Methodenartikel

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

DOI:

10.3791/61527

⸱

30 juni 2020

 , 
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is een belangrijke component in zowel fysiologische als pathologische gebeurtenissen. Normale celmigratie is vereist voor essentiële functies zoals ontwikkeling en het monteren van een immuunrespons. Wanneer een defect of wijziging optreedt met het celmigratieproces, kan het schadelijke resultaten hebben (d.w.z. kankermetastase, wondgenezing en littekenvorming). Vanwege het belang van celmigratie is het noodzakelijk om toegang te hebben tot een celmigratietest die betaalbaar, aanpasbaar en herhaalbaar is. Met behulp van de gemeenschappelijke scratch migratie test, hebben we een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het analyseren van celmigratie die algemene laboratoriumapparatuur gebruikt. De beschreven methode maakt gebruik van visuele markers die het mogelijk maken om specifieke interessegebieden te heroveren zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Daarnaast biedt het flexibiliteit in het experimentele ontwerp, variërend van het veranderen van het migratiematrijssubstraat tot de toevoeging van farmacologische modifiers. Bovendien schetst dit protocol een manier om rekening te houden met het gebied van celmigratie, dat niet door verschillende methoden wordt beschouwd bij het onderzoeken van celmigratie. Deze nieuwe aanpak biedt een scratch migratie test aan een groter publiek en biedt onderzoekers meer mogelijkheden om de fysiologische en pathofysiologische impact van celmigratie te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is cruciaal voor veel fysiologische en pathologische gebeurtenissen. Het is nodig tijdens de ontwikkeling, voor het monteren van een immuunrespons, en voor een goede wondgenezing1,2,3. Veel van deze celmigratiegebeurtenissen kunnen worden veroorzaakt door fysieke of chemische signalen. Bijvoorbeeld, tijdens een immuunrespons, leukocyten zal migreren naar een site van letsel in reactie op een chemoattractant2. Daarnaast zullen leukocyten ook cytokines vrijgeven om migratie van extra immuuncellen te induceren, evenals andere celtypen, zoals fibroblasten, die betrokken zijn bij het wondgenezingsproces, en dus een meercellige respons4in werking treden. Het vermogen van cellen om te migreren is essentieel voor een goede fysiologische functie; wanneer de celmigratie echter ongecontroleerd blijft, kan deze een negatieve respons hebben en bijdragen tot pathologische voorvallen, zoals chronische ontsteking, vasculaire ziekte, metastase van kanker en verminderde wondgenezing2,3,4,5,6,7. Verminderde wondgenezing is een veel voorkomende aandoening van diabetici als gevolg van defecten in celmigratie, en als deze gebreken niet worden aangepakt, kan dit leiden tot verdere complicaties (bijvoorbeeld amputatie8,9). Deze studie, evenals anderen, hebben aangegeven dat het proces waarbij celmigratie plaatsvindt verder moet worden begrepen, hetzij onder normale fysiologische of pathologische omstandigheden, en het is van vitaal belang om dit onderzoeksgebied te bevorderen. Om dit te bereiken, moeten er migratietesten beschikbaar zijn die zowel toegankelijk als betaalbaar zijn voor die onderzoekers, die mogelijk niet over de apparatuur beschikken die nodig is om deze tests uit te voeren.

Momenteel zijn er verschillende migratietesten beschikbaar om een breed scala aan onderwerpen met betrekking tot celmigratie te onderzoeken. Zowel 2D- als 3D-migratiemodellen zijn ontwikkeld, die zich richten op specifieke gebieden die van invloed zijn op celmigratie. 3D-migratiemodellen worden doorgaans geassocieerd met celinvasiestudies en beoordelen de impact van extracellulaire matrix op celmigratie10,11,12, terwijl 2D-migratietesten een groter toepassingsgebied hebben en voornamelijk worden gebruikt om chemotactische migratie, wondgenezing en functionele veranderingen te bestuderen tijdens celmigratie13,14,15,16. Een aantal van deze tests vereisen extra apparatuur, zoals Boyden kamers of uitsluiting ringen, die de beschikbaarheid van deze tests voor bepaalde onderzoekers kan verminderen. Een van de meer kostenefficiënte testen is de scratch-test, die meestal wordt gebruikt om wondgenezing en algemene veranderingen in celmigratie14,17te beoordelen . Terwijl de meeste laboratoria zijn uitgerust om een krastest uit te voeren, de apparatuur die wordt gebruikt om celmigratie te volgen hebben de neiging om ofwel niet beschikbaar of te duur om te kopen. Dit omvat time-lapse microscopie, die een omgekeerde microscoop en een live imaging systeem vereist. Deze dure apparaten zijn niet algemeen toegankelijk voor elk laboratorium. Daarom benadrukt deze observatie de noodzaak van een nieuw protocol dat de beoordeling van celmigratie met gemakkelijker beschikbare apparatuur mogelijk maakt.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe en betaalbare manier om celmigratie te beoordelen. Deze methode volgt dezelfde procedure in verband met krastesten, maar verschilt in de analyse van het onderzoeken van celmigratie door gebruik te maken van apparatuur die vaker beschikbaar is in een laboratoriumomgeving voor basiswetenschappen. Dit protocol met behulp van gemeenschappelijke apparatuur zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van celmigratie zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Naast het bepalen van migratie, is deze methode ook verantwoordelijk voor variabele factoren in het krasgebied waarvan is opgemerkt dat deze een grote impact heeft op celmigratie. Over het algemeen biedt dit nieuwe protocol voor celmigratieanalyse de mogelijkheid voor meer laboratoria om te verkennen en bij te dragen aan het gebied van celmigratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Algemene celcultuur

  1. Cultuur cardiale fibroblasten in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) met 1 g/L glucose, natriumpyruvaat, L-glutamine, en aangevuld met 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% inactief foetaal runderserum (FBS), 2% L-glutamine en 0,02% antimicrobiële reagens (zie tabel met materialen)en gehandhaafd in CO2-incubator bij 37 °C.
  2. Cultuur cardiale fibroblasten tot 90-95% samenvloeiing wordt bereikt bij passage 0 (P0). Op dit punt zijn de fibroblasten klaar om te worden opgesplitst in een 48-put plaat, die wordt gebruikt voor de migratietest.

2. Bereiding van de migratieplaat

  1. Bereid een 48-well cel cultuur plaat door het tekenen van een lijn, met behulp van een gele of lichtgekleurde permanente marker, in het midden van de put. Teken vervolgens drie hash-markeringen die de put verdelen in drie afzonderlijke aandachtsgebieden. Deze secties zullen worden gebruikt voor beeldvorming.
    OPMERKING: Met behulp van een lichte kleur permanente marker zal zorgen voor een gemakkelijke beeldvorming van migrerende cellen. Donkere markeringen zoals zwart of blauw voorkomen visualisatie van migrerende cellen.
  2. Bij het beoordelen van migratie op een substraat (bijvoorbeeld collageen), de vacht van de put op dit moment volgens instructies en concentraties die worden gebruikt voor het specifieke substraat.
  3. Plaat ~ 15.000-20.000 cardiale fibroblasten, P1, in elke put en cultuurcellen, onder normale kweekomstandigheden (voorwaarden vermeld in de vorige sectie), totdat ze 90-95% samenvloeiing bereiken. Confluency moet worden bereikt tussen 24-48 uur.
    OPMERKING: Zorg er bij het instellen van de migratieplaat voor dat u een positieve controle opneemt (een bekende migratiecel, zoals 3T3-cellen18),een negatieve controle (niet-geëctocchede cellen) en een lege put.

3. Test-test en fixatie voor krassen

  1. Zodra cellen bereiken 90-95% samenvloeiing, verwijder de media en kras langs de getrokken lijn met behulp van een steriele P200 pipette tip.
    LET OP: Een P200 pipet tip is de gemeenschappelijke pipet tip formaat gebruikt met de scratch test10,14,19. Maak ook slechts één pas met de P200-tip, omdat meer dan één poging kan resulteren in meerdere kraslijnen.
  2. Spoel de put af met lage serummedia (1,5% FBS) om niet-aangesloten cardiale fibroblasten te verwijderen.
  3. Voeg 500 μL lage serummedia toe aan elke put. Als u farmacologische middelen gebruikt, voegt u ze op dit moment toe.
    OPMERKING: Lage serummedia worden gebruikt omdat het celmigratie mogelijk maakt/bevordert en voorkomt dat fibroblasten zich vermenigvuldigen, waardoor de resultaten van de migratietest kunnen wordenscheefgetrokken 20. Voor dit protocol werd 1,5% FBS gebruikt.
  4. Leg 0 uur beelden vast voordat u de fibroblasten uitbroedt in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 24 uur.
    1. Leg 0 uur beelden vast met behulp van een omgekeerde microscoop met een 20x-doelstelling. Neem twee 0 h beelden per put. Dit zal zorgen voor een meer volledige dekking van de lijn van migratie.
    2. Met behulp van de markeringen (lijn en streepjes), plaats de put om de bovenste helft van de lijn van de kras vast te leggen. Vermijd beeldvorming van het middelste streepje om ervoor te zorgen dat hetzelfde migratiegebied niet twee keer wordt weergegeven, wat de resultaten kan scheeftrekken.
    3. Gebruik imaging software(Tabel van materialen) om 0 uur beeld #1 vast te leggen. Beweeg vervolgens de plaat om de onderste helft van de put / lijn van de kras in het zicht van de camera positie. Nogmaals, vermijd het vastleggen van het middelste streepje. Eenmaal op zijn plaats, leg 0 uur beeld #2 (Figuur 1).
      OPMERKING: Het vermijden van het middelste streepje in beide 0 uur-beelden voorkomt dat het twee keer vastleggen van migratiegebieden wordt vastgelegd, wat als dit gebeurt, herhalende resultaten kan opleveren en de gegevens kan scheeftrekken.
  5. Na het uitbroeden voor 24 uur, verwijder de media uit de put, en was de put met 1x niet-steriele PBS (voortaan alle 1x PBS gebruikt is niet-steriel).
  6. Voeg in de rookkap 500 μL van 4% paraformaldehyde toe aan de put en broed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  7. Verwijder paraformaldehyde en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten per stuk bij RT.
  8. Zodra cellen zijn gewassen, ga dan over tot het vastleggen van 24 uur beelden of voeg 1x PBS aan elke put en plaats op 4 °C tot een later tijdstip. Cellen kunnen 1-2 weken op 4 °C blijven tot ze klaar zijn om te beelden.
    1. Permeabiliseren van de cellen door het toevoegen van 300 μL permeabiliserende oplossing (1x PBS en 0,01% triton X-100) aan elke put. Incubeer cellen/plaat met zachte, voortdurende schommelen voor 30 min op RT.
    2. Verwijder de permeabiliserende oplossing en voeg 1% Coomassie Brilliant Blue vlek (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% azijnzuur, 45% methanol en 45% dH2O) toe voor 10 minuten met zacht, continu schommelen bij RT.
      OPMERKING: Als platen zijn bekleed met een extracellulaire matrix substraat zorg ervoor dat een gecoate plaat te testen met Coomassie vlekken voor het uitvoeren van migratie test. Figuur 2 toont aan dat een matrixsubstraat kan worden gebruikt met deze test en geen impact visualisatie van cellen.
    3. Was putten 3x met 1x PBS bij RT met continue rocken voor 5 min per stuk.
    4. Na wasbeurten, toegevoegd 300 μL van 1x PBS en vangen 24 h beelden.
    5. Leg 24 uur beelden vast door de put in dezelfde positie uit te lijnen die werd gebruikt om de 0 h-beelden vast te leggen. Om dit te bereiken, open de eerder vastgelegde 0 uur beelden en met behulp van de markering gemaakt met de permanente marker, uitlijnen van de put in dezelfde positie. De lijn omlaag in het midden en extra streepjesmarkeringen moet een nauwe uitlijning tussen de 24 uur-afbeelding en de 0-uurafbeelding mogelijk maken(figuur 1).

4. Voorbereiding van 0 uur en 24 uur beelden

  1. Open 0 uur en 24 uur foto's genomen van dezelfde put en positie in imaging software (Table of Materials).
  2. Maak een nieuwe laag op de afbeelding van 0 uur. Klik vervolgens op de nieuwe laag en wijzig de naam van de laag in 'lijnlaag' door op de tekst te dubbelklikken.
    OPMERKING: Deze laag wordt vanaf dit punt lijnlaag genoemd.
  3. Klik op het penseelgereedschap (penseelpictogram) en stel de grootte in op 10 px en de kleur op rood.
  4. Als de lijnlaag is geselecteerd, tekent u twee afzonderlijke regels die het gebied van de kras aangeven. De lijnen mogen geen cellen raken als gevolg van deze lijnen die het migratiegebied markeren.
  5. Klik op het gereedschap Verplaatsen (pijlpictogram) en druk op de ctrl-knop en klik op zowel de lijn- als achtergrondlagen.
  6. Klik in het midden van de 0 h afbeelding en sleep beide lagen naar het midden van de 24 uur afbeelding.
  7. Klik nu met behulp van de 24 uur afbeelding op de 0 h achtergrondlaag en verander de dekking tot 50%.
  8. Houd ctrl ingedrukt, klik op zowel de achtergrond van 0 uur als de lijnlaag en transformeer de lagen vervolgens vrij(Bewerken>Vrije transformatie). Lijn met behulp van vrije transformatie de achtergrond en lijnafbeelding van 0 uur uit op de achtergrondafbeelding van 24 uur. Deze stap resulteert in de overlaying van de 0 h en 24 h beeld, die nodig is om de lijnen die het gebied van migratie markeren in de juiste positie op de 24 uur beeld.
  9. Nadat u de achtergrond van 0 uur en lijnlagen op de achtergrondafbeelding van 24 uur hebt uitgevoerd, verwijdert u de achtergrondlaag van 0 uur. Verwijder door op de achtergrondlaag van 0 uur te klikken, klik vervolgens met de rechtermuisknop en klik op laag verwijderen.
  10. Het verwijderen van de 0 h achtergrond afbeelding zal alleen de lijn en de 24 h achtergrond laag (nu aangeduid als migratie afbeelding). De lijnlaag geeft het migratiegebied/kras op de 24 uur-afbeelding aan en kan worden gebruikt voor het bepalen van het aantal migrerende cellen.
  11. Opslaan als de nieuwe migratieafbeelding als zowel een photoshop-bestand als een TIFF/JPEG. OPMERKING: een representatief cijfer dat dit proces weergeeft, wordt weergegeven in figuur 3.

5. Tellen van het aantal migrerende cellen

  1. Open de migratieafbeelding. Dit kan worden gedaan in een programma dat TIFF / JPEG-bestanden(Tabel van materialen)accepteert.
  2. Tel het aantal cellen dat zich tussenin bevindt en raak de twee rode lijnen aan.
  3. Het aantal migrerende cellen per afbeelding registreren. Er zullen twee migrerende afbeeldingen per put zijn en deze waarden mogen pas worden gecombineerd nadat de waarden zijn gecorrigeerd voor migratiegebied (beschreven in de volgende sectie).

6. Migratiegebied bepalen

  1. Open de 24 uur beeld dat de lijnen van migratie bevat in de imaging software programma in sectie 5 (Tabel van materialen).
  2. Opslaan als deze afbeelding als 'Afbeelding migratiegebied'.
  3. Klik na opslaan op de achtergrondlaag, klik met de rechtermuisknop en klik op laag verwijderen. Dit moet alleen de kraslijnen op de afbeelding achterlaten(figuur 3).
  4. Vul met het penseelgereedschap (penseelpictogram) het gebied tussen de kraslijnen in. Overeenkomen met de kleur van het penseel met de kleur die wordt gebruikt om de lijnen te tekenen voor migratie.
  5. Wijzig de afbeelding in een grijswaarden om een zwart-witafbeelding te genereren(Afbeelding>Modus>Grijswaarden)en sla de afbeelding op (figuur 4).
  6. Start de analysesoftware(Tabel van materialen)en open vervolgens het bestand "Gebied van migratie" in analysesoftware.
  7. Als u het gebied van de migratielijn wilt bepalen, klikt u op Afbeelding>Aanpassen>Drempelwaarde. Het zwarte migratiegebied wordt rood en het procentengebied wordt aangegeven in het vak Drempel. Het gebied wordt gerapporteerd als het percentage van het gebied dat de migratielijn dekt in vergelijking met het hele gebied dat in het beeld is vastgelegd.
  8. Nota van het percentagegebied voor de migratieregel en zorg ervoor dat deze waarde wordt gekoppeld aan het aantal migrerende cellen voor dezelfde afbeelding.

7. Gegevensanalyse

  1. Normaliseer het aantal migrerende cellen naar het procentuele gebied van de kras. Het aantal migrerende cellen verdelen door het percentage van de migratieregel (# gemigreerde cellen % Migratiegebied). Doe dit per afbeelding en niet een gemiddelde op basis van migratie per put.
  2. Nadat u waarden per afbeelding hebt genormaliseerd, voegt u de waarden van de twee afbeeldingen toe, die een afzonderlijke put vertegenwoordigen. Deze waarde wordt gebruikt voor grafische en statistische analyse. Als het experimentele ontwerp meerdere replicaties bevatte. Gemiddelde repliceren waarden voor statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure documenteert een nieuwe benadering van het bestuderen van celmigratie die zowel kosteneffectief als gemakkelijk aanpasbaar is voor de meeste laboratoria. Veel studies hebben time-lapse microscopie gebruikt om celmigratie te beoordelen, maar de apparatuur die nodig is voor deze methode is niet direct beschikbaar voor veel laboratoria. Overwegende dat het gebruik van lijnen en streepjes voor afbakening het mogelijk maakt om specifieke aandachtsgebieden op verschillende tijdstippen te heroveren zonder het geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze nieuwe benadering van de scratch migratie test biedt een meer toegankelijke methode voor onderzoekers om veranderingen in celmigratie te onderzoeken. Hoewel deze test volgt dezelfde procedure voor het beheer van een kras vergelijkbaar met andere krastesten, het biedt wel een nieuwe methode voor beeldvorming en nauwkeurige analyse van celmigratie10. In plaats van apparatuur-intensieve methoden van time-lapse microscopie en live cel beeldvorming kamers, deze methode details het gebruik van alge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door de US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy en het Department of BioMolecular Sciences.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adobe All AppsAdobeDit omvat Adobe Photoshop, de beeldverwerkingssoftware die bij dit protocol wordt gebruikt
Avant Pipette Tips 200ul Binding niet-sterielMIDSCIAVR1Tips worden geautoclaveerd om te steriliseren
AxioCam Erc 5s CameraZeiss426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250Fisher ScientificBP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 WellsFisher Scientific07-200-86
DMEM met L-Glutamine, 1 g/L glucose en natriumpyruvaatFisher ScientificMT10014CM
Image JNIHDit is een gratis software aangeboden door de Amerikaanse overheid en is de analysesoftware die bij dit protocol wordt gebruikt
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416785000
Premium US origin fetal bovine serumInnovative ResearchIFBS-HU
PrimocinInvivoGENant-pm-2Dit is het anitmicrobium dat wordt gebruikt voor deze procotol om cardiale fibroblasten te kweken
Zeiss Primovert MicroscopeZeiss491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 softwareZeisssoftware wordt geleverd bij aankoop van camera

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7(2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van celmigratiehartfibroblastenbereiding van migratieplaatge nverteerde microscopiesoftware voor beeldanalysePhotoshop kwantificeringmeting van migratieoppervlakfarmacologische modulatorenmedium met laag serumgehalte

Gerelateerde artikelen