Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61501

⸱

15 juni 2020

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een gedetailleerd protocol om een murine xenograft model van veneuze misvorming te genereren. Dit model is gebaseerd op de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide endotheelcellen die hyper-activerende TIE2 en/of PIK3CA genmutaties bevatten. Xenograftlaesies vatten de histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel nauwkeurig samen.

Samenvatting

Veneuze misvorming (VM) is een vasculaire anomalie die voortvloeit uit een verminderde ontwikkeling van het veneuze netwerk, wat resulteert in verwijde en vaak disfunctionele aderen. Het doel van dit artikel is om zorgvuldig te beschrijven de oprichting van een murine xenograft model dat menselijke VM nabootst en in staat is om patiënt heterogeniteit weerspiegelen. Hyperactiverende niet-erfelijke (somatische) TEK (TIE2) en PIK3CA mutaties in endotheelcellen (EC) zijn geïdentificeerd als de belangrijkste drijfveren van pathologische vaartuiguitbreiding in VM. Het volgende protocol beschrijft de isolatie, zuivering en uitbreiding van door de patiënt afgeleide EC die mutant TIE2 en/of PIK3CA uitdrukt. Deze EC worden onderhuids geïnjecteerd in de rug van immunodeficiënte athymische muizen om extatische vasculaire kanalen te genereren. Laesies gegenereerd met TIE2 of PIK3CA-mutant EC zijn zichtbaar gevasculariseerd binnen 7\u20129 dagen na injectie en recapituleren histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel. Dit VM xenograft model biedt een betrouwbaar platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die vm-vorming en -expansie stimuleren. Bovendien zal dit model een belangrijke rol spelen bij translationele studies die de werkzaamheid van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen testen om de abnormale uitbreiding van het vz..

Inleiding

Gebreken in de ontwikkeling van de vasculatuur zijn de onderliggende oorzaak van vele ziekten, waaronder veneuze misvorming (VM). VM is een aangeboren ziekte die wordt gekenmerkt door abnormale morfogenese en uitbreiding van aderen1. Belangrijke studies over VM-weefsel en endotheelcellen (EC) hebben gain-of-function mutaties in twee genen geïdentificeerd: TEK, dat codeert de tyrosine kinase receptor TIE2, en PIK3CA, die codeert de p110α (katalytische subunit) isoform van PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Deze somatische mutaties resulteren in ligand-onafhankelijke hyper-activatie van belangrijke angiogene/groeisignaleringstrajecten, waaronder PI3K/AKT, wat resulteert in verwijde ectatische aderen3. Ondanks deze belangrijke genetische ontdekkingen zijn de daaropvolgende cellulaire en moleculaire mechanismen die abnormale angiogenese en de vorming van vergrote vasculaire kanalen veroorzaken nog steeds niet volledig begrepen.

Tijdens normale en pathologische angiogenese ontspruiten nieuwe vaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk en de EG ondergaan een opeenvolging van belangrijke cellulaire processen, waaronder proliferatie, migratie, extracellulaire matrix (ECM) remodellering en lumenvorming6. Twee- en driedimensionale (2D/3D) in vitro culturen van de EG zijn belangrijke instrumenten om elk van deze cellulaire eigenschappen individueel te onderzoeken. Niettemin is er een duidelijke vraag naar een muismodel dat de uitbreiding van pathologische vaartuigen binnen de micro-omgeving van de gastheer hervat terwijl het een efficiënt platform biedt voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor translationeel onderzoek.

Up-to-date is een transgene murinemodel van VM in verband met TIE2-functiemutaties niet gemeld. De huidige transgene VM-muismodellen zijn gebaseerd op de alomtegenwoordige of weefselbeperkte expressie van de activerende mutatie PIK3CA p.H1047R3,5. Deze transgene dieren geven significant inzicht in de effecten van deze hotspot PIK3CA mutatie. De beperking van deze modellen is de vorming van een zeer pathologisch vasculair netwerk dat resulteert in vroege dodelijkheid. Deze muismodellen weerspiegelen dus niet volledig het sporadische optreden van mutatiegebeurtenissen en gelokaliseerde aard van VM-pathologie.

Integendeel, door de patiënt afgeleide xenograftmodellen zijn gebaseerd op de transplantatie of injectie van pathologisch weefsel of cellen afkomstig van patiënten in immunodeficient muizen7. Xenograft-modellen zijn een krachtig hulpmiddel om de kennis over ziekteontwikkeling en ontdekking van nieuwe therapeutische middelen te verbreden8. Bovendien stelt het gebruik van patiënt-afgeleide cellen wetenschappers in staat om mutatieheterogeniteit samen te vatten om het spectrum van patiëntfenotypen te bestuderen.

Hier beschrijven we een protocol waarbij door de patiënt afgeleide VM EC die een gemuteerde constitutief-actieve vorm van TIE2 en/of PIK3CA uitdrukken, onderhuids worden geïnjecteerd in de rug van athymische naaktmuizen. Geïnjecteerde vasculaire cellen worden in een ECM-kader opgehangen om angiogenese te bevorderen zoals beschreven in eerdere vasculaire xenograftmodellen9,10,11. Deze VM EC ondergaan significante morfogenese en genereren vergrote, doorgesperde pathologische vaten bij afwezigheid van ondersteunende cellen. Het beschreven xenograftmodel van VM biedt een efficiënt platform voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor hun vermogen om ongecontroleerde lumenexpansie te remmen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Patiënt weefsel monsters werden verkregen van de deelnemers na geïnformeerde toestemming van de collectie en opslagplaats van weefselmonsters en gegevens van patiënten met tumoren en vasculaire afwijkingen onder een goedgekeurde Institutional Review Board (IRB) per institutioneel beleid in Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute en met goedkeuring van de Commissie klinisch onderzoek. Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn herzien en goedgekeurd door het CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Bereiding van materialen en voorraadoplossingen

  1. Voorbereiding van volledig endotheelcelgroeimedium (EGM)
    1. Supplement endotheel basaal medium (EBM) met de volgende groeifactoren aanwezig in de kit (zie Tabel van materialen):menselijke Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), vasculaire endotheel groeifactor (VEGF), Long Arg3 Insuline-Achtige Groeifactor- I (R3-IGF-I), ascorbinezuur, epidermale groeifactor (EGF), gentamycinesulfaat en amphotericine-B, en heparine. Voeg 1% Penicilline/Streptomycine/L-Glutamine (PSG) oplossing en 20% foetale runder serum (FBS).
      LET OP: We raden het toevoegen van hydrocortison af.
    2. Steriel filter de oplossing onder een laminaire stroomkap door een 0,2 μm flestopfilter in een autoclaved glazen fles en aliquot media in 50 mL conische buizen en bewaar bij 4 °C tot een week of bij -20 °C voor maximaal een jaar.
  2. Collagenase bereiden Een voorraadoplossing
    1. Bereid 50 mg/mL collagenase Een voorraadoplossing in 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
    2. Steriel filter de oplossing onder een laminaire stroomkap met 0,2 μm filter en spuit, en bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C.
  3. Weefselinzameling medium voorbereiden (Buffer A)
    1. Bereid een Ca2+/Mg2+ voorraadoplossing voor door 0,927 g calciumchloridedihydraat (CaCl2 .2H2O) en 1 g magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7H2O) toe te voegen aan 500 mL gedestilleerd water. Steriel filter de oplossing door een 0,2 μm flestopfilter in een autoclaved glazen fles en bewaar op kamertemperatuur (RT).
    2. Vul Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan met 10% Ca2+/Mg2+ oplossing en 2% FBS.
    3. Steriel filter de oplossing onder een laminaire stroomkap met 0,2 μm filter en spuit en bewaar aliquots van 5 mL bij -20 °C.
  4. Fibronectin coating van weefselkweekplaten
    1. Bereid de coatingbuffer (Buffer B) voor door 5,3 g natriumcarbonaat (Na2CO3; 0,1 M) op te lossen in 500 mL gedeïoniseerd water. Pas de pH van de buffer aan op 9,4 met 1 M zoutzuur (HCl). Filter onder een laminaire stroomkap door een 0,2 μm flestopfilter in een autoclaved glazen fles en bewaar bij RT.
    2. Voor coating, pipet 2 mL/5 mL/10 mL van Buffer B per respectievelijk 60 mm/100 mm/145 mm weefselkweekplaat. Voeg 1 μg/cm2 van menselijk plasma fibronectine gezuiverde eiwitoplossing toe en verdeel de vloeistof voorzichtig over de plaat.
    3. Incubate plaat bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 min.
    4. Spoel buffer B aan en was de plaat met PBS voorafgaand aan het kweken van cellen.

2. Isolatie van endotheelcellen uit VM-patiëntweefsel

  1. Isolatie van EC uit vast VM-weefsel
    OPMERKING: VM-weefsel wordt opnieuw verwijderd door debulking chirurgie12,13 onder een door de IRB goedgekeurd protocol.
    1. Was VM-weefsel (weefselmonstergewicht varieert meestal tussen 0,5 g en 1,5 g) in 5% PSG in PBS.
    2. Breng weefsel over naar een 100 mm celkweekschaal, maak het weefselmonster van gehakt in kleine stukjes met steriele chirurgische dissectiegereedschappen en breng over in een conische buis van 50 mL.
    3. Voeg 100 μL collagenase Toe Een voorraadoplossing tot 5 mL buffer A voor een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL, voeg dit vervolgens toe aan het weefsel en verteer het gehakt weefsel op 37 °C gedurende 30 minuten terwijl de inhoud om de 5 minuten schudt.
    4. Maal het verteerde weefsel bij RT voorzichtig met een 6 mm stamper van 6 mm, glad oppervlak in de conische buis van 50 mL.
    5. Blijf zorgvuldig vermalen weefsel met behulp van een stamper, terwijl het toevoegen van 5 mL van koude PBS aangevuld met 0,5% runder serum albumine (BSA) en 2% PSG. Herhaal deze stap vier keer.
    6. Filtreer de oplossing door een 100 μm celzeef in een conische buis van 50 mL om weefselfragmenten te verwijderen.
    7. Centrifugecelsuspensie gedurende 5 minuten bij 400 x g bij RT. Stap 2.3.
  2. Isolatie van VM EC uit lesional bloed verkregen uit patiëntenclerotherapie
    1. Verkrijgen van menselijke VM lesional bloed van sclerotherapie onder een IRB goedgekeurd protocol.
    2. Verdun lesional bloed (monstervolume varieert meestal tussen 0,5 mL en 5 mL) in PBS tot een eindvolume van 40 mL.
    3. Centrifugecelsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g bij RT.
  3. Initiële celbeplating
    1. Gooi supernatant weg en verleg de eencellige pellet in 1 mL EGM.
    2. Voeg 9 mL complete EGM toe aan fibronectine-gecoate platen (1 μg/cm²) 100 mm en zaad 1 mL celsuspensie.
    3. Incubeercellen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
    4. Om de andere dag verwijder 2 mL media en voeg 2 mL steriel gefilterde FBS toe.
    5. Zodra celculturen een samenloop van 40\u201250% bereiken, verandert het medium om EGM te voltooien. Het duurt meestal tussen de 2\u20123 weken voor de cellen om deze samenvloeiing te bereiken.
    6. Observeer dagelijks voor het verschijnen van EG-kolonies. Ze zijn te herkennen aan hun typische "kasseienachtige" morfologie(figuur 1A). Tussen 3\u20125 verschijnen eg-kolonies in elk monster.
    7. Verander het medium om de andere dag voor nog eens 5\u20127 dagen totdat individuele EG kolonies elkaar beginnen aan te raken.
  4. Handmatige isolatie van individuele EG-kolonies
    1. Om EG-kolonies te oogsten, was de plaat met 5 mL PBS en spoel handmatig aan met een serologische pipet.
    2. Neem de plaat naar een microscoop en cirkel de locaties van meerdere EG-kolonies met behulp van een markering pen zowel op deksel en bodem voor de terugkeer naar laminaire flow hood.
    3. Maak EC-kolonies los door 50 μL van 0,05% trypsin-EDTA-oplossing op de gemarkeerde gebieden te pipetten.
    4. Met behulp van een kleine cel schraper of een pipet tip, voorzichtig schraap cellen van de plaat.
    5. Kantel de plaat naar de dichtstbijzijnde rand en spoel af met 1 mL EGM per gemarkeerd gebied en verzamel cellen.
    6. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
    7. Plaat de verzamelde EG kolonies bij een dichtheid van 1 x 104 cellen/cm2 op fibronectine-gecoate (1 μg/cm²) celkweekschotels met verse EGM. De volgende dag, verander medium om EGM te voltooien.
    8. Verander het medium om de andere dag om EGM gedurende 2\u20123 weken totdat cellen 80% samenvloeiing bereiken.
    9. Trypsinize EC met 2 mL voorverwarmde 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm schotel bij 37 °C gedurende 2 min en neutraliseer trypsine door toevoeging van 4 mL EGM.
    10. Verzamel de celsuspensie in één conische buis van 15 mL en centrifuge bij 400 x g bij RT gedurende 5 minuten. Aspirate de supernatant en resuspend cellen in 2 mL van EGM.
    11. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Typische celnummers verkregen zijn 1 x 106 cellen per 60 mm cel kweekplaat of 2 x 106 cellen per 100 mm weefsel kweekplaat.
    12. Pellet de cellen door centrifugatie op 400 x g bij RT gedurende 5 minuten en aspirate de supernatant. Ga naar stap 3.2.1.

3. Endothelial celselectie en -uitbreiding

  1. Bereiding van anti-CD31-geconjugeerde magnetische kralen
    1. Vortex de flacon met de anti-CD31-geconjugeerde magnetische kralen voor 30 s. Het aantal benodigde kralen is 8 x 106 kralen/2 x 106 cellen.
    2. Was de gewenste hoeveelheid anti-CD31-geconjugeerde magnetische kralen met 1 mL wasoplossing met 0,1% BSA in PBS in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    3. Plaats de microcentrifugebuis gedurende 1 min in een celisolatiemagneet.
    4. Aspirate de supernatant en herhaal de wasstap.
  2. Endotheelcelzuivering en beplating
    1. Resuspend celpellet verkregen in 2.4.12 in 500 μL wasoplossing met 0,1% BSA in PBS.
    2. Voeg celoplossing toe aan microcentrifugebuis met magnetische kralen en resuspend grondig.
    3. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C met zacht kantelen.
    4. Voeg 500 μL van 0,1% BSA toe aan PBS en meng goed.
    5. Plaats de buis op een cel isolatie magneet gedurende 1 min.
    6. Voorzichtig aspirate alle vloeistof, die de CD31-negatieve fractie van de cellen bevat zonder het aanraken van de kralen.
    7. Was de kraalpel met de CD31-positieve celfractie met 1 mL van 0,1% BSA in PBS en herhaal magnetische scheiding.
    8. Herhaal was- en magnetische scheidingsstap voor een minimum van 3 keer om CD31-positieve celfractie te zuiveren.
    9. Resuspend gezuiverde gezuiverde endotheelcellen in een 15 mL conische buis en spin naar beneden voor 5 min op 400 x g bij RT.
    10. Verwijder supernatant en resuspend cell pellet in 1 mL van EGM.
    11. Voeg 9 mL complete EGM toe aan fibronectine-gecoate platen (1 μg/cm²) 100 mm en zaad 1 mL celsuspensie. Merk op dat sommige magnetische kralen zijn nog steeds bevestigd aan de cellen in deze eerste zaaien stap. De meeste kralen wegspoelen tijdens celuitzetting, maar een klein aantal kralen kan in vroege passages aanhouden.
    12. Incubeercellen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
    13. Verander het medium om de andere dag totdat de cellen 80 % samenvloeiing bereiken(figuur 1B).
  3. Endotheelceluitbreiding
    1. Zodra de cellen 80 % samenvloeiing bereiken, moet u met 2 mL van 0,05% trypsine-EDTA per 100 mm schotel bij 37 °C gedurende 2 minuten losmaken.
    2. Neutraliseer trypsine door 4 mL EGM toe te voegen en cellen te verzamelen in één conische buis van 15 mL.
    3. Centrifuge op 400 x g bij RT gedurende 5 minuten.
    4. Aspirate de supernatant, resuspend cellen in 2 mL van EGM, en tel het aantal cellen met een hemocytometer of door geautomatiseerde cel tellen.
    5. Zaadcellen met een dichtheid van 1 x 104 cellen/cm² in 145 mm fibronectine-gecoate (1 μg/cm²) weefselkweekplaten.
    6. Doorgaan met het doorsnee van cellen totdat het gewenste celnummer is bereikt. Bedenk dat een confluent 145 mm weefselkweekplaat ongeveer 8\u20129 x 106 cellen bevat en het aantal cellen dat nodig is 2,5 x 106 cellen per injectie. Alleen cellen tussen passage 3 en 8 moeten in aanmerking komen voor de xenograft.

4. VM-xenograftprotocol van afgeleide VM

OPMERKING: In dit protocol gebruiken we 5\u20126 week oude, mannelijke immunodeficiënt, athymische naakt Foxn1nu muizen.

Alle dierprocedures moeten worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

  1. Bereiding van materialen op de dag voor de injectie
    1. Pre-chill spuiten, naalden, en pipet tips in -20 °C vriezer 's nachts.
    2. Ontdooi langzaam het keldermembraan extracellulaire matrix (BMEM) 's nachts op ijsemmer geplaatst bij 4 °C om een verhoogde viscositeit van de gel te voorkomen.
  2. Voorbereiding van celsuspensie voor injectie
    1. Trypsinize EC met 5 mL voorverwarmde 0,05% trypsin-EDTA per 145 mm schotel bij 37 °C gedurende 2 min.
    2. Neutraliseer trypsine door 5 mL EGM toe te voegen en cellen te verzamelen in één conische buis van 15 mL.
    3. Centrifuge op 400 x g bij RT gedurende 5 minuten.
    4. Aspirate de supernatant, resuspend cellen in 3 mL van EGM, en tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
    5. Bepaal het totale aantal cellen dat nodig is voor alle geplande injecties.
      OPMERKING: Het aanbevolen aantal cellen is 2,5 x 106 cellen per injectie. Een totaal van 2 injecties worden meestal uitgevoerd in elke muis voor technische duplicaten. Het is noodzakelijk om een 10% overschot aan celnummer te berekenen om rekening te houden met verlies tijdens de overdracht in de spuit.
    6. Breng het volume met het berekende celnummer over in een nieuwe conische buis en pelletcellen van 50 mL door centrifugatie bij 400 x g bij RT gedurende 5 minuten.
    7. Aspirate de supernatant, waardoor een klein volume (ongeveer 50\u201270 μL) om de pellet los te maken.
  3. De voorbereiding van de spuit
    1. Bereken een bovenmatig volume van 20 μL/injectie om rekening te houden met verlies tijdens de overdracht naar de spuit. Resuspend de celpellet met 220 μL BMEM per injectie op ijs. Het geïnjecteerde volume van celsuspensie beslever 200 μL per laesie.
    2. Meng de celsuspensie grondig op ijs om een homogene celsuspensie te verkrijgen en het creëren van bellen te voorkomen.
    3. Met behulp van een 1 mL pipet en 1 mL spuit, tegelijkertijd pipet BMEM-cel mengsel in de spuit opening door zuigkracht, terwijl het trekken van zuiger van spuit.
    4. Luer vergrendel een 26G x 5/8 inch steriele naald aan de spuit en houd voorbereide spuiten plat op ijs voorafgaand aan injectie.
  4. Onderhuidse injectie in de muis
    1. Verdoven de muizen met 5% isoflurane/zuurstofmengsel bij een stroomsnelheid van 1 L/min met behulp van een isoflurane vaporizer. Zorg voor een goede sedatie van dieren (bijvoorbeeld niet-responsiviteit op teenknijpers). Houd anesthesie via continue toediening van 1,5% isoflurane/zuurstof geleverd via neuskegel.
    2. Plaats muizen op hun buik, bloot de achterkant regio waar enting zal optreden en desinfecteren het injectiegebied met 70% ethanol.
    3. Rol voorzichtig de voorbereide spuit om alle vaste cellen opnieuw op te stellen. Veeg bellen naar de naald einde van de spuit en verdrijven een klein volume van de cel suspensie om de verwijdering van alle bellen te garanderen.
      OPMERKING: Voor elke muis kunnen twee injecties worden uitgevoerd – aan de linker- en rechterkant van de muisrug.
    4. Knijp en maak een 'tent-achtige' structuur met behulp van uw duim en wijsvinger en steek de naald onderhuids recht onder de huid. Zorg ervoor dat de naald is alleen de huid diep door het vrijgeven van beknelde huid om injectie in spierweefsel te voorkomen.
    5. Houd naald onder een hoek van 45° injecteer voorzichtig 200 μL van de celsuspensie om een kleine bolvormige massa te creëren (figuur 1C).
    6. Neem het gewicht van de muis op met een weegschaal, oormerk de muis en keer terug naar de kooi.
    7. Controleer muizen na sedatie om ervoor te zorgen dat ze terugkeren naar de normale activiteit.
  5. Laesiegroeimonitoring
    1. Met behulp van een remklauw meet u de lengte en breedte van elke stekker(figuur 1D).
    2. Document metingen om de andere dag tot laesie collectie.

5. Weefselverzameling en -verwerking

  1. Euthanaseer muizen 9 dagen na implantatie in een CO2-kamer en controleer vitale functies om de dood te bevestigen. Voer cervicale dislocatie op de muizen als een secundaire methode om de muis te euthanaseren.
  2. Oogst de xenograftlaesie/stekker van de flank van de muis door dissectie met behulp van chirurgische tangen en scharen.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de met bloed gevulde bloedvaten in de stekker scheuren, is het belangrijk om te voorkomen dat de laesieplug met dissectiegereedschap raakt en overmatig omliggende weefsel, zoals de huid aan de stekker, wordt bevestigd.
  3. Dompel de resected laesie onder in PBS om te wassen.
  4. Stel een camerapodium in met een camera. Sluit pluggen uit op een snijplank met een liniaal. Neem een afbeelding van alle stekkers om de grove vasculariteit van laesies vast te leggen(figuur 1E).
  5. Fix pluggs by submerging in 10% formalin overnight at RT.
  6. Was stekkers in PBS de volgende dag en verplaats ze in 70% ethanol.
  7. Proceslaesiepluggen voor paraffine inbedding (pathologiekern).

6.

  1. Gebruik een microtome om 5 μm secties te snijden van de verzamelde murine laesies op positief geladen dia's.
    OPMERKING: Voor de daaropvolgende analyse zijn secties in het midden van de stekker (ongeveer 50\u201270 μm in het weefsel) van belang.
  2. Smelt paraffine bij 60 °C gedurende 1 uur voorafgaand aan vlekken.
  3. De-paraffineiseren en re-hydrateren weefsel sequentieel onder een chemische rookstroom kap. Daarom incubeer dia in xyleen voor 10 min, 100% ethanol (EtOH) voor 5 min, 90% EtOH voor 3 min, en 80% EtOH voor 3 min.
  4. Spoel de glijbaan in gedeïsized water gedurende 5 minuten.

7. Hematoxylin en Eosin (H&E)

  1. Incubeersecties in Hematoxylin gedurende 2 min.
  2. Plaats glijbanen in een kleurpot en spoel in een gootsteen door een gestage stroom van leidingwater tot het water helder is.
  3. Glijwaterglijbanen door weefsel sequentieel in 70% EtOH voor 1 min, 80% EtOH voor 1 min, 90% EtOH voor 1 min, 100% EtOH voor 1 min en verse 100% EtOH voor 1 min.
  4. Vleksecties in Eosin Y voor 30 s.
  5. Spoel in verse 100% EtOH tot de oplossing duidelijk is.
  6. Incubeer schuif in xylenes gedurende 2 min. Laat glijbanen 5\u201210 min drogen onder de rookkap.
  7. Doe een druppel permanent, niet-waterig montagemedium over xenograftssecties en plaats coverslip op de top.
  8. Laat glijbanen 's nachts drogen voordat de beeldvorming.

8. Immunohistochemie

  1. Bereid antigeen retrieval buffer (Tris-EDTA) voor door een gewicht van 0,6 g Tris-base en 1 mL van 0,5 M EDTA tot 500 mL gedeïmiseerd water. Pas de pH aan op 9.0 met 1 M HCl. Voeg 250 μL Tween-20 toe.
  2. Geïncubeerde geparaffeerd weefseldia's (zoals verkregen in stap 6.2\u20126.3) in een beker met antigeen retrieval buffer, roerend op een verwarmingsblok, gedurende 20 min bij 95 °C.
  3. Haal het bekerglas uit het verwarmingsblok, laat de oplossing afkoelen tot 35 °C en spoel vervolgens 3 min in PBS.
  4. Blokkeer weefselsecties in 5% normaal paardenserum in PBS gedurende 30 minuten bij RT.
  5. Bereid een biotinylated Ulex europaeus agglutinine-I (UEA-I) werkoplossing door 20 μg/mL biotinylated UEA-I te verdunnen in 5% normaal paardenserum in PBS.
  6. Pipet 50\u2012100 μL UEA-I werkoplossing per sectie en incubeer gedurende 1 uur bij RT in een bevochtigingskamer.
  7. Was glijbanen twee keer in PBS gedurende 3 min.
  8. Blus schuifsecties in 3% waterstofperoxide gedurende 5 minuten bij RT.
  9. Was glijbanen twee keer in PBS gedurende 3 min.
  10. Bereid 5 μg/mL streptavidin mierikswortel peroxidase-gevoegd in 5% normaal paardenserum in PBS.
  11. Pipet 50\u2012100 μL op elke weefselschuif en incubbate voor 1 uur bij RT in een bevochtigingskamer.
  12. Was glijbanen twee keer in PBS gedurende 3 min.
  13. Bereid 3,3'Diaminobenzidine (DAB)-oplossing volgens de instructies van de fabrikant en voeg 50\u2012100 μL per sectie toe.
  14. Incubeer secties voor 10\u201215 min, controle en monitoring voor de ontwikkeling van vlek elke 2\u20125 min.
  15. Was glijbanen drie keer in PBS gedurende 3 min.
  16. Voeg een druppel Hematoxylin toe en incubeer gedurende 3 minuten.
  17. Plaats glijbanen in een kleurpot en spoel in een gootsteen door een gestage stroom van leidingwater tot het water helder is.
  18. Sequentially incubate dia in 80% EtOH voor 1 min, 90% EtOH voor 1 min, 100% EtOH voor 1 min, en xyleen voor 2 min.
  19. Laat glijbanen 5\u201210 min drogen onder de rookkap.
  20. Doe een druppel permanent, niet-waterig montagemedium over xenograftssecties en plaats coverslip op de top.
  21. Laat glijbanen 's nachts drogen voordat de beeldvorming.

9. Analyse van door de mens afgeleide vasculaire kanalen

OPMERKING: Vasculariteit van VM-laesies wordt gekwantificeerd door het meten van vasculaire gebied en vasculaire dichtheid. Alleen UEA-I positieve, door de mens afgeleide vasculaire kanalen worden in aanmerking genomen voor kwantificering.

  1. Neem vier tot vijf beelden per laesiesectie met een heldere veldmicroscoop bij een 20x vergroting (high power fields [HPF]). Neem HPF-afbeeldingen in een x-vlakpatroon binnen de laesiesectie om overlap te voorkomen(figuur 1F-H). Neem een schaalbalk op de gemaakte afbeeldingen op.
  2. Open de HPF-afbeeldingen in Afbeelding J(Bestand > Openen). Kalibreer de pixels van de schaalbalk als volgt. Gebruik het gereedschap rechte lijn en ga over de schaalbalk. Als u de gemeten pixels wilt omzetten in mm, klikt u op Analyseren > Schaal instellen.
  3. Klik op Analyseren > Metingen instellen en selecteer Gebied en Toevoegen aan overlay.
  4. Meet het totale veldgebied in een HPF met Analyseren > Meten. Bewaar deze meting voor kwantificering in stap 9.8.
  5. Met behulp van de freehand selecties tool, handmatig schetsen UEA-I+ vasculaire kanalen.
    OPMERKING: Een vasculair kanaal wordt gedefinieerd als elk gebied dat is bekleed met UEA-I+ - EC dat bloedcellen kan bevatten.
  6. Klik op Analyseren > Meten om het geschetste UEA-I+ vasculaire gebied (mm2/HPF) te kwantificeren.
  7. Herhaal deze meting voor alle vijf hpf genomen binnen een stekker.
  8. Gemiddeld het totale vasculaire gebied van alle vijf HPF. Het verkregen vasculaire gebied per HPF wordt vervolgens gedeeld door het HPF-veldgebied (in mm2, stap 9,5) en uitgedrukt als een percentage (%).
  9. Voor kwantificering van de vasculaire dichtheid, tellen het aantal UEA-I+ vasculaire kanalen van elke HPF genomen. De vasculaire dichtheid is het gemiddelde aantal UEA-I+ vasculaire kanalen dat per HPF-gebied wordt geteld (vaten/mm2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van een murine xenograft model van VM op basis van de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide EC in de achterkant van immunodeficiënte naakt muizen. Endotheelcelkolonies kunnen binnen 4 weken na de eerste celisolatie van VM-weefsel of lesional bloed worden geoogst(figuur 1A,B). De dag na injectie bedekt de xenograftlaesieplug een oppervlakte van ongeveer 80\u2012100 mm2. In onze handen worden laesiepluggen met TIE2/PIK3CA-mutant EC zichtb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een methode om een door de patiënt afgeleid xenograft-model van VM te genereren. Dit murine model presenteert een uitstekend systeem dat onderzoekers in staat stelt om een dieper begrip van pathologische lumen uitbreiding te krijgen en zal instrumenteel zijn in de ontwikkeling van meer effectieve en gerichte therapieën voor de behandeling van VM. Dit kan gemakkelijk worden aangepast om andere soorten vasculaire afwijkingen te onderzoeken, zoals capillaire lymfefafe veneuze misvorming...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Nora Lakes bedanken voor het proeflezen. Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute, onder Award Number R01 HL117952 (E.B.), onderdeel van de National Institutes of Health. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weken, mannetjesEnvigo069(nu)/070(nu/+)Subcutane injectie
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Histologische anlaysis
Flesdopfilter (500 ml; 0,2 µM)Thermo Fisher974106Celcultuur
Bovine Serum Albumine (BSA)BSAA7906-50MGCelcultuur; Histologische analyse
Calciumchloride dihydraat (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GCelcultuur
CaliperElectron Microscopy Sciences50996491Lesie plug meting
CD31-geconjugeerde magnetische kralen (Dynabeads)Life Technologies11155DEC-scheiding
Celzeven (100 μM)Greiner542000Celcultuur
Collageenase ARoche10103578001Celcultuur
Conische buis; polypropyleen (15 mL)Greiner07 000 241Celcultuur
Conische buis; polypropyleen (50 mL)Greiner07 000 239Celcultuur
Coplin kleuringsvatTed Pella21029Histologische anlaysis
Dekglas (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EHistologische anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagens (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Histologische anlaysis
Dulbecco's Aanpassing van Eagle's Medium (DMEM)Corning10-027-CVCelcultuur
DynaMag-2Life Technologies12321DEC-scheiding
OorponsVWR10806-286Subcutane injectie
EDTA (0,5M, pH 8,0)Life Technologies15575-020Histologische anlaysis
Endotheliaal Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basismedium en supplementen)LonzaCC-3162Celcultuur
Eosine Y (op alcoholbasis)Thermo Scientific71211Histologische anlaysis
EthanolDecon Labs2716Histologische anlaysis
Fetaal bovien serum (FBS), HyCloneGE HealthcareSH30910.03Celcultuur
Filtertip 1,250 μLMidSciAV1250-HMeerdere stappen
Filtertip 20 μLVWR10017-064Meerdere stappen
Filtertip 200 μLVWR10017-068Meerdere stappen
Formaline gebufferde oplossing (10%)SigmaF04586Lesie plug dissectie
Hemacytometer (INCYTO; Wegwerp)SKC FILMSDHCN015Celcultuur
HematoxylineVector HematoxylineH-3401Histologische anlaysis
Humain plasma fibronectine gezuiverd eiwit (1mg/mL)SigmaFC010-10MGCelcultuur
Waterstofperoxide oplossing (30% w/w)SigmaH1009Histologische anlaysis
ImageJ SoftwareAnalyse
Isofluraan, USPAkorn Animal Health59399-106-01Subcutane injectie
Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GCelcultuur
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)Corning356237Subcutane injectie
Microcentrifugebuis (1,5 mL)VWR87003-294EC-scheiding
Microscoopglas Superfrost (75mm X 25mm)Fisher Scientific1255015-CSHistologische anlaysis
Naalden, 26G x 5/8 inch Sub-Q steriele naaldenBecton Dickinson (BD)BD305115Subcutane injectie
Normaal paardenserumVector LaboratoriesS-2000Histologische anlaysis
Penicilline-Streptomycine-L-Glutamine (100X)Corning30-009-CICelcultuur
Permanent montagemedium (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Histologische anlaysis
Pestle Maat C, GewoonThomas Scientific3431F55EC isolatie
Fosfaat Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificBP3994Celcultuur
WeegschaalVWR65500-202Subcutane injectie
Serologische pipetten (10 ml)VWR89130-898Celcultuur
Serologische pipetten (5ml)VWR89130-896Celcultuur
Natriumcarbonaat (Na2CO3)Sigma223530Celcultuur
Streptavidine, Mierikswortel Peroxidase, Geconcentreerd, voor IHCVector LaboratoriesSA-5004Celcultuur
Spuit (60ml)BD Biosciences309653Celcultuur
SPUITFILTER (0,2 µM)Corning431219Celcultuur
Spuiten (1 mL met Luer Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Subcutane injectie
Weefselcultuur-behandelde plaat (100 X 20 mm)Greiner664160Celcultuur
Weefselcultuur-behandelde plaat (145X20 mm)Greiner639160Celcultuur
Weefselcultuur-behandelde platen (60 X 15) mmEppendorf30701119Celcultuur
Tris-base (Trizma base)SigmaT6066Histologische anlayis
Trypan Blauw Oplossing (0,4 %)Life Technologies

Referenties

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889(2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Model voor veneuze malformatieisolatie van endotheelcellenTIE2-mutatiePIK3CA-mutatieimmuundeficiënte muizensubcutane injectiehistologische analyseUEA-1-kleuringkwantificering van vasculaire kanalen
Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.