Exosomen komen vrij bij in vitro toepassing van schokgolven. Hier beschrijven we hoe schokgolven kunnen worden toegepast op gekweekte endotheelcellen en vervolgens exosomen kunnen worden geïsoleerd voor verder onderzoek.
Methodenartikel
Exosoomisolatie na in vitro shockgolftherapie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Schokgolftherapie wordt routinematig toegepast bij orthopedische indicaties, waaronder tendinopathieën zoals laterale epicondylitis (tenniselleboog) en achillespeesontsteking (hielspoor), evenals niet-genezende wonden en botten. Ondanks verschillende pathologieën leidt de combinatie van een angiogeen en een ontstekingsremmend effect van schokgolftherapie tot regeneratie van zacht weefsel en botten. In meer dan 30 jaar klinische toepassing werden geen bijwerkingen waargenomen. Bovendien onthulde fundamenteel onderzoek zelfs regeneratieve effecten op ischemisch myocardium.
In een eerder werk konden we aantonen dat de mechanische stimulus van gekweekte cellen via een exosoomafgifte wordt vertaald in een biologische respons. Het exacte mechanisme moet echter nog worden opgehelderd. Mechanische koppeling is cruciaal bij het toepassen van schokgolftherapie, omdat zelfs kleine luchtbelletjes schokgolven kunnen absorberen. De eerder beschreven waterbadmethode is een valide methode om een adequate en reproduceerbare toepassing van schokgolven in vitro te garanderen.
We waren in staat om een haalbaar en repliceerbaar protocol te ontwikkelen om exosomen te isoleren uit gekweekte cellen na toepassing van een schokgolf. Hierdoor tonen we de mogelijkheid aan om de onderliggende mechanismen van mechanotransductie te bestuderen, evenals het regeneratieve en angiogene potentieel van exosomen die door schokgolven worden vrijgegeven.
Inleiding
Schokgolven (SW) zijn geluidsdrukgolven die in de natuur verschijnen wanneer in korte tijd een grote hoeveelheid energie vrijkomt (bijv. donder met bliksem). In de klinische routine worden schokgolven gebruikt bij lithotripsie om nierstenen te desintegreren zonder relevante bijwerkingen gedurende meer dan 30 jaar 1,2. Bij toeval werd op röntgenfoto's een verdikking van het darmbeen waargenomen na het uiteenvallen van de niersteen. Deze observatie vormde de basis voor onderzoek naar botgenezingsstoornissen en leidde tot behandeling bij non-unions met lange botten 3,4,5.
De indicaties voor schokgolftherapie werden uitgebreid en tegenwoordig wordt de methode routinematig klinisch gebruikt bij orthopedische indicaties, waaronder tendinopathieën zoals laterale epicondylitis (tenniselleboog) en achillespeesontsteking (hielspoor)6,7. Bovendien toonde fundamenteel onderzoek een hoog angiogeen potentieel van schokgolftherapie (SWT) aan. Daarin toonde een studie een toename aan van angiogene groeifactoren zoals VEGF (vasculaire endotheliale groeifactor), PIGF (placenta-groeifactor) en FGF (vasculaire endotheliale groeifactor) bij SWT gevolgd door angiogenese8.
Om een mogelijke gunstige rol van schokgolf-geïnduceerde angiogenese in andere pathologieën te onderzoeken, pasten we SW-therapie toe in een diermodel van ischemische hartziekte 9,10. Nadat een regeneratief effect in het ischemische myocardium kon worden aangetoond, konden we de onmisbare rol van de aangeboren immuunreceptor TLR 3 (Toll like receptor 3) bij schokgolftherapie11,12 identificeren. Verdere studies toonden aan dat de mechanische stimulus van SW-therapie wordt vertaald in een biologisch signaal via exosoomafgifte. Vergeleken met exosomen die fysiologisch vrijkomen uit endotheelcellen, bevatten exosomen die vrijkomen bij SWT een verhoogde lading angiogeen microRNA. Geïnjecteerd in ischemisch myocardium, gaf SWT exosomen af geïnduceerde regeneratie13.
Aangezien lucht SW absorbeert, is een perfecte koppeling tussen de applicator en de celkweekkolven cruciaal. Een gestandaardiseerd waterbad is een haalbare methode om SWT in vitro toe te passen en een reproduceerbare experimentele opstelling. Om reflectie en dus interferentie van golven te voorkomen, vernietigt een wigvormige absorber de primaire golven die naar de achterkant van het waterbad lopen. Om deze reden raden we aan om schokgolven in vitro alleen in vitro toe te passen met behulp van het beschreven waterbad.
In dit protocol beschrijven we de toepassing van schokgolven in vitro om angiogene exosomen vrij te geven in het supernatant. Dit protocol biedt de mogelijkheid om de rol van exosomen in mechanotransductie te onderzoeken en vormt de basis voor verder onderzoek naar exosoomafgifte bij SWT.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke endotheelcellen van de navelstrengader werden verkregen uit keizersneden op de afdeling Gynaecologie. Daarom werd schriftelijke geïnformeerde toestemming van patiënten verkregen. Toestemming werd gegeven door de ethische commissie van de Medische Universiteit van Innsbruck (nr. UN4435).
OPMERKING: Werk onder een steriele laminaire afzuigkap om besmetting te voorkomen.
1. 24 uur voor het experiment
- Bereid exosoomvrij endotheelgroeimedium voor door foetaal runderserum (FCS) 's nachts ultracentrifugerend bij 4 °C en 120.000 x g .
- Smeer een celkweekkolf van 75 cm² in met 10% gelatine.
- Zaad menselijke endotheelcellen in de celkweekkolf met behulp van een endotheelgroeimedium.
Experiment dag:
OPMERKING: Verwarm 4 L ddH2O, exosoomvrij FCS, Endotheelcelgroei Basaal Medium en PBS voor tot 37 °C.
2. Bereid de toepassing van de schokgolftherapie voor
- Bereid exosoomvrij endotheelgroeimedium voor door supplementen uit de commerciële kit (bijv. Bullet Kit) toe te voegen en ultragecentrifugeerde exosoomvrije FCS toe te voegen in plaats van gewone FCS aan het endotheliale groeimedium.
- Vul een waterbad met ca. 3,5 L 37 °C voorverwarmd ddH2O.
- Sluit de SW-applicator aan op het waterbad.
- Definieer behandelingsparameters (energiefluxdichtheid, impulsfrequentie) op het SW-apparaat. We raden 500 impulsen aan bij een energiefluxdichtheid van 0,07 mJ/mm² en een frequentie van 5 Hz.
3. De toepassing van de schokgolf
- Onderzoek de levensvatbaarheid van cellen op basis van morfologisch uiterlijk en de dichtheid van endotheelcellen via een microscoop met een totale vergroting van 100x. Gebruik kolven met een hoge samenvloeiing alleen voor een grotere hoeveelheid exosomen.
- Vervang het endotheelcelmedium voorzichtig door ongeveer 250 ml PBS om de kolf volledig te vullen en alle restlucht te persen.
- Gebruik parafilm of luchtdichte doppen om de kolf af te sluiten.
- Houd de celkweekkolf in een verticale positie in een waterbad met de met de cel bedekte kant tegenover het SW-apparaat. Zorg ervoor dat de afstand van de kolf tot de applicator in overeenstemming is met de aangegeven markering. Gebruik voor het Orthowave 180c-apparaat een afstand van 10 cm.
- Gebruik 250 impulsen van SW-therapie naar de onderste helft van de celkweekkolf.
- Draai de kolf 180° en gebruik 250 impulsen naar de bovenste helft van de celkweekkolf.
- Verwijder vervolgens de kolfafdichting en vervang PBS door 15 ml endotheelgroeimedium door exosoomvrij FCS.
- Kweek getherapeerde cellen in een exosoomvrij medium gedurende een geschikte tijd voor de opzet van het experiment. De hoogste hoeveelheid exosomen kan 4 uur na SW-therapie worden verzameld (Figuur 1).
OPMERKING: In de schijnoperatieve groep worden celkweekkolven onderworpen aan dezelfde behandeling (zie sectie hierboven) zonder SW-therapie te gebruiken.
4. Isolatie van exosomen
- Breng het bovenstaande over in een opvangbuis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C en 300 x g . Deze stap verwijdert alle cellen in de supernatant.
- Voor het verwijderen van celresten wordt het bovenstaande overgebracht naar een nieuwe buis en gedurende 20 minuten bij 4 °C en 3.000 x g gecentrifugeerd.
- Zeef het bovenstaande door een filter van 200 nm in een centrifugaalbuis om apoptotische lichamen te verwijderen.
- Centrifugeer het gefilterde bovenstaande middel bij 4 °C met 120.000 x g gedurende 70 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de exosoompellet opnieuw met 300 μl PBS.
- Aangezien de exosomenpellet niet zichtbaar is na ultracentrifugatie, moet u de ultracentrifugatiebuis gedurende 30 seconden laten draaien om er zeker van te zijn dat de exosoompellet opnieuw wordt gesuspendeerd. Pas het volume van PBS aan voor de experimentele behoeften en verdere experimenten.
- Bewaar geresuspendeerde exosomen bij -80 °C.
OPMERKING: Het protocol kan worden onderbroken na het overbrengen van het bovenstaande in een verzamelbuis of vóór ultracentrifugatie door het supernatans te bevriezen bij -80 °C.
5. Valkuilen
- Zorg ervoor dat de SW-applicator goed is aangesloten op het waterbad. Een onvolledige aansluiting kan leiden tot een lekkend waterbad.
- Zorg ervoor dat er een nauwkeurige afstand is van de kolf tot de applicator om dezelfde hoeveelheid energiefluxdichtheid naar verschillende kolven te gebruiken.
- Markeer de celkweekkolven die werden onderworpen aan SW-therapie en de celkweekkolven die de controlemonsters waren.
- Droog kolven voordat u ze terugplaatst in de broedmachine om besmetting te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het beschreven protocol hebben we zowel menselijke endotheelcellen (HUVEC's) als menselijke endotheelcellen van de kransslagader (CAEC's; PromoCell) naar schokgolftherapie (bijv. Orthowave 180c). Vrijgekomen blaasjes werden gekwantificeerd via nano-trackinganalyse (NTA). Daardoor konden we een toename van de afgifte van microblaasjes waarnemen bij SW-therapie (Figuur 1A,B). Beeldvorming van HUVEC's die vrijkwamen door middel v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In meerdere fundamentele onderzoeken kon het regeneratieve effect van de schokgolftherapie worden aangetoond en wordt het routinematig toegepast bij orthopedische indicaties 3,4,5. In diverse diermodellen kon het regeneratieve effect op het ischemische myocardium worden aangetoond en leiden tot de start van de CAST-HF-studie 9,10. Deze g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
JH en MG zijn aandeelhouders van Heart Regeneration Technologies GmbH, een spin-off van de Medische Universiteit van Innsbruck die zich richt op de promotie van cardiale schokgolftherapie (www.heart-regeneration.com). Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een onbeperkte AUVA-onderzoeksbeurs aan JH en CGT.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell culture flasks | Cellstar | 658170 | 75 cm2 |
| Collection tubes – Falcon Tube | Corning | 352070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Endothelial Cell Growth Basal Medium | Lonza | CC-3121 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F0804 | |
| Parafilm | Pechiney | PM996 | |
| Phosphat buffered saline | gibco | 14190-904 | |
| Shockwave applicator | MTS | Orthowave 180c |
Referenties
- Pearle, M. S., et al. Shock-wave lithotripsy for renal calculi. The New England Journal of Medicine. 367 (1), 50-57 (2012).
- Chaussy, C., Brendel, W., Schmiedt, E. Extracorporeally Induced Destruction of Kidney Stones By Shock Waves. Lancet. 316 (8207), 1265-1268 (1980).
- Valchanou, V. D., Michailov, P. High energy shock waves in the treatment of delayed and nonunion of fractures. International Orthopedics. 15 (3), 181-184 (1991).
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39 (6), 529-532 (1992).
- Moretti, B., et al. Bone healing induced by ESWT. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 6 (2), 155-158 (2009).
- Romeo, P., Lavanga, V., Pagani, D., Sansone, V. Extracorporeal shock wave therapy in musculoskeletal disorders: A review. Medical Principles and Practice. 23 (1), 7-13 (2014).
- Schaden, W., et al. Shock Wave Therapy for Acute and Chronic Soft Tissue Wounds: A Feasibility Study. Journal of Surgical Research. 143 (1), 1-12 (2007).
- Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9 (8), 1-7 (2014).
- Zimpfer, D., et al. Direct epicardial shock wave therapy improves ventricular function and induces angiogenesis in ischemic heart failure. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 137 (4), 963-970 (2009).
- Holfeld, J., et al. Epicardial shock-wave therapy improves ventricular function in a porcine model of ischemic heart disease. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 1057-1064 (2016).
- Holfeld, J., et al. Toll-like receptor 3 signaling mediates angiogenic response upon shock wave treatment of ischemic muscle. Cardiovascular Research. 109 (2), 331-343 (2016).
- Tepeköylü, C., et al. Shockwaves prevent from heart failure after acute myocardial ischemia via RNA/protein complexes. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (4), 791-801 (2017).
- Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. , (2019).
- Pölzl, L., et al. Safety and efficacy of direct Cardiac Shockwave Therapy in patients with ischemic cardiomyopathy undergoing coronary artery bypass grafting (the CAST-HF trial), Study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 21 (1), 1-10 (2020).
- Holfeld, J., et al. Shock wave application to cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (86), e51076(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen