Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Epitheliale organoïde modellen dienen als waardevolle hulpmiddelen om de basisbiologie van een orgaansysteem te bestuderen en voor ziektemodellering. Wanneer ze als organoïden worden gekweekt, kunnen epitheliale voorlopercellen zichzelf vernieuwen en onderscheidende nakomelingen genereren die cellulaire functies vertonen die vergelijkbaar zijn met die van hun in vivo tegenhangers. Hierin beschrijven we een stapsgewijs protocol om regiospecifieke voorlopercellen uit menselijke longen te isoleren en 3D-organoïde culturen te genereren als een experimenteel en validatie-instrument. We definiëren proximale en distale gebieden van de long met als doel regiospecifieke voorlopercellen te isoleren. We gebruikten een combinatie van enzymatische en mechanische dissociatie om totale cellen uit de long en luchtpijp te isoleren. Specifieke voorlopercellen werden vervolgens gefractioneerd uit de proximale of distale oorsprongscellen met behulp van fluorescentie geassocieerde celsortering (FACS) op basis van celtypespecifieke oppervlaktemarkers, zoals NGFR voor het sorteren van basale cellen en HTII-280 voor het sorteren van alveolaire type II-cellen. Geïsoleerde basale of alveolaire type II-voorlopers werden gebruikt om 3D-organoïde culturen te genereren. Zowel distale als proximale voorlopercellen vormden organoïden met een kolonievormende efficiëntie van 9-13% in distale regio en 7-10% in proximale regio bij verguld 5000 cel / put op dag 30. Distale organoïden handhaafden HTII-280+ alveolaire type II-cellen in cultuur, terwijl proximale organoïden op dag 30 differentieerden in trilhaar- en secretoire cellen. Deze 3D organoïde culturen kunnen worden gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het bestuderen van de celbiologie van longepitheel en epitheliale mesenchymale interacties, evenals voor de ontwikkeling en validatie van therapeutische strategieën gericht op epitheliale disfunctie bij een ziekte.
Inleiding
Luchtruimen van het menselijke ademhalingssysteem kunnen grofweg worden onderverdeeld in geleidende en respiratoire zones die respectievelijk het transport van gassen en hun daaropvolgende uitwisseling over de epitheliaal-microvasculaire barrière bemiddelen. De geleidende luchtwegen omvatten luchtpijpen, bronchiën, bronchiolen en terminale bronchiolen, terwijl ademhalingsluchtruimten respiratoire bronchiolen, alveolaire kanalen en longblaasjes omvatten. De epitheliale bekleding van deze luchtruimen verandert in samenstelling langs de proximo-distale as om tegemoet te komen aan de unieke vereisten van elke functioneel verschillende zone. Het pseudostratified epitheel v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijk longweefsel werd verkregen van overleden weefseldonoren in overeenstemming met toestemmingsprocedures ontwikkeld door het International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) en goedgekeurd door de Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Weefselverwerking voor isolatie van longcellen uit tracheo-bronchiale of kleine luchtweg/parenchymale (kleine luchtwegen en longblaasjes) regio's
- Bereid en autoclaaf alle dissectie-instrumenten, glaswerk en de juiste oplossingen een dag voorafgaand aan celisolatie.
- Na ontvangst van longweefsel, identificeer en scheid de proximale en distale regio's. De l....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bron longweefsel
De luchtpijp en extrapulmonale bronchus (figuur 1A) werden gebruikt als bronweefsel voor isolatie van proximale luchtwegepitheelcellen en de daaropvolgende generatie proximale organoïden. Distale longweefsels met zowel parenchym als kleine luchtwegen met een diameter van minder dan 2 mm (figuur 1A) werden gebruikt voor de isolatie van kleine luchtweg- en alveolaire epitheelcellen (distal longepitheel) en het genereren van kle.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven een betrouwbare methode voor de isolatie van gedefinieerde subpopulaties van longcellen uit menselijk longweefsel voor moleculaire of functionele analyse en ziektemodellering. Kritieke elementen van methoden zijn onder meer het vermogen om weefseldissociatie te bereiken met behoud van oppervlakte-epitopen, die antilichaam-gemedieerde verrijking van vers geïsoleerde cellen mogelijk maken, en de optimalisatie van kweekmethoden voor de efficiënte generatie van regiospecifieke epitheliale organoïden. We richte.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We waarderen de steun van Mizuno Takako voor IFC- en H- en E-kleuring, Vanessa Garcia voor weefselsectie en Anika S Chandrasekaran voor hulp bij het voorbereiden van manuscripten. Dit werk wordt ondersteund door National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) en Celgene IDEAL Consortium.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celisolatie | |||
| 10 mL steriele spuiten, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL steriele spuiten, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard zakken | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard zakken | VWR | 89495-440 | |
| verbindingsring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Instelbare petrischalen | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Trechter | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| naald 16G | VWR | 305198 | |
| naald 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Celstrainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Celstrainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Celstrainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Celstrainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Celstrainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Hoebeden | VWR | 55411-050 | |
| Rode bloedcel lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetaal bovien serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml fles |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| Lijst met antilichamen voor FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antilichaam | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 totale cellen |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 totale cellen |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antilichaam | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Samenstelling van organoïdcultuur media | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Steriele | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Muis Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetaal bovien serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| Lijst met antilichamen voor Immunohistochemie | |||
| Antigen unmasking oplossing, op basis van citroenzuur | Vector | H-3300 | 937 µl in 10 |
Referenties
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
