Method Article

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

DOI:

10.3791/61517

⸱

August 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, 2Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, 3Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van een complex meercellig organisme wordt beheerst door verschillende celtypen die verschillende transcriptieprofielen hebben. Om transcriptieregels te identificeren die ontwikkelingsprocessen regelen, is het noodzakelijk om de ruimtelijke en temporele genexpressieprofielen van deze individuele celtypen te meten. Daarom is inzicht in de spatio-temporele controle van genexpressie essentieel om inzicht te krijgen in hoe biologische en ontwikkelingsprocessen worden gereguleerd. Hier beschrijven we een laser-capture microdissection (LCM) methode om een klein aantal cellen te isoleren van drie gerst embryo organen tijdens een tijd-cursus tijdens de kiemkracht, gevolgd door transcript profilering. De methode bestaat uit weefselfixatie, weefselverwerking, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie gevolgd door real-time PCR of RNA-seq. Deze methode heeft ons in staat gesteld om ruimtelijke en temporele profielen van zaadorgaantranscripties te verkrijgen uit verschillende aantallen cellen (tientallen tot honderden), wat veel meer weefselspecificatie biedt dan typische bulkweefselanalyses. Uit deze gegevens konden we transcriptienetwerken definiëren en vergelijken en kandidaat-regelgevende transcriptiefactoren voor individuele weefsels voorspellen. De methode moet van toepassing zijn op andere plantaardige weefsels met minimale optimalisatie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plantenontwikkeling en -groei omvatten de gecoördineerde actie van transcriptie-regelgevende netwerken binnen verschillende cellen die bestaan in een complexe cellulaire omgeving. Om de activiteit van deze regulerende netwerken te begrijpen, hebben we de kennis van ruimtelijke en temporele genexpressie binnen verschillende celtypen in ontwikkelingsstadia nodig. Echter, analyses van genexpressie worden vaker uitgevoerd in hele organen of bulk weefsel monsters als gevolg van de technische uitdaging van het isoleren en analyseren van kleine aantallen cellen. De methode die we hier beschrijven heeft het verkrijgen van ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcripto....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien het eindproduct RNA is, moet u ervoor zorgen dat het werk met RNases niet wordt besmet. Het dragen van handschoenen is een must. Gebruik diethyl pyrocarbonaat (DEPC) -behandeld water, buffers, enz. Autoclave buffers en bak glaswerk voor gebruik.

1. Weefselfixatie

  1. Bereid fixatieve keuze, afhankelijk van de soorten en weefselsoorten; voor gerstzaad het fixatiemiddel van farmer (75% ethanol, 25% glaciale azijnzuur (v/v)) gebruiken.
  2. Chill de fixatief op ijs voorafgaand aan het oogsten van weefsels.
  3. Verzamel het plantmateriaal van belang en ontleed het indien nodig in stukken van de juiste grootte om in de....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We genereerden ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcripto's van gerstzaden tijdens de ontkieming met behulp van ons LCM RNA-seq protocol10. De studie werd uitgevoerd door het toepassen van LCM RNA-seq op een klein aantal cellen van drie embryoorganen (plumule, radicle tip, scutellum) om de 8 uur over een 48 uur tijdscursus tijdens de ontkieming (0-48 h, 7 tijdstippen) (Figuur 2A,B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel weefselspecifieke genexpressiestudies zijn beperkt door handontleding van monsters, wat tijdrovend, arbeidsintensief is, een hoog risico op besmetting heeft en alleen monsters kan gebruiken die een menselijke agent voldoende behendig is om te oogsten. LCM is een nauwkeurige en contactloze techniek om cellen te verzamelen van vaste weefselsecties met behulp van een mechanisch bediende laserstraal onder microscopische visualisatie.

Een goede monstervoorbereiding is cruciaal voor LCM. Het pr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) aan JW. M.G.L werd ondersteund door een startbeurs van de Universiteit van La Trobe. Wij danken het La Trobe Genomics Platform voor hun steun bij high-throughput sequencing en data-analyse. Wij danken universitair hoofddocent Matthew Tucker voor deskundig advies over de oprichting van LCM in ons lab.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid 100 % ACS/R.AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaqueZeiss415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10Leica3803015
Diethyl pyrocarbonateSigma-Aldrich40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LSLeica14035843489
MembraneSlide 1.0 PENZeiss415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbion (ThermoFisher)AMB17515
On-Column DNase I Digestion SetSigma-AldrichDNASE70
Ovation RNA-Seq System V2NuGen (Integrated Science)7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast)Leica39601006
PicoPure RNA Isolation KitABI (ThermoFisher)KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination SolutionAmbion (ThermoFisher)AM9780
XyleneAnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue ProcessorLeica BiosystemsTP1020
Leica Heated Paraffin Embedding ModuleLeica BiosystemsEG1150H
Leica Cold PlateLeica BiosystemsEG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety CabinetsLAF Technologies Pty LtdSafemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsRM2265with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM systemZeiss miscroscopy
TapeStationAgilentTapeStation 2200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionRNA SequencingSpatial Gene ExpressionTemporal Gene ExpressionTissue FixationParaffin EmbeddingTissue SectioningRNA ExtractionProfilingBarley Embryo

Related Articles