Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om in vitro Ca²⁺ fluxen in midbrain neuronen en hun downstream effecten op caspase-3 met behulp van primaire muis midbrain culturen te meten. Dit model kan worden gebruikt om pathofysiologische veranderingen in verband met abnormale Ca^{2 +} activiteit in midbrain neuronen te bestuderen, en om nieuwe therapieën voor anti-apoptotische eigenschappen te screenen.

Samenvatting

De ziekte van Parkinson (PD) is een verwoestende neurodegeneratieve aandoening veroorzaakt door de degeneratie van dopaminerge (DA) neuronen. Overmatige Ca^{2 +} instroom als gevolg van de abnormale activering van glutamaat receptoren resulteert in DA excitotoxiciteit en is geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme voor DA neuron verlies. In deze studie isoleren, scheiden en cultuur midbrain neuronen van de muis ventrale mesencephalon (VM) van ED14 muisembryo's. Vervolgens infecteren we de lange termijn primaire muis midbrain culturen met een adeno-geassocieerd virus (AAV) uitdrukken van een genetisch gecodeerde calcium indicator, GCaMP6f onder controle van de menselijke neuron-specifieke synapsin promotor, hSyn. Met behulp van live confocale beeldvorming, tonen we aan dat gekweekte muis midbrain neuronen tonen spontane Ca^{2 +} fluxen gedetecteerd door AAV-hSyn-GCaMP6f. Badtoepassing van glutamaat op midbrainculturen veroorzaakt abnormale verhogingen in intracellulaire Ca²⁺ binnen neuronen en dit gaat gepaard met caspase-3-activering in DA-neuronen, zoals aangetoond door immunostaining. De technieken om glutamaat-gemedieerde apoptose in primaire muis DA neuronen te identificeren hebben belangrijke toepassingen voor de hoge inhoud screening van geneesmiddelen die DA neuron gezondheid te behouden.

Inleiding

De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening wereldwijd, zonder bekende genezing. Schattingen suggereren dat pd prevalentie zal blijven toenemen en zal naar verwachting meer dan 1 miljoen diagnoses tegen het jaar 2030 in de Verenigde Staten alleen^{al 1}. Met weinig effectieve behandelingen die momenteel beschikbaar zijn om PD te bestrijden, is er een dringende noodzaak om effectievere therapieën te ontwikkelen. PD wordt gekenmerkt door een snel en progressief verlies van midbrain dopamine (DA) neuronen². De mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratie in PD zijn slecht begrepen. Bewijs suggereert een waarschijnlijke convergentie van meerdere mechanismen, zoals oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie, enz.³

Een dergelijk convergent mechanisme, glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit is betrokken bij meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder PD⁴. Terwijl glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit wordt gedacht om vooral te werken door middel van stimulatie van NMDA receptoren via een overmatige toename van intracellulaire Ca^{2 +} concentratie en uiteindelijke initiatie van apoptose, Ca^{2 +}-doorlatende AMPA receptoren zijn ook betrokken bij de excitotoxische respons^5,6,7. Daarom is het van belang om de bijdrage van AMPA-receptoren aan glutamaat-gemedieerde apoptose binnen een PD-model te bepalen. Dit kan worden bereikt met NBQX, een AMPA en kainate blocker, die bij micromolar concentraties selectief is voor AMPA receptoren⁸. Glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit en apoptotische signalering cascades zijn een ideaal downstream doel om de omvang van celdood te meten, en een potentieel doelwit voor therapeutische interventie. Daarom zou het ontwikkelen van een hoog-gehalte methode voor het beoordelen van glutamaat-gemedieerde modulatie van calciumactiviteit en bijbehorende downstream signalering in primaire ventrale mesencephalic (VM) neuronen waardevol zijn voor het screenen van nieuwe behandelingsmethoden op hun vermogen om neuronale gezondheid te behouden.

Hier hebben we een protocol ontwikkeld waarin we de genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI), GCaMP6f uitdrukken, met behulp van AAV2/5 met de menselijke synapsine (hSyn) promotor om de Ca²⁺ activiteit van muis VM primaire neuronen te meten in reactie op glutamaattoepassing die kan worden gemeten op fysiologisch en moleculair niveau. Deze high-content screening kan worden aangepast voor het ontdekken van geneesmiddelen of behandelingen die Ca^{2 +} activiteit moduleren om de gezondheid van VM neuronen te behouden. Wij stellen voor dat dit primaire cultuurmodel een effectieve manier is om nieuwe PD-interventies te screenen, gebaseerd op hun vermogen om de gezondheid van VM-neuronen te behouden en de progressie van PD te beperken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dierlijk veel onderwerpen zijn goedgekeurd door de^th Texas A & M University Institutional Animal Care and Use Committee (25 november 2019; AUP# 2019-0346).

OPMERKING: Voorbereiding van celkweekoplossingen moet gebeuren met behulp van steriele procedure in een biologische veiligheidskast en gefilterd op 0,2 μm om besmetting te voorkomen.

1. Voorbereiding van oplossingen en cultuurmedium

1. Bereid de lamininecoatingoplossing voor door 20 μL van 1 mg/mL lamininebouillon te verdunnen tot 2 mL steriel gedistilleerde H₂O. Bereid je op de dag van de ontleding voor.
2. Bereid 10% paarden (paarden)serum (ES) stopoplossing voor door 5 mL ES toe te voegen aan 45 mL van 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij 4 °C.
3. Bereid 4% runderserum albumine (BSA) voorraadoplossing voor door 2 g BSA-poeder toe te voegen aan 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en tot een eindvolume van 45 mL te brengen. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij 4 °C.
4. Bereid papaïne voorraad oplossing door het verdunnen van papaïne tot 3 mg/mL in 1x HBSS. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C.
5. Bereid deoxyribonuclease (DNase) oplossing door 20 mg DNase poeder toe te voegen aan steriele H₂O en breng naar een uiteindelijk volume van 20 mL. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C.
6. Bereid ascorbine zuurvoorraad oplossing door het toevoegen van 352 mg ascorbinezuur aan steriel gedistilleerde H₂O en brengen tot een eindvolume van 20 mL. Verwarm in 37 °C bad op te lossen indien nodig. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C.
7. Bereid Cell Culture Medium voor door het volgende toe te voegen aan 50 mL neurobasaalmiddel: 500 μL Glutamax (100x), 500 μL paardenserum, 1 mL B-27, 100 μL ascorbinezuur, 500 μL penicilline-streptomycine, 50 μL kanamycine en 50 μL ampicilline. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem. Bewaar bij 4 °C.
8. Bereid 0,01% Triton X-100-oplossing voor door 1 mL Triton X-100 toe te voegen aan 9 mL 1x PBS om een 10% oplossing te maken. Als Triton X-100 is stroperig, pipet langzaam om tip volledig te vullen. Verwarm in 37 °C bad op te lossen indien nodig. Bewaar bij 4 °C.
9. Om 10% Triton X-100 aandelen te verdunnen tot 0,01%, voer 3 seriële 1:10 verdunningen uit. Verdun 1 mL van 10% voorraad in 9 mL van 1x PBS om 1% oplossing te maken. Verdun 1 mL van 1% oplossing tot 9 mL van 1x PBS om 0,1% oplossing te maken. Verdun 1 mL van 0,1% oplossing tot 9 mL van 1x PBS om een 0,01% oplossing te maken.
10. Bereid 10% en 1% normale geitenserum (NGS) oplossing door 1 mL NGS toe te voegen aan 9 mL 1x PBS voor een 10% oplossing. Voeg 100 μL NGS toe aan 9,9 mL 1x PBS om 1% oplossing te maken.
11. Bereid glutamaat stock oplossing (100 mM) door toevoeging van 735 mg L(+)-Glutamic zuur aan steriel gedistilleerde H₂O en breng tot een eindvolume van 50 mL. Oplosbaarheid bij deze concentratie zal een probleem zijn. Het toevoegen van kleine volumes (100 μL) van 1 M zoutzuur is voldoende om de oplosbaarheid te verhogen.
12. Bereid de NBQX-voorraadoplossing (10 mM) voor door 50 mg NBQX toe te voegen aan steriel gedistilleerde H₂O en breng tot een eindvolume van 13 mL.

2. Bereiding van cultuurgerechten en coverslips (De dag voor ontleding gedaan)

OPMERKING: We hebben ontdekt dat het combineren van drie coatingmiddelen, poly-L-lysine, poly-L-ornithine en laminine zorgt voor een ideale celhechting en levensvatbaarheid.

1. Plaats 10 35 mm petrischaaltjes in een biologische veiligheidskast. Plaats twee cirkelvormige 12 mm coverslips in elk gerecht en vul met 70% EtOH gedurende 10 minuten. Gebruik een vacuümlijn om de resterende EtOH van elk gerecht aan te trekken, waardoor de EtOH volledig kan verdampen.
2. Pipette ~90-100 μL van 0,1% poly-L-lysine oplossing op elke coverslip, ervoor te zorgen dat de gehele coverslip wordt gedekt door de poly-L-lysine oplossing. Bedek de gerechten met deksels en plaats in een couveuse van 37 °C voor 1 uur.
3. Aspiraat resterende poly-L-lysine oplossing van elke coverslip en spoel met steriele H₂O.
4. Herhaal stap 2.2 – 2.3 met 0,1% poly-L-ornithine oplossing.
5. Nogmaals, herhaal stappen 2.2 – 2.3 met 0,01% laminine oplossing. Plaats in een CO_2-incubator van 37 °C/5% tot de volgende dag klaar is voor celbeplating.

3. Embryonale dissecties van muizen

OPMERKING: We gebruiken tussen de 4 en 6 getimede zwangere muizen per cultuur. Hoewel een groot deel van het dissectieproces plaatsvindt buiten een biologische veiligheidskast is het nog steeds belangrijk om steriele procedure te handhaven. Overvloedig gebruik van 70% EtOH op oppervlakken in de buurt van de dissectiemicroscoop en op chirurgische hulpmiddelen is ideaal. Een masker kan ook worden gedragen tijdens de dissectie om besmetting verder te voorkomen. Daarnaast gebruiken we 4 afzonderlijke antibiotica in het kweekmedium, dus besmetting is onwaarschijnlijk. Echter, als het gebruik van antibiotica problematisch is, kan deze dissectie-setup worden verplaatst in een steriele kap. Om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, moeten alle ontledingsoplossingen bij 4 °C worden voorgekoeld en moeten dissecties zo snel mogelijk worden voltooid. We voeren de dissecties niet uit op ijs. De methode voor dissectie van embryonale midbrainneuronen van muizen is identiek aan eerder beschreven methoden^9,10.

1. Bereid een ruimte op een bank in de buurt van een dissectie microscoop met een absorberende pad en spray royaal met 70% EtOH.
2. Spray twee 100 x 15 mm glazen petrischaaltjes en één 50 x 10 mm glazen petrischaal met 70% EtOH en laat EtOH verdampen. Eenmaal verdampt, plaats 50 mL steriele 1x HBSS in elk 100 x 15 mm petrischaaltje.
3. Dompel chirurgische schaar, tangen en microtomeblad in 70% EtOH voor 10 min minimum te steriliseren. Plaats instrumenten op de absorberende pad te drogen.
4. Met behulp van CO₂ gevolgd door cervicale dislocatie, euthanaseren 2-3 maanden oude getimede zwangerschap muizen op embryonale dag 14.
5. Spray de buik van de geëuthanaseerde muizen met 70% EtOH. Met behulp van tangen pak de onderbuik en open de buikholte met behulp van chirurgische schaar. Begin te snijden in de buurt waar de tangen houden de buik, het maken van laterale bezuinigingen aan elke kant totdat de buikwand kan worden teruggevouwen en de baarmoeder is duidelijk zichtbaar.
6. Met behulp van chirurgische schaar, snijd beide uiteinden van de baarmoeder hoorn. Verwijder vervolgens de baarmoeder en plaats in petrischaaltje met 1x HBSS.
7. Met behulp van straight-tip tang voorzichtig verwijderen embryo's uit de baarmoeder. Laat embryo's in HBSS gedurende dit proces. Met behulp van de tang of een microtome mes, snel onthoofden embryo's door te snijden in de buurt van de nek. Het maken van een zo vlak mogelijk snede.
8. Verplaats onder een ontledenmicroscoop een embryokop naar een droge petrischaal van 50 mm en plaats aan de ventrale kant. Stabiliseer het hoofd met tangen door het plaatsen en penetreren in de buurt van de ogen / snuit. Tangen moeten naar beneden worden gekanteld op ~ 45° om te voorkomen dat de mesencephalon wordt doordringt.
9. Verwijder met behulp van de tangen in de andere hand voorzichtig de doorschijnende laag huid en schedel net voor de prominente nok van de mesencephalon. Begin in de buurt van de middellijn en verwijder huid en schedel caudally totdat de mesencephalon volledig is blootgesteld.
10. Houd de tang loodrecht op de blootgestelde mesencephalon met een punt tussen de cortex en mesencephalon en de andere in de buurt van het cerebellum. Druk naar beneden en knijp de tangen samen om de hele midbrain te verwijderen. Het middenbreinsegment moet ongeveer 0,5 mm dik zijn. Plaats het middenhersenensegment in de tweede petrischaal gevuld met verse 1x HBSS. Herhaal dit proces voor elk embryo.
11. Met behulp van de dissectie microscoop, plaats de hersenen segment met de ventrale kant naar boven. Als de hersenvliezen nog steeds zijn bevestigd, verwijder het voorzichtig door te grijpen met de tangen en het optillen en uit de buurt van de hersenen segment.
12. Het hersensegment moet 4 zichtbare kwadranten hebben. Plaats het segment zodanig dat de twee kleinere kwadranten superieur zijn geplaatst aan de twee grotere kwadranten. Er is een prominente nok die de superieure twee (kleine) kwadranten scheidt van de inferieure twee (grote) kwadranten.
13. Met behulp van de tang knijpen en scheiden van de superieure kwadranten van de inferieure kwadranten, en vervolgens gooi de superieure kwadranten. De resterende inferieure kwadranten zullen teveel weefsel lateraal aan de rugkant hebben, dit weefsel zal er minder ondoorzichtig uitzien dan het resterende ventrale weefsel. Verwijder het minder dichte rugweefsel en gooi het weg. Het resterende segment moet zowel de Substantia nigra pars compacta (SNc) als het ventrale tegmental gebied (VTA) bevatten.
14. Met behulp van de tangen snijd de resterende ventrale weefsel segment in 4 kleinere stukken en met behulp van een 1mL brede boring pipet overdracht van deze segmenten in een 15 mL conische buis met 1x HBSS. Houd de conische buis met hersensegmenten op ijs gedurende de procedure.
15. Herhaal dit proces voor alle resterende hersensegmenten.

4. Dissociatie van cellen

1. Enzymatische vertering van cellen
   1. De HBSS voorzichtig aanzuigen uit de 15 mL conische buis met middenhersenensegmenten, waardoor de segmenten aan de onderkant van de buis achterblijven.
   2. Voeg ~800 μL papaïneoplossing toe aan de buis en plaats 7 minuten in een couveuse van 37 °C. Resuspend cellen door het vegen van de buis en te vervangen aan de 37 °C incubator voor een extra 7 min.
   3. Verwijder met een breedborend 1 mL pipetpunt alleen de midbrainsegmenten in een 1 mL aliquot van DNase. Laat de segmenten de onderkant van de aliquot of ongeveer 1 min blootstelling bereiken.
   4. Verwijder met een breedborend 1 mL pipetpunt alleen de middenhersenensegmenten in een 15 mL conische buis met 2 mL stopoplossing. Laat segmenten zich aan de onderkant van de buis nestelen en herhaal de spoeling in een extra conische buis gevuld met stopoplossing.
2. Mechanische trituratie van celsuspensie
   1. In de tweede stopoplossing spoelbuis, met behulp van een wide-bore 1 mL pipet tip, pipette de cellen op en neer 10 keer totdat er geen grote weefsel segmenten zichtbaar. Het is belangrijk om te voorkomen dat over trituratie voor minimale cellyse.
   2. Langzaam pipette 300 μL van 4% BSA oplossing aan de onderkant van de 15 mL conische buis met hersensegmenten. Verwijder voorzichtig de pipetpunt om een ophanglaag te behouden. Centrifuge op 0,4 x g gedurende 3 min. Vervolgens zorgvuldig aspirate de supernatant en resuspend cellen in 400 μL van celkweek medium.

5. Plating van de cellen

OPMERKING: Op basis van ervaring worden ongeveer 100.000 levensvatbare cellen per embryo verzameld. 2-3 maanden oude getimede zwangere muizen hebben meestal nestgroottes van 8-10 embryo's; daarom is een ruwe schatting voor de totale opbrengst van cellen per getimede zwangere muis ongeveer 1 miljoen cellen.

1. Met behulp van een hemocytometer preform een cel telling en vervolgens verdunnen van de schorsing tot 2.000 cellen / μL met behulp van celkweek medium. Trituraat kort te mengen.
2. Verwijder de hoezen met laminineoplossing uit stap 2 uit de couveuse en zuig de resterende laminineoplossing met behulp van een vacuüm uit de gecoate covers. Plaat snel om te voorkomen dat de covers niet volledig drogen. Pipette 100 μL (2,0 x 10⁵ cellen/coverslip) op elke coverslip en plaatst petrischaaltjes in een couveuse van 37 °C voor 1 uur.
3. Voeg voorzichtig 3 mL celkweekmedium toe aan elk gerecht en plaats terug in de 37 °C incubator. Preform half medium verandert 2 keer per week gedurende 2 weken.

6. Infectie van de celcultuur bij 14 DIV met adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren

1. Bereid voor elk gerecht 1 mL serumvrij DMEM-medium met 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 10¹³ titer)
2. Aspirate de cel cultuur medium van elk gerecht en vervangen door 1 mL serum vrije DMEM met hSyn-GCaMP6f. Plaats de gerechten 1 uur terug in de 37 °C couveuse.
3. Aspirate het serumvrije medium met AAV's en vervang het door 3 mL celkweekmedium. Plaats de gerechten terug in de 37 °C couveuse. We hebben ontdekt dat 5-7 dagen van AAV-infectie zorgt voor ideale niveaus van GCaMP expressie. Blijf medium elke 2-3 dagen veranderen gedurende deze periode van virale infectie.

7. Live confocale Ca²⁺ beeldvorming tussen 19-21 DIV

OPMERKING: Zoals vermeld in stap 6.3, beeldvorming kan worden gedaan tussen 5-7 dagen na virale infectie. Dit is het ideale venster om zichtbare expressie van de fluorofophore te bereiken op niveaus die het mogelijk maken om spontane Ca²⁺ activiteit te detecteren.

1. Voorbereiding van de registratiebuffers
   1. Om 1 L HEPES-opnamebuffer te maken, voegt u toe: 9.009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glucose, 2,381 g HEPES, 2 mL van 1 M CaCl_{2-voorraadoplossing} en 500 μL van 1 M MgCl_{2-voorraadoplossing} tot 800 mL steriel gedistilleerd H₂O. Breng de pH naar 7,4 met NaOH. Breng naar een laatste volume van 1 L.
   2. Om 200 mL glutamaat opnamebuffer van 20 μM te maken, verdunt u 40 μL van 100 mM glutamaatvoorraadoplossing tot 200 mL HEPES-opnamebuffer zoals hierboven beschreven.
   3. Om 200 mL nbqx-opnamebuffer van 10 μM NBQX te maken, verdunt u 200 μL van 10 mM NBQX voorraadoplossing tot 200 mL HEPES-opnamebuffer.
2. Confocale beeldvorming
   1. Vul een steriele petrischaal van 35 mm met 3 mL opnamebuffer.
   2. Haal een petrischaaltje van 35 mm met besmette culturen uit de 37 °C couveuse. Met behulp van fijne tip tangen, zorgvuldig pak de rand van een coverslip en breng het snel in de petrischaal gevuld met opnamebuffer. Plaats de resterende coverslip in medium back in de 37 °C incubator. Transporteren van de schotel met opnamebuffer naar de confocale microscoop.
   3. Start de beeldsoftware. Ga naar de volgende stap terwijl het initialiseert.
   4. Start de peristaltische pomp en plaats de lijn in de opnamebuffer. Kalibreren van de snelheid van de stroom te zijn 2 mL/min.
   5. Breng de besmette coverslip van de 35 mm Petri schotel in het opnamebad.
   6. Met behulp van de 10x water onderdompeling doelstelling en BF licht, vind het vlak van focus en kijk voor een regio met een hoge dichtheid van neuron cel lichamen. Schakel over naar de 40x wateronderdompelingsdoelstelling en richt het monster met behulp van BF-licht opnieuw.
   7. Selecteer AlexaFluor 488 in het venster 'Lijst met kleurstoffen' in FluoView en pas deze toe.
   8. AAV-expressie kan variabel zijn; daarom, om overbelichting en fotobleaching van de fluoroforen te voorkomen, beginnen met lage HV en laser vermogen instellingen. Voor de AlexaFluor 488 kanaal, zet de hoogspanning (HV) op 500, de winst op 1x, en offset op 0. Voor de 488 laserlijn zet het vermogen op 5%. Om het effectieve volume in het z-vlak te verhogen, verhoogt u de pinholegrootte tot 300 μm. Gebruik de scanoptie "focus x2" om emissiesignalen optimaal aan te passen aan subverzadigingsniveaus. Vanaf hier kunnen instellingen worden aangepast tot de ideale zichtbaarheid van elk kanaal is bereikt.
      OPMERKING: Om het volledige bereik van Ca²⁺ fluxen nauwkeurig vast te leggen met GCaMP, past u de instellingen voor baseline HV en laservermogen aan om een toename van de fluorescerende intensiteit mogelijk te maken zonder de detector te oververzadigen.
   9. Zodra microscoop instellingen zijn geoptimaliseerd, verplaatsen van het stadium om een regio met meerdere cellen met spontane veranderingen in GCaMP6f fluorescentie en zich richten op het gewenste vlak voor beeldvorming te lokaliseren.
   10. Gebruik het gereedschap 'Clip rect' om het beeldframe te knippen tot een grootte die een frameinterval van iets minder dan 1 seconde kan bereiken. Dit is nodig om het beeldinterval in te stellen op 1 frame per seconde.
   11. Stel het venster Interval in op een waarde van 1,0 en het venster 'Num' op 600.
       OPMERKING: Om verschillende opnamebuffers op het gewenste tijdpunt (300 s) te leveren, is het belangrijk om de latentie van de pomp te kalibreren om de nieuwe oplossing aan het bad te leveren. Dit is afhankelijk van de oplossingsperfusiesnelheid (2 mL/min) en de lengte van de lijn die wordt gebruikt om de oplossing te pompen.
   12. Als u een film uit de T-serie wilt vastleggen, selecteert u de optie 'Tijd' en gebruikt u de scanoptie 'XYt' om te beginnen met beeldvorming.
   13. Bekijk de voortgangsbalk van de beeldvorming en verplaats de lijn van de HEPES-opnamebuffer naar de 20 μM glutamaat opnamebuffer op het juiste tijdstip (bijvoorbeeld als de latentie van de pomp is gekalibreerd om de oplossing bij 60 s te leveren, verplaats de lijn in de glutamaatbuffer bij 240 frames om glutamaat bij 300 s te leveren).
   14. Wanneer de beeldvorming is voltooid, selecteert u de knop Series Gereed en slaat u de voltooide film uit de T-serie op. Blijf 20 μM Glutamaat gedurende nog eens 5 minuten doornemen, zodat de gekweekte neuronen in totaal 10 minuten aan glutamaat zijn blootgesteld. Herhaal dit proces voor elke coverslip te worden afgebeeld.
   15. Na de extra 5 minuten blootstelling aan 20 μM Glutamaat, verwijder de coverslip uit het bad en plaats terug in de 35mm Petri schotel met opnamebuffer tot de dag van beeldvorming is voltooid. Ga na afloop door naar stap 8.
3. Ca²⁺ traceanalyse
   1. Beeldanalyse uitvoeren in ImageJ. Installeer de BIO-FORMATS plugin voor ImageJ, die het mogelijk maakt . OIB-afbeeldingsbestanden openen.
   2. Klik op de werkbalk ImageJ op Analyseren | Stel Metingen inen selecteer het vak voor Gemiddelde grijze waarde (MGV).
   3. Open in ImageJ een film uit de T-serie als hyperstack.
   4. Sleep de schuifregelaar voor de film en identificeer het frame met maximale glutamaatrespons om alle neuronen die reageren op glutamaat te visualiseren. Gebruik de polygoon tool om alle zichtbare neuron cel lichamen te traceren, het toevoegen van hun ROI's aan de "ROI manager" lijst.
   5. Wanneer u klaar bent met het traceren en toevoegen van ROI's, selecteert u alle ROI's binnen het venster ROI Manager en gebruikt u de selectie voor meerdere metingen in de meer lijst met opties. Kopieer en plak deze gegevens in een spreadsheet. Voltooi dit proces voor alle films die moeten worden geanalyseerd.
   6. Zet voor elke ROI de ruwe MGV-gegevens van elk frame om naar ΔF/F_0-waarden met behulp van de vergelijking: ΔF/F₀ = [F(t) – F₀] / F₀. Waar F(t) = MGV van een bepaald frame, en F₀ = gemiddelde baseline MGV van ~ 10 frames waar geen Ca^{2 +} fluxen aanwezig zijn.
   7. Met behulp van een statistische software zoals OriginPro 2020 kunnen omgezette ΔF/F_0-sporen worden omgezet in lijngrafieken. De functie "Peak analyzer" kan worden gebruikt (of een soortgelijke functie als u een andere software gebruikt) om de piekamplitude van glutamaatrespons, latentie om te reageren op glutamaat en gebied onder de curve te meten.

8. Immunostaining van culturen

LET OP: Na fixatie met formaline kunnen coverslips worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 °C totdat ze klaar zijn om te worden verwerkt voor immunostaining. Primaire en secundaire antilichaam incubatie werd gedaan op een seriële manier, als zodanig incubatie met anti-Caspase-3 primaire antilichaam en de complementaire secundaire antilichaam voorafgegaan incubatie met de anti-TH primaire antilichaam en de complementaire secundaire antilichaam.

1. Onmiddellijk na glutamaat blootstelling, plaats de coverslip terug in zijn 35 mm petrischaal, aspirate de opname buffer, en voeg 3 mL van 10% formaline. Laat zitten voor 40 minuten op kamertemperatuur (RT).
2. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS.
3. Aspirate de PBS en permeabiliseren cellen in 1 mL van 0,01% Triton X-100 in PBS gedurende 2 min.
4. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS.
5. Aspirate de PBS en blokcellen in 1 mL van 10% NGS in PBS gedurende 40 min.
6. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS.
7. Voeg 1 μL konijn anti-Caspase-3 primair antilichaam toe aan 1 mL van 1% NGS in PBS (1:1000 verdunning). Aspirate PBS uit de schotel en vervangen door de primaire antilichaam oplossing. Plaats op een shaker en incubeer voor 1,5 uur op RT.
8. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS.
9. Voeg 1 μL geitenantikonijn AlexaFluor 488 secundair antilichaam toe aan 1 mL van 1% NGS in PBS (1:1000 verdunning). Aspirate PBS uit de schotel en vervangen door de secundaire antilichaam oplossing. Plaats op een shaker en incubbate voor 1 uur op RT. Moving forward bescherm de monsters tegen licht.
10. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS.
11. Herhaal stappen 8.7 – 8.10, maar met behulp van de kip anti-TH primaire antilichaam (1:1000) in stap 8.7 en de geit anti-kip AlexaFluor 594 secundaire antilichaam (1:1000) in stap 8.9.
12. Na de laatste PBS-spoeling plaatst u 30 μL montagemedium op een microscoopdia. Pak met tangen een hoezenlip van de 35 mm Petrischaal en plaats de coverslip met de cellen naar beneden in het montagemedium. Beide coverslips passen op een enkele microscoopplaat als deze correct wordt geplaatst. Plaats in een droge, donkere ruimte en laat het montagemedium 's nachts drogen.

9. Confocale beeldvorming van immunosidrische culturen

1. Confocale beeldvorming
   1. Start de beeldsoftware. Plaats het monster op het microscooppodium.
   2. Met de microscoop oculairs, met behulp van een 20x vergroting doelstelling en epifluorescent licht met een TRITC filter, focus het monster en zoeken naar een TH + cel lichaam.
   3. Zodra het lokaliseren van een TH + cel lichaam, centreren in het gezichtsveld en ga dan naar de 60x vergroting doelstelling.
   4. Selecteer de AlexaFluor 488 en AlexaFluor 594 kleurstoffen in het venster "kleurstoflijst".
   5. Net als bij live imaging, beginnen met lage HV, gain, offset, en laser power instellingen om te voorkomen dat fotobleaching. Gebruik de scanoptie "focus x2" om de fluorescerende intensiteit van elk kanaal te beoordelen en dienovereenkomstig aan te passen. Aangezien deze beelden later worden gekwantificeerd voor fluorescerende intensiteit is het noodzakelijk om de beeldvormingsinstellingen consistent te houden in alle gezichtsvelden. Daarom is het het beste om te kijken naar een paar voorbeelden van elke aandoening om een idee te krijgen van het bereik van fluorescerende intensiteit over monsters.
   6. Zodra de ideale beeldvormingsinstellingen zijn bepaald, selecteert u de scanoptie 'focus x2' en verplaatst u de cel van belang naar het midden van het gezichtsveld. Verhoog de digitale zoom tot 3x met de schuifregelaar 'zoomen'.
   7. Met behulp van de focusknop, vind het vlak van focus met de helderste fluorescentie en leg een enkel vlak XY beeld. Sla de afbeelding op om te voltooien.
   8. Schakel terug naar de 20x vergroting doelstelling om te zoeken naar een andere TH + cel. Herhaal dit proces totdat het gewenste aantal cellen van elke voorwaarde is bemonsterd.
2. Beeldanalyse
   1. Klik op de werkbalk ImageJ op Analyseren | Stel Metingen inen selecteer de vakken voor Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde.
   2. Open een afbeelding als een hyperstack met elk kanaal gescheiden door te slepen en te laten vallen in de ImageJ werkbalk of het selecteren van de afbeelding via het menu van het bestand.
   3. Gebruik het TH-kanaal (594 nm) om ROI's rond het cellichaam te tekenen. Met behulp van het gereedschap veelhoektracering in ImageJ traceert u de buitenrand van het cellichaam nauwkeurig. Waar de afstand tussen het celmembraan en de celkern de kleinste is, traceer dan een rechte lijn door de cytosol naar de rand van de kern en volg vervolgens de omtrek van de kern op de voet om deze uit te sluiten. Traceer vervolgens een rechte lijn terug naar het externe membraan, grenzend aan de eerste lijn zo dicht mogelijk, en blijven de contouren van de cel lichaam te volgen totdat de ROI is voltooid.
   4. Met behulp van de sneltoets "T" of met behulp van de werkbalk menu pad Analyseren | Hulpmiddelen | ROI Manager, open de ROI manager en voeg de ROI die net werd aangetrokken tot de lijst.
   5. Selecteer het venster van het caspase-3-kanaal (488 nm) en selecteer vervolgens de toegevoegde ROI in de lijst 'ROI Manager'.
   6. Selecteer in het venster ROI Manager de knop Meten. Het resultatenvenster wordt weergegeven met de metingen die eerder zijn ingesteld. Kopieer deze naar een spreadsheet en herhaal dit proces voor elke cel.

Resultaten

Na de eerste kweek van cellen behandelden we VM-kweekschotels op 14 DIV met 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f en toegestaan voor 5 dagen virale expressie. Op de dag van de beeldvorming werd hepes opnamebuffer vers bereid. We gebruikten twee voorwaarden; in één voorwaarde werd 20 μM glutamaat toegepast voor 10 min, terwijl in de andere voorwaarde 5 min van 10 μM NBQX toepassing voorafging aan een 10 min co-toepassing van 10 μM NBQX + 20 μM glutamaat. In beide omstandigheden hebben we heterogene en spontane veranderingen in de GCaMP6f-fluorescentie waargenomen, die duiden op spontane Ca²⁺ fluxen, zoals blijkt uit de representatieve sporen(figuur 1A,B, Aanvullende film 1-2). Toepassing van 20 μM glutamaat genereerde een robuuste en aanhoudende Ca²⁺ respons in zowel spontaan actieve als rustige neuronen (Figuur 1A, Supplemental Movie 1). Toepassing van 10 μM NBQX verminderde spontane activiteit en blokkeerde gedeeltelijk de glutamaatrespons (figuur 1B, aanvullende film 2). De mate waarin glutamaattoepassing een Ca²⁺ respons in elke voorwaarde stimuleerde, werd gekwantificeerd met behulp van het gebied onder de curve, piekamplitude en latentie om te reageren. Zowel het gebied onder de curve als de piekamplitude waren vergelijkbaar voor zowel de glutamaat- als de NBQX + glutamaat behandelde aandoeningen(figuur 1C),terwijl de latentie op respons aanzienlijk werd verhoogd in de NBQX + glutamaatconditie (figuur 2A,B). Naast het kwantificeren van de Ca²⁺ respons op glutamaatbehandeling, hebben we monsters vastgesteld en gekleurd met een anti-caspase-3-antilichaam als een maat van glutamaat-gemediteerde apoptose. We zagen een reeks caspase-3-activering over de omstandigheden(figuur 3A,B). Caspase-3 activering werd gekwantificeerd door meetgebied en gemiddelde caspase-3 intensiteit. In vergelijking met onbehandelde controlecellen, het gemiddelde gebied van cellen met caspase-3 activering onder glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden trended naar betekenis (Figuur 3B). Gemiddelde caspase-3 intensiteit was aanzienlijk hoger in de glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden in vergelijking met onbehandelde controles (Figuur 3B). Samen tonen deze resultaten een hoog-gehalte kader aan waarin apoptose van neuronen kan worden gemeten door Ca²⁺ reacties op excitoxische middelen te kwantificeren en gevolgd door een analyse van downstream apoptotische gebeurtenissen zoals caspase-3 activering in dezelfde reeks culturen.

Figuur 1: Gekweekte ventrale mesencephalic neuronen vertonen spontane Ca²⁺ activiteit en worden robuust gestimuleerd door glutamaattoepassing. (A) Representatieve sporen van spontane Ca²⁺ activiteit in VM-neuronen en hun reactie op 20 μM Glutamaat toepassing. (B) Representatieve sporen van spontane Ca²⁺ activiteit in VM neuronen en hun reactie op 10 μM NBQX + 20 μM Glutamaat toepassing. (C) Bevolkingsgegevens die het gebied onder de curve en piekamplitude van Ca²⁺ sporen weergeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: AMPAR blokkade met NBQX vertraagt de reactie op glutamaat toepassing in gekweekte ventrale mesencephalic neuronen. (A) Representatieve Ca^{2 +} sporen van glutamaat (grijs) en NBQX + glutamaat (blauw) opgeroepen reacties. Gemiddelde Ca^{2 +} sporen van glutamaat (zwart) en NBQX + glutamaat (rood) worden bedekt weergegeven. (B) Bevolkingsgegevens die latentie tonen op de reactie op glutamaat en NBQX + glutamaat riepen reacties op. Procentuele verandering tussen glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden wordt weergegeven in het rechter paneel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Glutamaat toepassing verhoogt caspase-3 expressie in tyrosine hydroxylase (TH) positieve ventrale mesencephalic neuronen. (A) Representatieve confocale afbeeldingen van VM-culturen die immuun zijn voor caspase-3 (groen) en TH (rood), schaalbalk = 10 μm. (B) Bevolkingsgegevens die da-neurongebied en gemiddelde grijze waarde van caspase-3-expressie in elke toestand weergeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende Film 1: Spontane Ca^{2 +} activiteit en reactie op glutamaat applicatie.
Spontane Ca²⁺ fluxen in aanwezigheid van HEPES opnamebuffer (0-300 s) gevolgd door toepassing van 20 μM glutamaat (301-600 s). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende Film 2: Spontane Ca²⁺ activiteit en reactie op NBQX + glutamaat applicatie.
Spontane Ca²⁺ fluxen in aanwezigheid van HEPES opnamebuffer (0-300 s) gevolgd door toepassing van 10 μM NBQX (301-600 s) en 10 μMQX + 20 μM glutamaat (601-900 s). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

We beschrijven een lange termijn primaire ventrale mesencephalic (VM) celkweeksysteem voor high-content analyse van glutamaat-gemedieerde apoptose in neuronen. Studies hebben primaire midbrain dopaminergische culturen gebruikt om excitotoxische mechanismen op te helderen in de context van PD-modellen^11,12. In deze studie hanteren we een combinatorische benadering met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) om Ca²⁺ activiteit te meten en deze activiteit verder te associëren met downstream moleculaire veranderingen, zoals het initiëren van apoptotische signaleringscascade's⁴. De methode heeft meerdere voordelen voor andere soortgelijke celkweeksystemen. Aangezien we vooral geïnteresseerd zijn in excitotoxiciteit binnen de context van de ziekte van Parkinson, is het gebruik van primaire VM-celculturen ideaal. Door gebruik te maken van verschillende veldverplaatsingstechnieken, zoals geraste coverslips of een gemotoriseerde XY-microscoopfase in combinatie met TH-immunostaining, kunnen we de specifieke effecten van glutamaat-gemediteerde apoptose in ventrale midbrainneuronen direct bestuderen. Bovendien, de 3-weekse cel cultuur model maakt het mogelijk voor neuronen om hun volledige, volwassen moleculaire profiel te ontwikkelen, als gevolg van volwassen DA neuronen⁹. Eerdere methoden waren voornamelijk gericht op moleculaire veranderingen na glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit^13,14. Het model is uniek in zijn vermogen om acute veranderingen in de neuronale fysiologie te correleren met downstream moleculaire gebeurtenissen in geïdentificeerde celtypen. Een beperking van het primaire cultuurmodel is dat de dissectietechniek de gehele ventrale midbrain vangt, inclusief DA- en GABAergic-neuronen en neuronen van de SNc en VTA. Bewijs suggereert nu dat DA neuronen van de SNc hebben selectieve kwetsbaarheid voor calcium en uiteindelijke celdood in vergelijking met DA neuronen van de naburige VTA¹⁵. Helaas, differentiërende SNc van VTA neuronen in embryonale culturen heeft bewezen moeilijk met weinig anatomische oriëntatiepunten om deze structuren te definiëren in de embryonale hersenen.

We tonen aan dat de primaire cultuurtechniek het mogelijk maakt om heterogene spontane Ca²⁺ activiteit te kwantificeren(figuur 1). Daarom is dit een ideaal celcultuursysteemmodel om tonisch actieve cellen te bestuderen, zoals pacemaking dopaminerge neuronen van de midbrain, neocorticale neuronen en GABAergic neuronen van de suprachiasmatische kern (SCN)^16,17. In de meeste toepassingen bereikt Ca²⁺ imaging niet dezelfde temporele resolutie als elektrofysiologie. Daarom is het waarschijnlijk dat een enkele Ca^{2 +} gebeurtenis is analoog aan een uitbarsting van neuronale actie potentialen. Dit kan worden geïnterpreteerd om te betekenen dat Ca^{2 +} imaging zorgt voor relatief nauwkeurige metingen van abnormale bursting activiteit in pacemaking cellen en is daarom geschikt voor een hoog gehalte scherm van Ca^{2 +-}gemedieerde excitotoxische celdood.

Om spontane Ca²⁺ activiteit te bereiken en te onderhouden, is het belangrijk om twee belangrijke punten in het protocol aan te pakken. Ten eerste is de beplatingsdichtheid van de cellen na dissectie. Voor primaire VM-neuronen hebben eerdere studies ongeveer 100.000 cellen/cm^29,10gebruikt. We hebben het protocol aangepast om een dichtheid van 200.000 cellen/cm²te plaaten, wat een heterogene reeks spontane activiteit creëert en het aantal dopaminerge VM-neuronen op elke coverslip verhoogt. Aangezien verschillende pacemaking neuronen hebben verschillende vuren eigenschappen¹⁶, de beplating dichtheid moet worden aangepast aan het celtype wordt bestudeerd en geoptimaliseerd om ideale niveaus van spontane activiteit te bereiken. Ten tweede is de incubatietijd na virale infectie van AAV's. Net als plating dichtheid, zal dit afhangen van de specifieke context van het onderzoek vraag en het type van AAV wordt gebruikt. Voor de specifieke AAV die hier wordt gebruikt, is 5 dagen incubatie na virale infectie ideaal om de gewenste eiwitexpressieniveaus te bereiken, wat dynamische veranderingen in GCaMP-fluorescentie mogelijk maakt om Ca²⁺ activiteit op te nemen. Veel factoren bepalen hoe snel en efficiënt een AAV zijn lading zal uitdrukken, waarvan een groot deel buiten het toepassingsgebied van deze methode valt, maar kortom, het is belangrijk om de promotoractiviteit en de snelheid waarmee het ladingeiwit rijpt en plooien heeft, te overwegen.

Een ander voordeel van de methode is dat het zorgt voor een aanzienlijke flexibiliteit in formaat, expressie vectoren, het gebruik van beeldvormingsapparatuur, en het bereik van wetenschappelijke vragen die kunnen worden aangepakt. Bovendien maakt de methode onderzoek mogelijk naar een breed scala aan specifieke vragen die glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit in PD en andere modellen van zenuwsfunctie omringen. Bijvoorbeeld, glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit omvat meerdere receptoren en signalering cascades⁵. Door de methode te gebruiken, en zoals aangetoond met de AMPAR-blokker, NBQX in figuur 1,is het mogelijk om specifieke componenten van de excitotoxische glutamaatrespons op fysiologisch en moleculair niveau te ontleden. Denkbaar, een soortgelijke aanpak met behulp van remmers van tweede boodschapper systemen kunnen worden gebruikt om hun bijdrage aan excitotoxiciteit te bepalen. Bovendien kunnen de AAV's die hier worden gebruikt worden aangepast om GECI's uit te drukken met celspecifieke promotors of AAV-uitgedrukte optogenetische sensoren die kunnen worden gebruikt om andere parameters te meten, zoals neurotransmitter-release.

Afgezien van primaire embryonale dissecties en confocale beeldvorming, veel van het protocol maakt gebruik van elementaire laboratoriumvaardigheden die geen gespecialiseerde opleiding vereisen. Daarom zijn de beperkingen van het model onder meer de moeilijkheid van de embryonale dissectietechniek, de lengte van de tijd dat de cellen moeten worden gekweekt om volwassenheid te bereiken, en toegang tot een confocale microscoop, of soortgelijke beeldvormingsapparatuur. De vele voordelen en flexibiliteit van de methode weegt op tegen deze beperkingen, waardoor dit een ideaal model is om de rol glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit in aandoeningen van het zenuwstelsel te bestuderen. Ten slotte kan dit model een effectief hulpmiddel zijn om nieuwe verbindingen te screenen op anti-apoptotische effecten en hun vermogen om de gezondheid van DA-neuronen te behouden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Formalin/PBS	VWR	100496-506
10X NA 0.3 water-immersion objective	Olympus	UMPLFLN10XW
12 mm circular cover glass No. 1	Phenix Research Products	MS20-121
20X NA 0.85 oil-immersion objective	Olympus	UPLSAPO20XO
35 mm uncoated plastic cell culture dishes	VWR	25382-348
40X NA 0.3 water-immersion objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
60X NA 1.35 oil-immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XO
Ampicillin (sodium)	Gold Bio	A-301-25
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044	50x stock
Binolcular Microscope	Kent Scientific	KSCXTS-1121
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Abcam	ab76442
Deoxyribonuclease I (DNase)	Sigma-Aldrich	DN25
D-glucose, andydrous	Sigma-Aldrich	RDD016
DMEM + GlutaMAX medium	ThermoFisher	10569010	500 mL
Equine serum	ThermoFisher	26050088	heat-inactivated
Fiber Optic Illuminator, 100V	Kent Scientific	KSC5410
Filter System, PES 22UM 250ML	VWR	28199-764
Fluoview 1000 confocal microscope	Olympus
Fluoview 1200 confocal microscope	Olympus
GlutaMAX supplement	ThermoFisher	35050061
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594	Abcam	ab150176
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594	Abcam	ab150077
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO2 incubator	Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52e	NIH
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm	RWD	S12014-13
Kanamycin monosulfate	Gold Bio	K-120-25
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A7506
L-glutamic acid	VWR	97061-634
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous	Sigma-Aldrich	M8266
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz	Harvard Apparatus	70-2027
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm	RWD	F11014-11
NBQX	Hello Bio	HB0443
Neurobasal medium	ThermoFisher	21103049	500 mL
Normal goat serum (NGS)	Abcam	ab7481
Origin 2020	OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	Titer: 1.00E+13 gc/ml
Papain	Worthington Biomedical Corporation	LS003126
Penicillin streptomycin	ThermoFisher	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	ThermoFisher	10010049	500 mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4832
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Potassium Chloride (KCl), anhydrous	Sigma-Aldrich	746436
Pump Head Tubing Pieces For MPII	Harvard Apparatus	55-4148
Rabbit monoclonal anti-caspase-3	Abcam	ab32351
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous	Sigma-Aldrich	746398
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	BioXtra, ≥99.5% (GC)
Time-pregnant female C57BL/6 mice	Texas A&M Institue for Genomic Medicine
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	500 mL
Wide-bore blue pipette tips P1000	VWR	83007-380