Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

9.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61541

⸱

21 juli 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Samenvatting

Epitheliale organoïde modellen dienen als waardevolle hulpmiddelen om de basisbiologie van een orgaansysteem te bestuderen en voor ziektemodellering. Wanneer ze als organoïden worden gekweekt, kunnen epitheliale voorlopercellen zichzelf vernieuwen en onderscheidende nakomelingen genereren die cellulaire functies vertonen die vergelijkbaar zijn met die van hun in vivo tegenhangers. Hierin beschrijven we een stapsgewijs protocol om regiospecifieke voorlopercellen uit menselijke longen te isoleren en 3D-organoïde culturen te genereren als een experimenteel en validatie-instrument. We definiëren proximale en distale gebieden van de long met als doel regiospecifieke voorlopercellen te isoleren. We gebruikten een combinatie van enzymatische en mechanische dissociatie om totale cellen uit de long en luchtpijp te isoleren. Specifieke voorlopercellen werden vervolgens gefractioneerd uit de proximale of distale oorsprongscellen met behulp van fluorescentie geassocieerde celsortering (FACS) op basis van celtypespecifieke oppervlaktemarkers, zoals NGFR voor het sorteren van basale cellen en HTII-280 voor het sorteren van alveolaire type II-cellen. Geïsoleerde basale of alveolaire type II-voorlopers werden gebruikt om 3D-organoïde culturen te genereren. Zowel distale als proximale voorlopercellen vormden organoïden met een kolonievormende efficiëntie van 9-13% in distale regio en 7-10% in proximale regio bij verguld 5000 cel / put op dag 30. Distale organoïden handhaafden HTII-280+ alveolaire type II-cellen in cultuur, terwijl proximale organoïden op dag 30 differentieerden in trilhaar- en secretoire cellen. Deze 3D organoïde culturen kunnen worden gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het bestuderen van de celbiologie van longepitheel en epitheliale mesenchymale interacties, evenals voor de ontwikkeling en validatie van therapeutische strategieën gericht op epitheliale disfunctie bij een ziekte.

Inleiding

Luchtruimen van het menselijke ademhalingssysteem kunnen grofweg worden onderverdeeld in geleidende en respiratoire zones die respectievelijk het transport van gassen en hun daaropvolgende uitwisseling over de epitheliaal-microvasculaire barrière bemiddelen. De geleidende luchtwegen omvatten luchtpijpen, bronchiën, bronchiolen en terminale bronchiolen, terwijl ademhalingsluchtruimten respiratoire bronchiolen, alveolaire kanalen en longblaasjes omvatten. De epitheliale bekleding van deze luchtruimen verandert in samenstelling langs de proximo-distale as om tegemoet te komen aan de unieke vereisten van elke functioneel verschillende zone. Het pseudostratified epitheel van tracheo-bronchiale luchtwegen bestaat uit drie belangrijke celtypen, basaal, secretoir en trilhaar, naast de minder overvloedige celtypen waaronder borstel, neuro-endocriene en ionocyt 1,2,3. Bronchiolaire luchtwegen herbergen morfologisch vergelijkbare epitheelceltypen, hoewel er verschillen zijn in hun overvloed en functionele eigenschappen. Basale cellen zijn bijvoorbeeld minder overvloedig in bronchiolaire luchtwegen en secretoire cellen omvatten een groter aandeel clubcellen versus sereuze en bokaalcellen die overheersen in tracheo-bronchiale luchtwegen.  Epitheelcellen van de ademhalingszone omvatten een slecht gedefinieerd cuboidaal celtype in respiratoire bronchiolen, naast alveolaire type I (ATI) en type II (ATII) cellen van alveolaire kanalen en longblaasjes 1,4.

De identiteit van epitheelstam- en voorloperceltypen die bijdragen aan het behoud en de vernieuwing van epithelia in elke zone zijn onvolledig beschreven en grotendeels afgeleid uit studies in diermodellen 5,6,7,8. Studies bij muizen hebben aangetoond dat basale cellen van pseudostratified airways, of clubcellen van bronchiolaire luchtwegen of ATII-cellen van het alveolaire epitheel, dienen als epitheelstamcellen op basis van capaciteit voor onbeperkte zelfvernieuwing en multipotente differentiatie 7,9,10,11,12 . Ondanks het onvermogen om genetische afstammingstraceringsstudies uit te voeren om de stamheid van menselijke longepitheelceltypen te beoordelen, biedt de beschikbaarheid van op organoïden gebaseerde kweekmodellen om het functionele potentieel van epitheliale stam- en voorlopercellen te beoordelen een hulpmiddel voor vergelijkende studies tussen muis en mens 13,14,15,16,17.

We beschrijven methoden voor de isolatie van epitheelceltypen uit verschillende regio's van de menselijke long en hun cultuur met behulp van een 3D-organoïde systeem om de regionale celtypen samen te vatten. Soortgelijke methoden zijn ontwikkeld voor de functionele analyse en ziektemodellering van epitheelcellen uit andere orgaansystemen 18,19,20,21. Deze methoden bieden een platform voor de identificatie van regionale epitheliale voorlopercellen, om mechanistische studies uit te voeren die hun regulatie en micro-omgeving onderzoeken, en om ziektemodellering en medicijnontdekking mogelijk te maken. Hoewel studies van longepitheelvoorlopercellen uitgevoerd in diermodellen baat kunnen hebben bij de analyse, hetzij in vivo of in vitro, zijn inzichten in de identiteit van menselijke longepitheelvoorlopercellen grotendeels afhankelijk van extrapolatie van modelorganismen. Als zodanig bieden deze methoden een brug om de identiteit en het gedrag van menselijke longepitheelceltypen te relateren aan hun studies die de regulatie van stam- / voorlopercellen onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijk longweefsel werd verkregen van overleden weefseldonoren in overeenstemming met toestemmingsprocedures ontwikkeld door het International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) en goedgekeurd door de Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.

1. Weefselverwerking voor isolatie van longcellen uit tracheo-bronchiale of kleine luchtweg/parenchymale (kleine luchtwegen en longblaasjes) regio's

  1. Bereid en autoclaaf alle dissectie-instrumenten, glaswerk en de juiste oplossingen een dag voorafgaand aan celisolatie.
  2. Na ontvangst van longweefsel, identificeer en scheid de proximale en distale regio's. De luchtpijp en bronchiën worden beschouwd als "proximaal". Voor de toepassing van dit protocol worden luchtpijp en de eerste 2-3 generaties bronchiën geseceerd en gebruikt voor de isolatie van "proximaal" luchtwegepitheel. Kleine luchtwegen met een diameter van 2 mm of minder en het omliggende parenchymale weefsel worden voor de toepassing van dit protocol beschouwd als "distale" longepitheel (figuur 1A).
    OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot de verwerking van menselijk longweefsel moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

2. Verrijking en subsetting van kleine luchtweg- en alveolaire epitheliale voorlopercellen uit distal longweefsel

  1. Distale weefselpreparaat
    1. Plaats het distale longweefsel in een steriele petrischaal (150 x 15 mm). Snijd weefsel in ongeveer 1 cm3 stukjes en plaats in een schone buis van 50 ml.
    2. Was het weefsel 3x met gekoelde HBSS, gooi HBSS-was elke keer weg om bloed en epitheliale voeringvloeistof te verwijderen.
    3. Leg het doekje in een nieuwe petrischaal en dep droog met steriele antipluisdoekjes. Verwijder met behulp van een tang en een schaar zoveel mogelijk visceraal borstvlies (een delicaat transparant membraan dat het oppervlak van de long bedekt).
    4. Gebruik een schaar om weefsel te hakken in stukjes met een diameter van ongeveer 2 mm. Breng gehakt weefsel over in een schone petrischaal en hak het verder door het te hakken tot een geschatte grootte van 1 mm met een steriel enkelzijdig scheermesje.
  2. Enzymvertering
    OPMERKING: Liberase stockoplossing is 5 mg / ml (100x) en DNase-voorraad is 2,5 mg / ml (100x) (tabel met materialen).
    1. Voeg 50 μg/ml Liberase en 25 μg/ml DNase toe aan steriel HBSS in een conische buis van 50 ml.
    2. Breng ongeveer 2-3 g gehakt weefsel over naar een nieuwe conische buis van 50 ml met 25 ml HBSS, die Liberase en DNase bevat. Incubeer gedurende 40-60 min bij 37 °C met continu schudden met behulp van een mixer ingesteld op 900 rpm. Na 30 minuten incubatie triturate verteerde het weefsel met behulp van een spuit van 30 ml zonder naald om de vorming van klonten te voorkomen en door te gaan met de incubatie.
      OPMERKING: Incubatietijd met de enzymen kan variëren, afhankelijk van het type of de toestand van het weefsel. De enzymatische vertering van normaal weefsel duurt bijvoorbeeld ongeveer 45 minuten. Fibrotisch weefsel van idiopathische longfibrosemonsters kan echter een langere incubatietijd van maximaal 60 minuten vereisen. Controleer daarom het weefsel zorgvuldig tijdens deze stap om schade aan de oppervlaktemarkers te voorkomen, wat cruciaal is voor FACS.
  3. Eencellige isolatie
    1. Trituur het weefsel door 5x door een naald van 16 G te trekken die op een spuit van 30 ml is gemonteerd. Trek de weefselsuspensie in een pipet met brede boring en passeer een reeks celzeefmachines (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) onder vacuümdruk. Was de zeef met 20 ml HBSS+ buffer om de resterende cellen te verzamelen. Het recept voor HBSS+ buffer is te vinden in Table of Materials.
    2. Voeg na 45 minuten een gelijk volume HBSS+-buffer toe aan het filtraat om de Liberase-activiteit te remmen en oververtering te voorkomen.
    3. Filtratencentrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg. Voeg 1 ml rode bloedcel (RBC) lysisbuffer toe aan de pellet, schommel voorzichtig de buis om de pellet los te maken en incubeer gedurende 1 minuut op ijs.
      OPMERKING: De hoeveelheid en tijd in de RBC-lysisoplossing is afhankelijk van de grootte van de pellet. Het is belangrijk om de cellen op ijs te houden en de tijd in de RBC-lysisoplossing zorgvuldig te controleren om lysis van doelcellen te voorkomen. Als RBC-lysis onvoldoende is, herhaalt u de stap.
    4. Voeg 10-20 ml HBSS+ buffer toe om de RBC-lysisbuffer te neutraliseren. Filtratencentrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Als gelyseerde rode bloedcellen (spookcellen) een troebele laag boven de celpellet vormen, resuspendeer pellet dan in 10 ml HBSS + -buffer en zeef de suspensie door 70 μm celzeef om de spookcellen te elimineren. Centrifugeer het filtraat bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en ga verder met verdere stappen.
  4. Uitputting van immuuncellen en endotheelcellen (optionele stap)
    1. Put CD31+ endotheelcellen en CD45+ immuuncellen uit de pool van totale cellen uit met behulp van de CD31 &CD45 microbeads geconjugeerd aan monoklonale anti-humane CD31 en CD45 antilichaam (isotype muis IgG1) en LS kolommen in overeenstemming met het protocol van de fabrikant (Tabel van Materialen).
    2. Verzamel de doorstroom, voornamelijk bestaande uit epitheliale en stromale cellen, in een verse steriele buis en centrifugeer deze bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voer een celtelling uit om het totale aantal cellen in de doorstroom vast te stellen.
  5. Kleuring van het celoppervlak voor fluorescentie-geassocieerde celsortering (FACS)
    1. Resuspend 1 x 107 cellen per 1 ml HBSS+ buffer. Voeg primaire antilichamen toe in de vereiste concentratie en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. In deze studie werden fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen gebruikt, tenzij anders vermeld. Details van antilichaambronnen en titers worden beschreven in de tabel met materialen.
      OPMERKING: HTII-280 is momenteel het beste oppervlakte reactieve antilichaam dat subsetting van distale longcellen mogelijk maakt in voornamelijk luchtweg (HTII-280-) en alveolaire type 2 (HTII-280+) celfracties. Een kanttekening bij deze strategie is dat AT1-cellen niet gekleurd zijn met behulp van deze methode en slecht vertegenwoordigd zijn vanwege hun kwetsbaarheid. AT1-cellen zijn echter slecht vertegenwoordigd in distale longpreps, vermoedelijk vanwege hun kwetsbaarheid en verlies tijdens de selectie van levensvatbare cellen door FACS en vertegenwoordigen dus slechts een zeldzame verontreiniging van de luchtwegcelfractie.
    2. Was cellen door toevoeging van 3 ml HBSS+-buffer en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Voeg bij gebruik van niet-geconjugeerde primaire antilichamen de vereiste concentratie van een geschikt fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Spoel overtollig secundair antilichaam af door toevoeging van 3 ml HBSS+-buffer en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Gooi het supernatant weg en resuspendeer cellen in HBSS+ buffer per 1 x 107 cellen/ ml. Filter cellen in 5 ml polystyreenbuizen door een zeefdop om de vorming van een eencellige suspensie te garanderen. Voeg DAPI (1 μg/ml) toe aan kleuringsdoorlatende (dode) cellen.
      OPMERKING: Het is essentieel om geschikte single-color en fluorescentie minus één (FMO) controles te gebruiken (d.w.z. antilichaamkleuringscocktail minus één antilichaam elk), om valse positieven tijdens FACS te minimaliseren. In deze studie werden positieve en negatieve selectieparels gebruikt voor empirische compensatie voor overlap van emissiespectra tussen fluoroforen (Tabel van materialen). FACS verrijken celtypen van belang. Levensvatbare epitheelcellen worden verrijkt op basis van hun CD45-negatieve, CD31-negatieve, CD236-positieve celoppervlakfenotype en negatieve kleuring voor DAPI. Deze epitheelcelfractie kan verder worden onderverdeeld op basis van kleuring voor celtypespecifieke oppervlaktemarkers, zoals specifieke kleuring voor HTII-280-positieve cellen die zijn verrijkt voor AT2-cellen. Negatieve selectie voor HTII-280 daarentegen maakt de verrijking mogelijk van kleine luchtwegepitheelcellen zoals knots- en trilhaarcellen (figuur 2).

3. Verrijking en subsetting van epitheliale voorlopercellen uit tracheo-bronchiale luchtwegen

  1. Weefselvoorbereiding
    1. Ontleed proximale luchtwegen (luchtpijp/bronchiën) uit de longen. Open luchtwegen over hun lengte met behulp van een schaar om het lumen bloot te leggen en voeg 50 μg / ml Liberase toe om het weefsel volledig te bedekken.
    2. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C met continu schudden met behulp van een thermomenger ingesteld op 900 tpm.
    3. Verwijder de proximale luchtweg uit de centrifugebuis en plaats deze in een steriele petrischaal (150 x 15 mm). Schraap voorzichtig het oppervlak van de luchtweg met behulp van een scalpel om luminale epitheelcellen volledig uit het weefsel te verwijderen.
    4. Was de petrischaal met 5 ml steriele HBSS+-buffer om alle losgeraakte luminale epitheelcellen te verzamelen en breng de losgeraakte cellen over naar een conische centrifugebuis van 50 ml. Trituur de suspensie door 5x door 16 G naald en 18 G naald gemonteerd op een 10 ml spuit te trekken om eencellige suspensie te krijgen.
    5. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in verse HBSS+ buffer en sla deze luminale luchtwegcellen op ijs op, klaar om te worden gecombineerd met de eencellige suspensie gegenereerd uit de gehakte proximale luchtwegen in de komende stappen.
    6. Knip met een schaar het resterende tracheo-bronchiale weefsel langs de ringen om kleine stroken weefsel te genereren en breng de strips over naar een verse petrischaal. Gehakt de tissue strips met behulp van een enkelzijdig scheermesje om kleinere stukjes te maken.
      OPMERKING: Aangezien de proximale luchtwegen kraakbeenachtig zijn, kunnen ze niet zo fijn worden gehakt als het distale longweefsel.
    7. Breng het gehakte weefsel over in de C-buisjes, voeg 2 ml Liberase toe aan de buis en zorg ervoor dat het weefsel wordt ondergedompeld. Laad de C-buis op de geautomatiseerde dissociator en voer Human Lung Protocol-2 uit om weefsel mechanisch verder te dissociëren.
      OPMERKING: De dissociator die in dit protocol wordt gebruikt, biedt een geoptimaliseerd programma genaamd human lung protocol-2 voor deze specifieke toepassing (zie materiaaltabel).
  2. Enzymvertering en eencellige isolatie
    1. Breng ongeveer 2 g gehakt proximaal weefsel uit de C-buis over in elke conische centrifugebuis van 50 ml en voeg 50 μg/ml Liberase en 25 μg/ml DNase-oplossing toe aan elke buis.
      OPMERKING: Om een efficiënte dissociatie te garanderen, mogen buizen niet verder worden gevuld dan de 30 ml-markering.
    2. Incubeer het gehakte weefsel gedurende 45 minuten bij 37 °C met continu schudden met behulp van een mixer ingesteld op 900 rpm.
    3. Laat de gedissocieerde weefselsuspensie onder vacuümdruk zoals hierboven vermeld door een reeks celzeefmachines (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) lopen en verzamel de stroom door. Was de zeef met 20 ml HBSS+ buffer om de resterende cellen te verzamelen.
      OPMERKING: Aangezien proximaal weefsel kraakbeenachtig en omvangrijk is in vergelijking met het distale weefsel, is er een grotere kans op verstopping van de filters. Het gebruik van een trechter kan helpen voorkomen dat de vloeistof overloopt tijdens het passeren van de zeven.
    4. Voeg een gelijk volume HBSS+-buffer toe aan het filtraat om de Liberase-activiteit te remmen en oververtering te voorkomen. Voeg de geïsoleerde luminale proximale luchtwegcellen van 3.1.5 toe aan de celsuspensie in deze stap.
    5. Centrifugeer de gecombineerde celsuspensie bij 500 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en herhaal de celwas in HBSS+ buffer. Voer uitputting uit van CD45+ immuuncellen en CD31+ endotheelcellen zoals hierboven vermeld in 2.4 (optionele stap).
    6. Methoden voor kleuring zijn vergelijkbaar met distal longweefsel, volg de stappen in 2.5. Verrijk levensvatbare epitheelcellen op basis van hun CD45-negatieve, CD31-negatieve, CD236-positieve celoppervlakfenotype en negatieve kleuring voor DAPI.
    7. Verdere subset van de epitheelcelfractie op basis van kleuring voor celtypespecifieke oppervlaktemarkers, zoals NGFR, waardoor verrijking van basale (NGFR-positieve) en niet-basale (NGFR-negatieve; secretoire, trilhaarvormige, neuro-endocriene) celtypen mogelijk is (figuur 3).

4. Organoïde cultuur

  1. Voeg 5.000 toe (dit aantal kan worden aangepast om de gewenste dichtheid van epitheliale organoïden te verkrijgen) gesorteerde proximale of distale epitheelcellen om de buis van 1,5 ml te sterielen, samen met 7,5 x 104 MRC-5-cellen (menselijke longfibroblastcellijn). Epitheliaal-mesenchymale interacties zijn van cruciaal belang voor de uitbreiding van voorlopercellen.
  2. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Het is belangrijk om handmatig het celgetal te bevestigen dat is verkregen van de sorteerder om de nauwkeurigheid van de efficiëntie van organoïde kolonievorming te garanderen.
  3. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendeer de celpellet in 50 μL ijskoude media aangevuld met antibiotica. Houd de celsuspensie op ijs.
  4. Voeg 50 μL ijskoud 1x groeifactor uitgeput keldermembraanmatrixmedium toe aan de injectieflacon en pipetteer de suspensie voorzichtig op ijs om te mengen.
    OPMERKING: Het is belangrijk om ijskoude media te gebruiken en cellen op ijs te houden om voortijdige polymerisatie van het keldermembraanmatrixmedium te voorkomen.
  5. Breng de celsuspensie over op een celcultuurinzetstuk van 0,4 μm ter grootte van een poriegrootte in een plaat met 24 putten (1,4 x 104 cellen/cm2), waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan.
  6. Incubeer bij 37 °C gedurende 30-45 minuten om de matrix te laten stollen.
  7. Voeg 600 μL voorverwarmd groeimedium toe aan de put.
    OPMERKING: Media werd aangevuld met antimycotica (0,4%) en Pen strep (1%) gedurende de eerste 24 uur na het zaaien en 10 μM Rho kinaseremmer gedurende de eerste 72 uur.
  8. Kweek bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 30 dagen, gedurende welke tijd de media om de 48 uur moeten worden vervangen.
    OPMERKING: De duur van de cultuur kan worden gewijzigd op basis van het doel van het experiment. Langere eindpunten worden gebruikt om differentiatie te bestuderen, terwijl kortere eindpunten van 7 dagen, 14 dagen enz., Kunnen worden gebruikt als het doel van het experiment niet is om volledige differentiatie te bereiken.
  9. Voeg gedurende 15 dagen 10 μM TGFβ-remmer toe aan de kweekmedia om de cellen in de proliferatieve fase te houden en overgroei van fibroblasten te onderdrukken.
    OPMERKING: De resultaten verschillen afhankelijk van het kweekmedium dat voor de test wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, de hierin getoonde resultaten werden gegenereerd met behulp van Pneumacult-ALI Medium, wat resulteert in de generatie van grote organoïden uit distale long, goed gedifferentieerde en grotere organoïden uit proximale long.

5. Organoïde kleuring

  1. Fixeren en inbedden van organoïden
    1. Aspirateer media uit zowel de bovenste als de onderste transmembraaninzetkamers en spoel eenmaal af met warme PBS.
    2. Fixeer de culturen door 300 μL PFA (2% w/v) in de insert en 500 μL in de put gedurende 1 uur bij 37°C te plaatsen. Verwijder het fixatief en spoel af met warme PBS, waarbij u ervoor zorgt dat de basememtmembraanmatrixplug niet loskomt.
      OPMERKING: Vaste organoïden kunnen gedurende één tot twee weken ondergedompeld in PBS bij 4 °C worden bewaard voordat verdere stappen worden ondernomen.
    3. Aspirateer PBS, keer de insert om en snijd voorzichtig het insertmembraan rond de periferie. Verwijder met behulp van een tang het transwell-membraan en zorg ervoor dat de matrixplug niet wordt verstoord.
    4. Tik in een petrischaaltje op de insert om de matrixplug te herstellen.
    5. Voeg een druppel monsterverwerkingsgel zoals Histogel (gehandhaafd op 37 °C) toe aan de matrixplug en blijf op 4 °C totdat de gel stolt.
    6. Breng de plug over naar een insluitcassette, droog uit door toenemende concentraties ethanol (70, 90 en 100%), helder in xyleen en ingebed in paraffinewas.
    7. Snijd 7 μm secties op een microtoom en verzamel op positief geladen dia's.
  2. Immunofluorescentiekleuring van organoïden
    1. Plaats de schuiven op 65 °C gedurende 30 minuten om de was te ontwas.
    2. Deparaffineer de secties door onderdompeling in xyleen en rehydrateer door afnemende concentraties ethanol.
    3. Voer antigeenophaling bij hoge temperatuur uit in antigeenontmaskeringsoplossing, citroenzuurbase met behulp van een in de handel verkrijgbare retriever door dia's gedurende 15 minuten in de oplossing te dopen (materiaaltabel).
    4. Omring het weefsel met een hydrofobe barrière met behulp van een pappen.
    5. Blokkeer niet-specifieke kleuring tussen de primaire antilichamen en het weefsel, door te broeden in Blokkerende buffer.
    6. Incubeer secties in de juiste concentratie van primaire antilichamen verdund in incubatieoplossing 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    7. Spoel secties 3x op kamertemperatuur met een wasbuffer.
    8. Incubeer in de juiste concentratie van geconjugeerd geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    9. Spoel secties 3x bij kamertemperatuur met 0,1% Tween 20-TBS. Incubeer secties gedurende 5 minuten in DAPI (1 μg/ml). Spoel secties eenmaal in TBS (Tris-buffered saline) met 0,1% Tween 20, droog en monteer in een montageoplossing (figuur 4 en figuur 5).
      OPMERKING: Bron- en optimale werkverdunning van primaire en secundaire antilichamen die worden gebruikt voor immunofluorescentiekleuring zijn opgenomen in de materiaaltabel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bron longweefsel
De luchtpijp en extrapulmonale bronchus (figuur 1A) werden gebruikt als bronweefsel voor isolatie van proximale luchtwegepitheelcellen en de daaropvolgende generatie proximale organoïden. Distale longweefsels met zowel parenchym als kleine luchtwegen met een diameter van minder dan 2 mm (figuur 1A) werden gebruikt voor de isolatie van kleine luchtweg- en alveolaire epitheelcellen (distal longepitheel) en het genereren van kle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven een betrouwbare methode voor de isolatie van gedefinieerde subpopulaties van longcellen uit menselijk longweefsel voor moleculaire of functionele analyse en ziektemodellering. Kritieke elementen van methoden zijn onder meer het vermogen om weefseldissociatie te bereiken met behoud van oppervlakte-epitopen, die antilichaam-gemedieerde verrijking van vers geïsoleerde cellen mogelijk maken, en de optimalisatie van kweekmethoden voor de efficiënte generatie van regiospecifieke epitheliale organoïden. We richte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We waarderen de steun van Mizuno Takako voor IFC- en H- en E-kleuring, Vanessa Garcia voor weefselsectie en Anika S Chandrasekaran voor hulp bij het voorbereiden van manuscripten. Dit werk wordt ondersteund door National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) en Celgene IDEAL Consortium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celisolatie
10 mL steriele spuiten, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 mL steriele spuiten, Luer-Lok TipVWRBD302832
Biohazard zakkenVWR89495-440
Biohazard zakkenVWR89495-440
verbindingsringPluriselect41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Instelbare petrischalenCorning/Falcon25373-187
TrechterPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
naald 16GVWR305198
naald 18GVWR305199
PluriStrainer 100 µm (Celstrainer)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Celstrainer)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Celstrainer)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Celstrainer)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Celstrainer)Pluriselect43-50070-51
HoebedenVWR55411-050
Rode bloedcel lysis buffereBioscience00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS ColumnsMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermo fisher scientificAM9260G500µl
Fetaal bovien serumGemini Bio-Products100-10610ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456500ml fles
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific156400555ml
Lijst met antilichamen voor FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) AntilichaamBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles setFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-93520µl/ 107 totale cellen
CD45 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-80120µl/ 107 totale cellen
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-human CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-human CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-human CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-mouse IgM AntilichaamBioLegend4065061:500
Mouse IgM anti human HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anti-human CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Samenstelling van organoïdcultuur media
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Small Airway Epithelial Cell Growth MediumPromoCellC-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, SterieleGreiner Bio-One662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)Stemcell Technologies72302
Muis Basal medium:
Amphotericin BThermo fisher scientific1529001850 µl
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Fetaal bovien serumGemini Bio-Products100-1065 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific15640055500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)Stem cell722345 µl
Lijst met antilichamen voor Immunohistochemie
Antigen unmasking oplossing, op basis van citroenzuurVectorH-3300937 µl in 10

Referenties

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050(2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634(2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Fluorescentie geactiveerde cel sorteringweefseldissociatieceloppervlaktemarkersNGFR basale cellenHTII 280 alveolaire cellendepletie met magnetische kralenkolonievormende effici ntie3D organo degeneratie
Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.