een grotere hoeveelheid zoospore suspensie te verkrijgen.
    2. De platen onder continu licht gedurende 3 dagen onder continu licht incubeerpen om de sporulatie te stimuleren.
    3. Overspoel de platen door 15 mL ddH2O aan elke plaat toe te voegen en leg ze gedurende 25 minuten in een koelkast van 4 °C. Keer dan terug naar kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    4. Roer platen om zoösporen los te maken en de oplossing in één buis van 50 mL van alle platen te verwijderen.
    5. Om een nauwkeurige schatting van de concentratie van zoöspore te verkrijgen, voegt u 10 μL van de sporensuspensie toe aan een hemocytometer en observeer u onder een microscoop zoosporen en schat u de gemiddelde concentratie.
  2. Seriële verdunning
    1. Voeg 1 mL van de sporenvering en 9 mL ddH2O toe aan een aparte buis. Herhaal deze stap voor zoveel 10-voudige verdunningen als gewenst.
    2. Spore-oplossingen worden vervolgens ingediend voor DNA-extractie op basis van het vorige protocol met behulp van de filtratiemethode.
      LET OP: Als een groter volume van de suspensie gewenst is, verdubbel het volume: 2 mL spore vering en 18 mL ddH2O.
  3. Detectie van zoösporingsconcentratielimiet
    1. Evalueer de detectielimiet van sporen door elke seriële verdunning afzonderlijk door de test te laten lopen totdat duidelijk positieve resultaten niet meer worden waargenomen. Zodra de uiteindelijke verdunning is verkregen, verdun je met een factor 2 (4,8 tot 2,4 in dit voorbeeld) en voer je de test opnieuw uit om een nauwkeurigere detectielimiet te krijgen.
  4. Ontwikkeling en optimalisatie van de LAMP-methode
    OPMERKING: LAMPprimers zijn ontworpen op basis van een 1121-base pair (bp) fragment van P. capsici (Li et al.19) zoals weergegeven in aanvullende figuur 2.
    1. Als colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) wordt gebruikt, gebruikt u de volgende oplossing: 2,5 μL primermix, 12,5 μL colorimetrische kleurstof, 0,5 μL groene fluorescerende kleurstof, 1 μL geëxtraheerd DNA en 8,5 μL ddH2O. Het totale volume is 25 μL.
    2. Bij gebruik van het draagbare versterkingsinstrument met LAVALAMP mastermix, hebben een eerste stap van 95 °C voor 3 minuten, zoals aanbevolen door de fabrikant, maar dit is niet vereist. Een laatste annealing stap is niet nodig om de kleurverandering of versterking grafiek te observeren. Voer geen warmstart stap uit als de commerciële colorimetrische kleurstof moet worden gebruikt.
    3. Bekijk lamp test resultaten in een van de volgende methoden: monsters uitvoeren op een 1% agarose gel of bekijken met behulp van een UV-imaging machine met het blote oog of uitzicht op de Genie III real-time versterking scherm.
    4. Optimaliseer de temperatuur van de LAMP-test met behulp van het draagbare versterkingsinstrument en analyseer de real-time versterkingsgrafiek voor snelheid en gevoeligheidsniveau. Voer monsters uit met unieke temperaturen om de snelste versterking te bepalen met het hoogste gevoeligheidsniveau.
    5. Bepaal de detectielimiet van de door de lamp ontwikkelde test door een seriële verdunning van geëxtraheerd DNA (zoals bij sporensuspensie in stap 2.2.1) en behoud van reactieomstandigheden zoals eerder beschreven voor de LAMP-reactie voor elke verdunning.
  5. Detectielimietbepaling en vergelijking met conventionele PCR-methode
    1. Gebruik DNA dat in stappen in punt 1.3 wordt geëxtraheerd om het detectieniveau van conventionele PCR te vergelijken met dat van de LAMP-test.
    2. Voeg 1 μL DNA toe aan een PCR-buis die 1 μL van zowel voorwaartse als omgekeerde PCR-primers(tabel 2),12,5 μL groene PCR Mastermix en 9,5 μL ddH2O bevatte voor een totaal van 25 μL.
    3. Verdringing van monsters in een thermisch cycler met behulp van de volgende voorwaarden: 94 °C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s, annealing bij 54 °C voor 30 s, uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, en definitieve verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
    4. Voer monsters in een elektroforese machine op een 1% agarose gel en kijk op een UV-beeldmachine. De uitgezonderde band grootte was 508 bp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimalisatie van de LAMP-methode
In deze studie ontdekten we de aanwezigheid van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van een draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test. Ten eerste werd de voorgestelde LAMP-test geoptimaliseerd door verschillende LAMP primerconcentraties te testen [F3, B3 (0,1–0,5 μM per stuk); LF, LB (0,5–1,0 μM per stuk) en FIP, BIP (0,8–2,4 μM per stuk)], duur (30-70 min) en temperaturen (55-70 °C). De uiteindelijke LAMP primer mix die in d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het testen van irrigatiewater voor fytopathogenen is een cruciale stap voor telers die irrigatievijvers en gerecycled watergebruiken 27. Irrigatievijvers bieden een reservoir en broedplaats voor een aantal fytopathogenen als overtollig irrigatiewater wordt gericht van het veld naar de vijver die met zich mee alle ziekteverwekkers die aanwezig kunnen zijn geweest16,27. De traditionele methode voor de detectie van een plant pathogenen in een...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen of belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk kreeg de financiële steun van Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP00016659. De auteurs danken Dr Pingsheng Ji, Universiteit van Georgië en Dr Anne Dorrance, Ohio State University voor het verstrekken van pure culturen van Phytophthora spp. We danken ook Li Wang en Deloris Veney voor hun technische bijstand tijdens het onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose gel poederThomas ScientificC997J85
Buchner trechterSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Centrifuge 5430Eppendorf22620509
ChloroformFischer ScientificC298-500
CTAB-oplossingBiosciences786-565
Dneasy Extractie KitQiagen69104
FilterkolfUnitedFHFL1000
FilterpapierUnited Scientific SuppliesFPR009
Gel Green 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
HandpompThomas Scientific1163B06
Iso-amyl AlcoholFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP master mixLucigen30086-1
Magnetische kraal DNA-extractieGenesiggenesigEASY-EK
Magnetische scheiderGenesiggenesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidonSigma AldrichPVP40-500G
PrimersSigma Aldrich
Prism Mini CentrifugeLabnetC1801
T100 ThermocyclusBio-Rad1861096
UV Gel DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Colorimetrische KleurstofLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CelBio-Rad1704489EDU
70% isopropanolFischer ScientificA451-1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
  2. Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
  3. Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
  4. Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
  5. Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
  6. Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
  7. Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
  8. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  9. Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
  10. Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
  11. Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
  12. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  13. Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
  14. Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
  15. Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655(1990).
  16. Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
  17. Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
  18. Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
  19. Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
  20. Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
  21. Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089(2018).
  22. Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
  23. Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903(2019).
  24. Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
  25. Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
  26. Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
  27. Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
  28. Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50(2019).
  29. Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
  30. Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van irrigatiewaterfilterpapiermethodeDNA extractieLAMP assaydetectie van zo sporencolorimetrische detectiepathogeenspecificiteitwatergedragen pathogeen

Gerelateerde artikelen