Methodenartikel

Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61535

⸱

8 juli 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In dit artikel

Samenvatting

microRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA's bij IgA-nefropathie.

Samenvatting

Immunoglobuline A (IgA) nefropathie is een type primaire glomerulonefritis dat wordt gekenmerkt door de abnormale afzetting van IgA, wat leidt tot nierfalen in het eindstadium. In de afgelopen jaren is de betrokkenheid van microRNA's (miRNA's) gemeld bij de pathogenese van IgA-nefropathie. Er is echter geen gevestigde methode voor het profileren van miRNA's in IgA-nefropathie met behulp van modellen voor kleine dieren. Daarom hebben we een betrouwbare methode ontwikkeld voor het analyseren van miRNA in de nier van een IgA-muismodel (HIGA-muis). Het doel van dit protocol is om de veranderde expressieniveaus van miRNA's in de nieren van HIGA-muizen te detecteren in vergelijking met de niveaus in nieren van controlemuizen. In het kort bestaat deze methode uit vier stappen: 1) het verkrijgen van niermonsters van HIGA-muizen; 2) het zuiveren van totaal RNA uit niermonsters; 3) het synthetiseren van complementair DNA uit totaal RNA; en 4) kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) van miRNA's. Met behulp van deze methode hebben we met succes de expressieniveaus van verschillende miRNA's (miR-155-5p, miR-146a-5p en miR-21-5p) in de nieren van HIGA-muizen gedetecteerd. Deze nieuwe methode kan worden toegepast op andere studies die miRNA's profileren bij IgA-nefropathie.

Inleiding

Immunoglobuline A (IgA) nefropathie is een type primaire glomerulonefritis dat wordt gekenmerkt door de abnormale afzetting van IgA in het renale glomerulaire mesangiale gebied 1,2. Het is de meest voorkomende van de primaire glomerulonefritis en leidt tot het eindstadium nierfalen bij 20% -40% van de patiënten2. De oorzaak is nog onbekend, maar aanhoudende mucosale infectie is geïmpliceerd 1,3. Corticosteroïden, immunosuppressiva en renine-angiotensinesysteemremmers zijn voorgesteld als therapeutische methoden1,3, maar zijn niet volledig vastgesteld3. Daarom is verder onderzoek nodig om de etiologie en therapeutische methoden voor de behandeling van IgA-nefropathie te verduidelijken.

microRNA's (miRNA's) zijn kleine, niet-coderende RNA's die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van genexpressie 4,5. miRNA's zijn naar verluidt betrokken bij de pathogenese van verschillende ziekten, en sommige zijn geïdentificeerd als ziektebiomarkers en therapeutische middelen 4,5. In de afgelopen jaren is ook een verband tussen miRNA's en de pathogenese van IgA-nefropathie gemeld 2,6,7. MiR-148b bleek bijvoorbeeld betrokken te zijn bij structurele afwijkingen van IgA bij patiënten met IgA-nefropathie 2,6,7, terwijl miR-148b en let-7b werden gedocumenteerd als nieuwe biomarkers voor het detecteren van IgA-nefropathie7. Hoewel het begrijpen van de effecten van miRNA's op IgA-nefropathie kan helpen bij het verder ophelderen van etiologie en behandeling 2, zijn standaardmethoden voor het profileren van miRNA's in IgA-nefropathie met behulp van kleine diermodellen nog niet vastgesteld2.

Hierin ontwikkelden we een eenvoudige en betrouwbare methode voor het meten van miRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). De HIGA-muis is een karakteristieke ddY-stam met een bijzonder hoog serum-IgA-gehalte en de abnormale afzetting van IgA in nierglomeruli 8,9,10,11. Daarom kunnen HIGA-muizen worden gebruikt als een IgA-nefropathiemuismodel 8,9,10,11. Onze methode bestaat uit vier belangrijke stappen: ten eerste, het operatief verkrijgen van niermonsters van HIGA-muizen; ten tweede, het homogeniseren van monsters en het zuiveren van totaal RNA met behulp van een op silicamembraan gebaseerde spinkolom; ten derde, het synthetiseren van complementair DNA (cDNA) uit totaal RNA met behulp van reverse transcriptie; en ten vierde, het detecteren van de expressieniveaus van miRNA door kwantitatieve reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). De onderbouwing van deze methode en de betrouwbaarheid van de resultaten zijn gebaseerd op eerdere rapporten12,13. We tonen aan dat dit een nuttige techniek is om miRNA-expressieniveaus nauwkeurig te meten in een IgA-nefropathiemuismodel en dat het kan worden gebruikt om toekomstig onderzoek naar miRNA's in IgA-nefropathie te vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Jichi Medical University en voldoen aan de richtlijnen voor gebruik en verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. Het verkrijgen van niermonsters van HIGA-muizen

OPMERKING: HIGA-muizen vertonen een stabiel fenotype van IgA-nefropathie na 25 weken leeftijd 8,9,10,11. Balb/c muizen moeten worden geselecteerd als de controlegroep 8,9,10,11. Er werden 25 weken oude vrouwelijke HIGA-muizen (n = 10) en 25 weken oude vrouwelijke Balb/c-muizen (n = 10) verkregen. Het is noodzakelijk om van tevoren het aantal muizen te bepalen dat nodig is voor experimenten. Deze stap vereist ongeveer 7-8 uur voor een steekproefgrootte van 10 HIGA-muizen en 10 Balb / c-muizen.

  1. Bereid deze items voor: HIGA-muizen (25 weken oud, vrouwtje), Balb / c-muizen (25 weken oud, vrouw), inhalatie-anesthesieapparatuur, isofluraan, kurkblad, pin, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), injectiespuiten, naalden, chirurgische schaar en tang.
  2. Verdoof een HIGA-muis met behulp van 4% -5% isofluraan met inhalatie-anesthesieapparatuur en monteer deze in de dorsale positie op het kurkvel met behulp van pinnen. Pas de concentratie van isofluraan aan tot 2% -3% als de onderhoudsdosis na de inductie van anesthesie.
    OPMERKING: De diepte van de anesthesie wordt gehandhaafd op een niveau waarop de pijn geassocieerd met de invasieve procedure volledig wordt geëlimineerd. In het bijzonder moet de isofluraanconcentratie worden aangepast tot 4-5% bij het exciteren van weefsels zoals de thorax. Ontharing en oogzalf zijn niet essentieel. Het is niet nodig om de muis op een verwarmingspad te monteren als de procedure snel kan worden uitgevoerd.
  3. Maak een 3-4 cm middellijninsnijding van de buikwand van de muis met een chirurgische schaar en tang en identificeer zorgvuldig beide zijden van de nier.
  4. Insnijd de ribben en het middenrif met een chirurgische schaar en tang om het hart bloot te leggen. Na het insnijden van het rechter atrium, injecteert u PBS in de linker ventrikel totdat de nierkleur verandert in lichtgeel (deze procedure betekent dat het hele lichaam van de muis wordt doordrenkt met PBS.)
  5. Snijd de nierslagader, nierader en urineleider door en verwijder de nier. Verdeel de nier in stukjes van 30 mg voor gebruik in de volgende stap.
    OPMERKING: De pathologie van IgA-nefropathie heeft voornamelijk betrekking op de glomerulus in de nierschors (buitenste deel van de nier). Hoewel het moeilijk is om macroscopisch en volledig de cortex en de medulla te onderscheiden, is het wenselijk om voornamelijk het buitenste deel van de nier te verzamelen. Deze monsters kunnen gedurende enkele maanden bij –80 °C worden bewaard.

2. Zuiveren van totaal RNA uit niermonsters

OPMERKING: In deze stap wordt de in de handel verkrijgbare miRNA-isolatiekit gebruikt voor de extractie van totaal RNA. Daarnaast wordt gebruik gemaakt van biopolymeer-versnipperende spinkolom. Zie de materiaaltabel voor meer informatie. miRNA-isolatiekit bevat een spinkolom op basis van silicamembraan, lysisreagentia op basis van fenol/guanidine, guanidine/ethanolwasbuffer (wasbuffer 1), ethanolwasbuffer (wasbuffer 2) en nucleasevrij water. Deze stap vereist ongeveer 3 uur voor een steekproefgrootte van 10 HIGA-muizen en 10 controlemuizen.

  1. Bereid de volgende items voor: 1,5 of 2,0 ml opvangbuizen, 100% ethanol, chloroform, siliciumhomogenisator, micropipetten, pipetpunten, centrifuge, spinkolom met biopolymeerversnippering, spinkolom op basis van silicamembraan, lysisreagentia op basis van fenol/guanidine, guanidine/ethanolwasbuffer (wasbuffer 1), ethanolwasbuffer (wasbuffer 2) en nucleasevrij water.
  2. Homogeniseer 30 mg niermonsters met behulp van een siliciumhomogenisator en 700 μL van het op fenol/guanidine gebaseerde lysisreagens bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De miRNA's in het monster zijn kwetsbaar totdat ze zijn blootgesteld aan lysisreagens op basis van fenol/guanidine, dus deze stappen moeten onmiddellijk worden uitgevoerd.
  3. Breng het lysaat over naar de spinkolom van het biopolymeerversnipperaar en centrifugeer het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op 15.000 x g .
  4. Voeg 140 μL chloroform toe aan het filtraat en meng krachtig gedurende 15 s. Laat 2-3 minuten staan en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
  5. Breng het heldere supernatant voorzichtig over zonder de middelste laag aan te raken in een nieuwe opvangbuis en voeg het bepaalde volume (zie hieronder) van 100% ethanol toe. Vortex voor 5 s.
    OPMERKING: 100% ethanol bij 1,5x het volume van het verkregen supernatant is vereist.
  6. Breng het monster (bovengrens 700 μL) over in een spinkolom op basis van silicamembraan en centrifugeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 s bij 8.000 x g. Gooi het filtraat weg na centrifugeren.
  7. Voeg 700 μL wasbuffer 1 toe aan de centrifugeerkolom op basis van silicamembraan en centrifugeer de kolom bij kamertemperatuur gedurende 15 s bij 8.000 x g. Gooi het filtraat weg na centrifugeren.
  8. Voeg 500 μL wasbuffer 2 toe aan de centrifugeerkolom op basis van silicamembraan en centrifugeer deze gedurende 15 s bij kamertemperatuur bij 8.000 x g. Gooi het filtraat weg na centrifugeren.
  9. Voeg 500 μL wasbuffer 2 toe aan de centrifugeerkolom op basis van silicamembraan en centrifugeer deze gedurende 15 s bij kamertemperatuur bij 8.000 x g. Gooi het filtraat weg na centrifugeren.
  10. Centrifugeer de op silicamembraan gebaseerde spinkolom opnieuw zonder iets toe te voegen om extra ethanol te verwijderen, bij 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg na het centrifugeren.
  11. Vervang de buis die aan de spinkolom is bevestigd in een nieuwe opvangbuis.
  12. Voeg 30 μL nucleasevrij water toe aan de op silicamembraan gebaseerde spinkolom en centrifugeer deze gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur op 8.000 x g .
    OPMERKING: De resulterende 30 μL-oplossing bevat een hoge concentratie totaal RNA. Dit monster kan gedurende enkele maanden bij –80 °C worden bewaard.

3. Synthese van cDNA uit totaal RNA

OPMERKING: In deze stap wordt een in de handel verkrijgbare reverse transcriptiekit gebruikt. Zie de materiaaltabel voor meer informatie. Deze kit bevat nucleïnezuurmix, reverse transcriptasemix en buffer. Deze procedure moet op ijs worden uitgevoerd om progressie van de reactie te voorkomen. Deze stap vereist ongeveer 3 uur voor een steekproefgrootte van 10 HIGA-muizen en 10 controlemuizen.

  1. Bereid de volgende items voor: 1,5 ml verzamelbuizen, stripbuizen met acht putten, micropipetten, pipetpunten, spectrofotometer, nucleasevrij water, ijs, nucleïnezuurmengsel, reverse transcriptasemix, buffer en thermische cycler.
  2. Meet de concentratie van totaal RNA met behulp van een spectrofotometer. Bereken vervolgens het benodigde volume nucleasevrij water zodat 12 μL 1 μg totaal RNA bevat.
  3. Bereid een hoofdmengsel met de volgende inhoud: 2,0 μl nucleïnezuurmengsel, 2,0 μl reverse transcriptasemengsel en 4,0 μl buffer tot een totaal van 8,0 μl per monster.
  4. Voeg 8 μL van het hoofdmengsel toe aan elk putje van acht-well stripbuizen.
  5. Verdun totaal RNA in het volume nucleasevrij water berekend in 3.2. Voeg vervolgens 12 μL van de totale RNA-oplossing (met 1 μg totaal RNA) toe aan elk putje van stripbuizen met acht putten.
  6. Incubeer het monster in 8 putstripbuizen bij 37 °C gedurende 60 minuten met behulp van de thermische cycler. Incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 95 °C met behulp van de thermische cycler.
    OPMERKING: De oplossing na incubatie bevat een hoge concentratie cDNA.
  7. Breng deze oplossing over in een buis van 1,5 ml en voeg 200 μL nucleasevrij water toe.
    OPMERKING: De resulterende 200 μL oplossing kan worden gebruikt voor qRT-PCR als een sjabloon cDNA. Dit monster kan ongeveer 1 jaar bij –80 °C worden bewaard.

4. qRT-PCR van miRNA

OPMERKING: In deze stap wordt een in de handel verkrijgbare PCR-kit gebruikt. Zie de materiaaltabel voor meer informatie. Deze kit bevat PCR-mix, universele primer en nucleasevrij water. Monsters moeten in tweevoud worden bereid en de nauwkeurigheid van de resultaten moet in elk geval worden overwogen. Expressieniveaus van miRNA worden gekwantificeerd met de ΔΔCT-methode. Deze stap vereist ongeveer 4 uur voor een steekproefgrootte van 10 HIGA-muizen en 10 controlemuizen.

  1. Bereid de volgende items voor: 1,5 ml opvangbuis, 96-well reactieplaat, zelfklevende film voor de 96-well reactieplaat, micropipetten, pipetpunten, PCR-mix, universele primer, nucleasevrij water, miRNA-specifieke primers en een real-time PCR-instrument.
  2. Bereid het hoofdmengsel met de volgende inhoud: 12,5 μL PCR-mix, 2,5 μL universele primer, 1,25 μL 5 μM miRNA-specifieke primer en 6,25 μL nucleasevrij water voor elke put.
    OPMERKING: In deze test werden primers gebruikt die specifiek zijn voor miRNA's [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p en miR-21-5p]. RNU6-2 werd gebruikt als endogene controle14.
  3. Voeg 22,5 μL van het mastermengsel toe aan elk putje van de 96-putreactieplaat.
  4. Voeg 2,5 μL cDNA bereid in stap 3.7 toe aan de individuele put van de 96-putplaat.
  5. Bedek de 96-putreactieplaat met adhesiefilm en centrifugeer vervolgens gedurende 30 s op 1.000 x g .
  6. Voer het real-time PCR-instrument uit. Programmeer het PCR-instrument als volgt: initiële activering bij 95 °C gedurende 15 minuten, vervolgens 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s en extensie bij 70 °C gedurende 30 s.
  7. Kwantificeer genexpressie met behulp van de ΔΔCT-methode. Relatieve expressieniveaus worden bepaald als 2-ΔΔCT.
    OPMERKING: Abnormale PCR-versterkingscurven moeten worden overwogen om uit te sluiten van de resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We onderzochten de expressieniveaus van miRNA's in de nieren van HIGA-muizen (n = 10). Dit resultaat is volledig verkregen op basis van het beschreven protocol. De nieren van Balb/c muizen werden geselecteerd als controle (n=10). In beide groepen werd gekozen voor een leeftijd van 25 weken. Alleen vrouwelijke HIGA-muizen waren verkrijgbaar bij de leverancier. De expressieniveaus van drie miRNA's (miR-155-5p, miR-146a-5p en miR-21-5p; Figuur 1) werden gedetecteerd, waarvan eerder werd gemeld ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We waren in staat om de expressieniveaus van miRNA's in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen) te meten met behulp van deze nieuwe methode. IgA-nefropathie is een onverklaarbare ziekte die verder onderzoek nodig heeft om de etiologie en therapeutische doelen te verduidelijken 1,3. Het verkrijgen van menselijke niermonsters is echter zeer invasief. Deze nieuwe techniek is voordelig omdat het de studie van IgA-nefropathie met behulp van kleine die...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

We danken Sarah Williams, PhD, van Edanz Group (www.edanzediting.com) voor het redigeren van een concept van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)Japan SLC, Inc.noneMuis voor controle
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)Japan SLC, Inc.noneIgA-nefropathie muismodel
MicroAmp Optical 96 well reactieplaat voor qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reactieplaat
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971hechtfolie voor 96-well reactieplaat
miScript II RT kitQiagen218161Experimenteel kit voor synthese van cDNA
miRNeasy Mini kitQiagen217004Experimenteel kit voor extractie van totaal RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)QiagenMS00033740miRNA-specifieke primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)QiagenMS00001701miRNA-specifieke primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)QiagenMS00001638miRNA-specifieke primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)QiagenMS00009079miRNA-specifieke primer
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073Experimenteel kit voor real-time PCR
QIA shredderQiagen79654spinkolom voor biopolymeer-versnippering
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR systeemThermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software versie 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument software
takara biomasher standaardTakara Bio9790Bsilicium homogenisator

Referenties

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403(2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209(2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

IgA nefropathienierbioptenRNA purificatiecDNA syntheseqRT PCRHIGA muizenmiR 155 5pmiR 21 5pdelta delta CT methode

Gerelateerde artikelen