Detectie met het blote oog van zeldzame puntmutaties in DNA

Samenvatting

Dit protocol maakt de identificatie met het blote oog mogelijk van puntgemuteerd DNA in een 200-voudige overmaat aan wildtype DNA-moleculen, door gebruik te maken van gouden nanodeeltjes en paramagnetische microdeeltjes.

Samenvatting

Het protocol beschrijft een colorimetrische test met het blote oog voor de detectie van somatische puntmutaties in een overmaat aan wildtype DNA. De toekomstige toepassing van de methode is de identificatie van zeldzame mutaties in circulerend celvrij DNA uit vloeibare biopsieën, met een relevantie in kankerdiagnostiek en stratificatie van oncologische patiënten voor gepersonaliseerde therapie. Als proof of concept is de test ontworpen om de BRAF^{V600E-mutatie} in het BRAF-gen te detecteren, wat belangrijk is om de subgroep van melanoompatiënten te identificeren die baat kunnen hebben bij gerichte therapieën met BRAF-remmers. Deze colorimetrische test kan echter gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar andere somatische mutaties van klinische relevantie dankzij het gebruik van universele detectiesondes, waardoor een sterk potentieel wordt geboden in oncologische diagnostiek.

De test detecteert 0,5% van BRAF^V600E in een overmaat aan BRAF^WT DNA, wat overeenkomt met de gevoeligheid van sommige commerciële instrumentele testen. Een dergelijke gevoeligheid is klinisch relevant voor diagnostische doeleinden, waardoor geneesmiddelgevoelige patiënten vroegtijdig kunnen worden geïdentificeerd. In tegenstelling tot commerciële tests op basis van real-time PCR, vereist deze test minimale instrumentatie en verwerking, omdat deze kan worden uitgevoerd op DNA dat is geamplificeerd met een standaard PCR (of isotherme technieken) en een uitlezing met het blote oog biedt met een reactie van één buis van een paar stappen in slechts één uur. Op dit moment is de test alleen gebruikt op synthetische DNA-monsters. Deze laatste zijn echter ontworpen om een echt monster na te bootsen dat is geamplificeerd uit circulerend celvrij DNA, om de vertaling van de test naar klinische diagnostiek te bevorderen.

Inleiding

Het doel van de methode is het detecteren van ondervertegenwoordigde puntmutaties in een DNA-monster met een minimaal geïnstrumenteerde methodologie en een uitlezing met het blote oog. Het uiteindelijke doel is om een proof-of-principle-test te hebben, geschikt voor toekomstige toepassingen in sneltests voor de detectie van somatische mutaties in circulerend celvrij DNA (ccf-DNA) (bijv. uit bloedbiopsiemonsters) voor de vroege diagnostiek en monitoring van kanker¹. Kankergerelateerde somatische mutaties vertegenwoordigen een belangrijke kankerbiomarker² en zijn aanwezig in een kleine (maar zeer variabele)³ fractie van ccf-DNA, waardoor hun identificatie uitdagend is⁴. We kozen, als modeldoelwit, de oncogene mutatie BRAF^V600E die de constitutieve activering van BRAF-kinase veroorzaakt. Deze mutatie is aanwezig in 80% van alle BRAF-gemuteerde kankers⁵ en is over het algemeen vertegenwoordigd in slechts <1% van het circulerende tumor-DNA⁶. Het identificeren van patiënten met deze mutatie is belangrijk omdat het voorspellend is voor de therapeutische respons op BRAF-remmers. Daarom zijn er verschillende methoden ^7,8,9,10 ontwikkeld om de BRAF-mutatiestatus te beoordelen, met gevoeligheden variërend van 0,01% tot 2%.

Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van de state-of-the-art methoden is dat de detectie instrumentvrij is (bloed-eye), in tegenstelling tot instrumentele detectie van fluorescerende moleculen door real-time PCR. Een ander voordeel is de efficiëntie bij het onderscheiden van één enkel gemuteerd DNA-molecuul in een overmaat van 200 wildtype DNA-moleculen. Deze discriminatiefactor van 0,5% is superieur¹¹ of komt overeen met¹² die van sommige laboratoriumgebaseerde of in de handel verkrijgbare kits, gebaseerd op een instrumentele detectie en is dus relevant voor klinische diagnostische toepassingen. Aan de andere kant is de methode, als laboratoriumprototypetest, gebaseerd op de handmatige besturing van temperatuurgevoelige stappen. Het aantal stappen en de totale duur van de test is echter beperkt, waardoor toekomstige implementatie in geautomatiseerde microfluïdische systemen denkbaar is.

Deze proof-of-concept-methode is ontwikkeld met behulp van synthetische DNA-moleculen. Voor een efficiënte vertaling naar de klinieken moet het worden gevalideerd met behulp van real-world monsters die zijn versterkt uit de bloedbiopten van patiënten. We merken op dat het toekomstige toepassingsgebied van de methode niet bedoeld is als de directe analyse van onverwerkte complexe biologische matrices, zoals lichaamsvloeistoffen. Uit dit laatste moet DNA worden geëxtraheerd met standaardmethodologieën en vervolgens worden geamplificeerd en gezuiverd. Het uitgangsmateriaal voor de analyse zal dus altijd gezuiverd en geamplificeerd DNA zijn, dat wat mogelijke storende stoffen betreft redelijk vergelijkbaar is met een synthetisch DNA-monster, zoals dat voor de ontwikkeling van deze methode is gebruikt.

Protocol

1. Synthese van sondes van gouden nanodeeltjes

1. Synthetiseer 40 nm citraat afgedekte gouden nanodeeltjes, met behulp van de standaard zaaigroeimethode in twee stappen, zoals hieronder beschreven.
   1. Synthese van 15 nm citraat afgedekte gouden nanodeeltjes (AuNPs-zaden) met behulp van de klassieke Turkevich-Frens-methode^13,14.
      1. Was al het glaswerk met aqua regia (HCl:HNO₃ in een verhouding van 3:1 v/v).
      2. Verwarm 250 ml 0,25 mM HAuCl₄ om te koken terwijl u gelijkmatig roert.
         LET OP: HAuCl₄ is bijtend en giftig.
      3. Voeg onmiddellijk 25 ml 38,8 mM Na₃∙citraat toe.
      4. Blijf 30 minuten koken en roeren, terwijl de oplossing een rode robijnrode kleur krijgt.
      5. Haal de oplossing van het vuur en laat al roerend afkoelen tot kamertemperatuur.
      6. Filtreer met behulp van 0,22 μm PTFE-membraanspuitfilters.
      7. Bewaren bij 4 °C in een glazen fles.
         OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd.
   2. Synthetiseer 40 nm citraat afgetopte gouden nanodeeltjes (40 nm AuNP's) door groei te zaaien¹⁵.
      1. Bereid oplossing A: 390 μL vers bereid 0,1 M hydroxylaminesulfaat met 13 ml AuNP-zaden in een totaal volume van 120 ml in H₂O.
         LET OP: De hoeveelheid AuNPs-zaden die nodig is om de gewenste grootte te verkrijgen, kan variëren; het moet worden getitreerd voor elk nieuw AuNPs-zaadbestand.
         LET OP: Hydroxylaminesulfaat is bijtend, giftig, mutageen en gevaarlijk voor het milieu. Voor gebruik: Grondig wassen na gebruik. Verwijder verontreinigde kleding en was deze voordat u deze opnieuw gebruikt. Gebruik met voldoende ventilatie. Minimaliseer stofontwikkeling en -ophoping. Vermijd contact met ogen, huid en kleding. Houd de container goed gesloten. Vermijd het inademen van stof. Niet gebruiken met metalen spatels of andere metalen voorwerpen. Voor opslag: Bewaren in een goed gesloten container. Bewaar in een koele, droge, goed geventileerde ruimte, uit de buurt van onverenigbare stoffen. Verwijderd houden van metalen.
      2. Bereid oplossing B: 12,25 ml H₂O + 0,25 ml 0,1 M HAuCl₄.
      3. Vul oplossing B in een spuit en vul de spuit in een spuitpomp.
      4. Stel de parameters van de spuitpomp in: diameter van de spuit in mm; debiet: 90 ml/h; totaal volume: 10,80 ml (waarvan 0,8 ml het overschot is dat nodig is voor systeemevenwicht, d.w.z. buisvulling).
      5. Start de spuitpomp. Nadat de eerste 0,8 ml oplossing B de slang heeft gevuld en in een afvalcontainer is terechtgekomen, plaatst u de buis op de reactiekolf met oplossing A (onder matig en gelijkmatig roeren) en laat u oplossing B druppelsgewijs binnengaan.
      6. Sluit af door 2,65 ml vers bereide 0,1 M Na₃∙citraat toe te voegen en roer gedurende 5 minuten.
      7. Concentreer de verkregen AuNP's van 40 nm door centrifugeren bij 2.460 x g gedurende 18 minuten bij 10 °C.
      8. Verwijder het bovenstaande door voorzichtig op te zuigen. Resuspendeer voorzichtig in het restvolume.
      9. Bewaren bij 4 °C.
         OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd.
2. Functionaliseer 40 nm citraat afgedekte gouden nanodeeltjes door standaard thiolchemie¹⁶.
   1. Verwerk disulfidebinding door thiolated probe oligonucleotiden (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) te incuberen met 10 mM Tris(2-carboxyethil)fosfine (TCEP) bij kamertemperatuur gedurende 3 uur onder mild schudden (400 rpm).
   2. Incubeer een grote overmaat van de verteerde oligonucleotiden een nacht met 10 nM AuNP's, bij kamertemperatuur onder mild schudden (400 tpm).
   3. Breng het AuNPs-DNA-mengsel op 0,3 M NaCl in 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, 0,01% SDS, door zout stapsgewijs toe te voegen gedurende een tijdspanne van 10 uur, onder licht schudden (400 rpm).
   4. Incubeer een nacht bij kamertemperatuur onder mild schudden (400 tpm).
   5. Was de DNA-geconjugeerde AuNP's 3 keer met 0,25 M NaCl in 10 mM fosfaatbuffer plus 0,01% SDS, om de overtollige ongebonden oligonucleotiden te verwijderen.
   6. Bewaar de verkregen universele sondes-AuNP's bij 4 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd.
   7. Bepaal de dichtheid van DNA-sondes op de AuNP's met behulp van een commerciële op fluorescentie gebaseerde test
   8. Meet de concentratie van AuNP's door middel van UV-vis-spectroscopie. Om de AuNP-concentratie af te leiden uit de absorptiegegevens, kunnen de wet van Lambert & Beer (A=εbc) en gepubliceerde extinctiecoëfficiënten voor 40 nm AuNP's¹⁶ worden gebruikt.
   9. Karakteriseer AuNPs-sondes door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
      OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd.

2. Colorimetrische discriminatie van BRAF^V600E zeldzame mutatie

1. Bereid doelmonsters voor op analyse: mengsels van synthetisch BRAF^V600E DNA en BRAF^WT DNA in verschillende verhoudingen (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Breng paramagnetische microdeeltjes in evenwicht door ze twee keer te wassen met hybridisatiebuffer (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% w/v PEG 600) en suspendeer ze opnieuw in een volume van HB gelijk aan het startvolume. Doe voor het wassen een hoeveelheid paramagnetische microdeeltjes in een buis van 1,5 ml (maximaal 50 μl/buisje), voeg 500 μl HB toe en meng driemaal door voorzichtig te pipetteren, breng de magneet aan, scheid het doorzichtige supernatant, voeg onmiddellijk 500 μl HB toe en herhaal de procedure voor een tweede wasstap. Voeg na het verwijderen van het supernatant onmiddellijk de HB toe om uitdroging van de kralen te voorkomen, zoals geadviseerd door de fabrikant.
3. Bereid voor elk te testen monster een buisje voor met 2,5 μl gewassen paramagnetische microdeeltjes in HB.
4. Functionaliseer paramagnetische microdeeltjes door 2,5 μL paramagnetische microdeeltjes te incuberen met 10 μL van een 10 μM-oplossing van een gebiotinyleerde eerste discriminating sonde (DP1), met BRAF^{V600E-mutatie} , gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Scheid de microdeeltjes magnetisch van storende ongebonden sondes en suspendeer ze opnieuw in 12,5 μL HB. Breng hiervoor de magneet aan op de zijkant van de buis en wacht tot de oplossing transparant is. Verwijder de oplossing door voorzichtig te pipetteren, voeg onmiddellijk HB toe en pipetteer voorzichtig totdat de parels homogeen weer in suspensie zijn.
6. Voeg aan de suspensie 10 μl van een mengsel van 10 μM van de in stap 2.1 beschreven DNA-doelmonsters toe.
7. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
8. Schud tijdens de incubatie elke 3 minuten de monsters om bezinking van de paramagnetische microdeeltjes te voorkomen.
9. Voeg aan de suspensie 10 μl van een 2 μM-oplossing van een tweede discriminatoire sonde (DP2) toe, die is ontworpen om een deel te hebben dat complementair is aan het doel en een poly-A-staart.
10. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
11. Schud tijdens de incubatie elke 3 minuten monsters om bezinking van de paramagnetische microdeeltjes te voorkomen.
12. Scheid het overtollige DP2 magnetisch af na incubatie.
13. Voeg onmiddellijk 300 fmol AuNP's toe, geconjugeerd met detectiesondes, en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
14. Scheid het supernatans dat overtollige AuNP's bevat magnetisch en voer de 1e^wasstap uit door 100 μL HB bij kamertemperatuur toe te voegen.
15. Scheid het bovenstaande magnetisch en voer een 2e^wasstap uit door 100 μL HB toe te voegen.
16. Incubeer gedurende 5 minuten bij 52 °C.
17. Magnetisch gescheiden supernatans bij 52 °C.
18. Resuspendeer onmiddellijk in 12,5 μl HB voor het aflezen van het colorimetrisch resultaat.
19. Fotografeer de resultaten en bewaar de monsters bij 4 °C.

Resultaten

Deze methode werd gebruikt voor de detectie van BRAF^{V600E-mutatie} in een overmaat aan BRAF^wt synthetisch DNA. Figuur 1 toont de details van de detectiestrategie. De test geeft een colorimetrisch JA/NEE-resultaat ^17,18, waarbij rood overeenkomt met een positief resultaat (JA) en geel met een negatief resultaat (NEE).

In het kort werden streptavidineerd...

Discussie

Het kernaspect van de methode is het vermogen om een doelwit-DNA te onderscheiden in de context van een overmaat aan storend niet-doelwit-DNA, waarbij doelwit- en niet-doelwit-DNA slechts voor één enkele nucleotide verschillen. Het ontwerp van de sondes en de hybridisatievoorwaarden zijn dus van cruciaal belang om een gevoelige discriminatie te bereiken. De test is ontworpen om universele colorimetrische sondes te gebruiken die moeten worden aangepast aan de detectie van interessante pun...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	D0632-25G
Dynabeads M-280 streptavidin paramagnetische microdeeltjes	Invitrogen	11205D
Hydroxylamine sulfaat	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	379913-25G
KDS 100 Legacy spuitpomp	kdScientific	789100
NanoDrop OneC spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS)
Fosfaat Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, No-Weigh™ Formaat	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS)	A35349
Polyethyleenglycol 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	202401
PTFE 0,22 µm filters, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, VS)	O11492
Natriumcitraatdihydraat	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	W302600
Synthetische oligonucleotiden	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Tetrachloroaurisch(III)zuur	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland	520918
Thiolateerde polyT DNA-sondes	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)	JEOL JEM 1011 microscoop
Zetasizer Nano S - Dynamisch Lichtverstrooiingssysteem	Malvern Panalytical