Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ontwikkeling van een complex meercellig organisme wordt beheerst door verschillende celtypen die verschillende transcriptieprofielen hebben. Om transcriptieregels te identificeren die ontwikkelingsprocessen regelen, is het noodzakelijk om de ruimtelijke en temporele genexpressieprofielen van deze individuele celtypen te meten. Daarom is inzicht in de spatio-temporele controle van genexpressie essentieel om inzicht te krijgen in hoe biologische en ontwikkelingsprocessen worden gereguleerd. Hier beschrijven we een laser-capture microdissection (LCM) methode om een klein aantal cellen te isoleren van drie gerst embryo organen tijdens een tijd-cursus tijdens de kiemkracht, gevolgd door transcript profilering. De methode bestaat uit weefselfixatie, weefselverwerking, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie gevolgd door real-time PCR of RNA-seq. Deze methode heeft ons in staat gesteld om ruimtelijke en temporele profielen van zaadorgaantranscripties te verkrijgen uit verschillende aantallen cellen (tientallen tot honderden), wat veel meer weefselspecificatie biedt dan typische bulkweefselanalyses. Uit deze gegevens konden we transcriptienetwerken definiëren en vergelijken en kandidaat-regelgevende transcriptiefactoren voor individuele weefsels voorspellen. De methode moet van toepassing zijn op andere plantaardige weefsels met minimale optimalisatie.
Inleiding
Plantenontwikkeling en -groei omvatten de gecoördineerde actie van transcriptie-regelgevende netwerken binnen verschillende cellen die bestaan in een complexe cellulaire omgeving. Om de activiteit van deze regulerende netwerken te begrijpen, hebben we de kennis van ruimtelijke en temporele genexpressie binnen verschillende celtypen in ontwikkelingsstadia nodig. Echter, analyses van genexpressie worden vaker uitgevoerd in hele organen of bulk weefsel monsters als gevolg van de technische uitdaging van het isoleren en analyseren van kleine aantallen cellen. De methode die we hier beschrijven heeft het verkrijgen van ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcripto....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Aangezien het eindproduct RNA is, moet u ervoor zorgen dat het werk met RNases niet wordt besmet. Het dragen van handschoenen is een must. Gebruik diethyl pyrocarbonaat (DEPC) -behandeld water, buffers, enz. Autoclave buffers en bak glaswerk voor gebruik.
1. Weefselfixatie
- Bereid fixatieve keuze, afhankelijk van de soorten en weefselsoorten; voor gerstzaad het fixatiemiddel van farmer (75% ethanol, 25% glaciale azijnzuur (v/v)) gebruiken.
- Chill de fixatief op ijs voorafgaand aan het oogsten van weefsels.
- Verzamel het plantmateriaal van belang en ontleed het indien nodig in stukken van de juiste grootte om in de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We genereerden ruimtelijke en temporele weefselspecifieke transcripto's van gerstzaden tijdens de ontkieming met behulp van ons LCM RNA-seq protocol10. De studie werd uitgevoerd door het toepassen van LCM RNA-seq op een klein aantal cellen van drie embryoorganen (plumule, radicle tip, scutellum) om de 8 uur over een 48 uur tijdscursus tijdens de ontkieming (0-48 h, 7 tijdstippen) (Figuur 2A,B).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Veel weefselspecifieke genexpressiestudies zijn beperkt door handontleding van monsters, wat tijdrovend, arbeidsintensief is, een hoog risico op besmetting heeft en alleen monsters kan gebruiken die een menselijke agent voldoende behendig is om te oogsten. LCM is een nauwkeurige en contactloze techniek om cellen te verzamelen van vaste weefselsecties met behulp van een mechanisch bediende laserstraal onder microscopische visualisatie.
Een goede monstervoorbereiding is cruciaal voor LCM. Het pr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology (CE140100008) aan JW. M.G.L werd ondersteund door een startbeurs van de Universiteit van La Trobe. Wij danken het La Trobe Genomics Platform voor hun steun bij high-throughput sequencing en data-analyse. Wij danken universitair hoofddocent Matthew Tucker voor deskundig advies over de oprichting van LCM in ons lab.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur 100 % ACS/R. | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC20104.323 | |
| AdhesiveCap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | |
| Duidelijke basisvormen 8 X 10 | Leica | 3803015 | |
| Diethyl pyrocarbonaat | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | |
| Laagprofiel disp.blades DB80LS | Leica | 14035843489 | |
| MembraneSlide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | |
| MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion (ThermoFisher) | AMB17515 | |
| On-Column DNase I Digestion Set | Sigma-Aldrich | DNASE70 | |
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGen (Integrated Science) | 7102-08 | |
| Paraffine (Surgipath Paraplast) | Leica | 39601006 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ABI (ThermoFisher) | KIT0214 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Ambion (ThermoFisher) | AM9780 | |
| XYleen | AnalaR NORMAPUR (BioStrategies) | VWRC28975.360 | |
| Leica Benchtop Tissue Processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Leica Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems | EG1150H | |
| Leica Cold Plate | Leica Biosystems | EG1150C | |
| Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets | LAF Technologies Pty Ltd | Safemate 1.5 | |
| Leica Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2265 | met PALMRobo v 4.6 software |
| Zeiss PALM MicroBeam LCM system | Zeiss microscopie | ||
| TapeStation | Agilent | TapeStation 2200 |
Referenties
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
