Methodenartikel

Genmining en sequentieanalyse van purinenucleosidase op basis van RNA-Seq

DOI:

10.3791/61561

⸱

20 oktober 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Hepatopathy, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werd een methode beschreven voor genmining en sequentieanalyse van purinenucleosidase (PN, EC:3.2.2.1) op basis van RNA-Seq. ProtProm-analyse werd toegepast om de unieke secundaire en tertiaire structuren van PN aan te tonen. Bovendien werd het PN-gen gekloond uit transcriptoom om de betrouwbaarheid van RNA-Seq-resultaten te verifiëren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rupsenschimmel (Ophiocordyceps sinensis) is een van de meest gewaardeerde schimmels Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) en bevat veel actieve ingrediënten zoals adenosine. Adenosine wordt beschouwd als een biologisch effectief ingrediënt met een verscheidenheid aan antitumor- en immunomodulerende activiteiten. Om het mechanisme van purinenucleosidase (PN) in de biosynthese van adenosine verder op te helderen, werd met succes een gen dat codeert voor PN gedolven en verder geanalyseerd op basis van de RNA-Seq-database van rupsenschimmels. Het cDNA van PN over de volledige lengte was 855 bp, wat codeerde voor 284 aminozuren. BLAST-analyse toonde de hoogste homologie van 85,06% met nucleosidehydrolase in NCBI. ProtProm-analyse toonde aan dat het relatieve molecuulgewicht 30,69 kDa was en het iso-elektrische punt 11,55. De secundaire structuur van PN werd voorspeld door Predict Protein; De resultaten toonden aan dat de alfa-helixstructuur goed was voor 28,17%, de strengstructuur voor 11,97% en de lusstructuur voor 59,86%. Bovendien werd het PN-gen verder gekloond uit transcriptoom en gedetecteerd door agarosegelelektroforese voor verificatie. Deze studie biedt een meer voldoende wetenschappelijke basis en nieuwe ideeën voor de genetische regulatie van adenosinebiosynthese in schimmel-TCM.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schimmel Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft overvloedige soortenbronnen 1,2. Rupsenschimmel (Ophiocordyceps sinensis) is een bekende schimmel TCM en wordt beschouwd als een bron van innovatieve medicijnen 3,4. Rupsenschimmel is een gecombineerd mengsel van wormen en schimmels dat wordt gevonden op het Tibetaanse plateau in het zuidwesten van China, waar Hirsutella sinensis parasitair is op het rupslichaam5. Momenteel wordt H. sinensis gerapporteerd als de enige anamorf van rupsenschimmel volgens moleculair en morfologisch biologisch bewijs 6,7, en het heeft minder geassocieerde toxiciteit en vergelijkbare klinische werkzaamheid in vergelijking met wilde rupsenschimmel8. Er werd onthuld dat H. sinensis een verscheidenheid aan biologisch effectieve ingrediënten bezit, zoals nucleosiden, polysacchariden en ergosterolen, met uitgebreide farmacologische effecten zoals het herstellen van leverbeschadiging 9,10,11. Adenosine is een typisch actief ingrediënt geïsoleerd uit rupsenschimmel en het is een soort purine-alkaloïde12. Adenosine heeft een verscheidenheid aan biologische activiteiten: antitumor-, antibacteriële en immunomodulerende activiteiten13,14. Helaas is het biosynthetische mechanisme van adenosine en de belangrijkste betrokken genen nog steeds onduidelijk15,16.

Adenosine vertoont zijn antitumoreffect voornamelijk door immunosuppressieve acties in de micro-omgeving van de tumor17. Er werd gemeld dat adenosine immunosuppressieve functies vertoonde, wat van cruciaal belang was om weefselherstel na letsel op gang te brengen en om weefsels te beschermen tegen overmatige ontsteking18,19. Bovendien werd aangetoond dat adenosine-gemedieerde onderdrukking van de immuniteit de immunosurveillance van kanker ernstig zou kunnen aantasten en tumorgroei zou kunnen bevorderen20. Het is dus dringend nodig om het mechanisme van adenosinebiosynthese te bestuderen voor de brede toepassing ervan in antitumoren.

Er werd gemeld dat een volledig beeld van tot expressie gebrachte genen en hun expressieniveaus systematisch kon worden uitgevoerd door sequencing van transcriptoom21 van de volgende generatie. Bovendien werd transcriptoomsequencing en -analyse toegepast om de genen die betrokken zijn bij de biosynthetische route van de actieve ingrediënten te voorspellen en de interactie van verschillende biosynthetische routes verder te onderzoeken22. Purinenucleosidase (PN, EC 3.2.2.1) is een klasse van nucleosidase met substraatspecificiteit voor purinenucleosiden, die de glycosidebindingen van purinenucleosiden kunnen hydrolyseren tot suikers en basen23. Het speelt meestal een belangrijke rol bij de biosynthese van adenosine. Er werd gemeld dat de biosynthetische route van adenosine in schimmel-TCM werd voorspeld; qPCR en genexpressie toonden aan dat de verhoogde adenosineaccumulatie het gevolg is van neerwaartse regulatie van het PN-gen , wat aangeeft dat het PN-gen een belangrijke rol kan spelen bij de biosynthese van adenosine15. Daarom moet het mechanisme van PN in de biosynthese van adenosine dringend worden opgehelderd. De sequentie-informatie en eiwitstructuur van PN, evenals andere sleutelgenen die betrokken zijn bij de biosynthese van adenosine van schimmel-TCM, zijn echter niet verder bestudeerd.

In deze studie werd een nieuwe sequentie van het PN-gen geëxtraheerd uit RNA-Seq-gegevens van rupsenschimmel en geverifieerd door genklonen. Bovendien werden de moleculaire kenmerken en eiwitstructuur van PN uitgebreid geanalyseerd, wat nieuwe richtingen en ideeën zou kunnen opleveren voor de genregulatie van adenosinebiosynthese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Een stam van anamorf van rupsenschimmel (H. sinensis) werd in ons laboratorium gedeponeerd. Escherichia coli DH5 werden bewaard door het Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine.

1. Voorbereiding op RNA-Seq

  1. Oogsten van mycelia
    1. Bereid fermentatiemedium voor op de fermentatie van H. sinensis: maïsmeel in poedervorm (1%), poppen van zijderupsen (1,5%), gistextract (0,5%), trypton (1%), glucose (1,5%), zemelen (1,5%), dextrine (0,5%), KH2PO4 (0,02%) en MgSO4 (0,01%).
    2. Bereid de inoculatie voor met 10% fermentatiemedium voor opschaling van de cultuur (voeg 10 ml medium toe per 100 ml medium). Voer de ondergedompelde gisting uit bij 16 °C op een roterende schudder bij 150 tpm gedurende 10 dagen.
    3. Ongeslachtelijk voortplanten en oogsten mycelia van de anamorf van rupsenschimmel gedurende 10 dagen. Centrifugeer het gefermenteerde medium en gooi het bovenstaande na het centrifugeren weg. Suspendeer het mycelia door 3 keer 100 ml ultrapuur water toe te voegen en verwijder het bovenstaande door centrifugeren. Vermaal het gereinigde mycelia tot een poeder met behulp van vloeibare stikstof.
  2. RNA-Seq
    1. Extraheer het totale RNA van de anamorf van de rupsenschimmel volgens de protocollen van de fabrikant (Table of Materials) en behandel het monster verder met RNase-vrij DNase I (Table of Materials).
    2. Isoleer het mRNA van totale RNA PolyATtract mRNA-isolatiesystemen en isoleer poly(A) mRNA met behulp van kralen met oligo(dT) volgens de protocollen van de fabrikant (Materiaaltabel).
    3. Neem de korte fragmenten als sjablonen om het cDNA van de eerste streng te synthetiseren door middel van willekeurige hexamer-primers volgens de protocollen van de fabrikant (Materiaaltabel). Voer de synthese van tweedestrengs cDNA uit volgens de protocollen van de fabrikant.
    4. Genereer vervolgens de sequencingbibliotheken met behulp van de Ultra RNA Library Prep Kit volgens de protocollen van de fabrikant (Table of Materials).
    5. Zuiver korte fragmenten met een PCR-extractiekit volgens de protocollen van de fabrikant (materiaaltabel) en los deze op met respectievelijk EB-buffer.
    6. Verbind de korte fragmenten (drempel van 300 bp) met sequencing-adapters op basis van het resultaat van de agarosegelelektroforese.
    7. Voer vervolgens amplificatie met PCR uit met behulp van de sjablonen die zijn geselecteerd uit geschikte fragmenten.
    8. Sequentie van de bibliotheek door Illumina HiSeq 4000 met sequencing met gepaarde uiteinden volgens de protocollen van de fabrikant. Filter vuile onbewerkte lezingen uit de onbewerkte sequentiegegevens om schone gegevens te verkrijgen. Gebruik denovo-assemblage om Unigenes te krijgen met de minste Ns die aan geen van beide uiteinden kan worden uitgebreid.
    9. Lijn Unigene-sequenties door blastx uit met eiwitdatabases zoals nr, Swiss-Prot, KEGG en COG (e-waarde < 0,00001). Haal eiwitten op met de hoogste sequentiegelijkenis met de gegeven Unigenes, samen met hun functionele annotaties van eiwitten. Vat de RNA-Seq-resultaten samen (Materiaaltabel).
      OPMERKING: In de bovenstaande stappen werden commerciële kits gebruikt en alle bewerkingen werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.

2. Genmining van purinenucleosidase

  1. Download de bestanden met RNA-Seq-resultaten op de computer. Zoek de annotatieresultatenbestanden van geassembleerde Unigenes uit de RNA-Seq-resultaten.
    OPMERKING: Paired-end reads werden opnieuw gebruikt voor het opvullen van openingen van steigers om sequenties te verkrijgen met de minste Ns die aan geen van beide uiteinden kunnen worden verlengd. Dergelijke sequenties werden gedefinieerd als Unigenes. Unigene-annotatie biedt informatie over expressie en functionele annotatie van Unigene.
  2. Open het pad Annotatiebestanden en voer kaart 00230 in de zoekbalk in; Zoek vervolgens op purinemetabolisme (map00230) in de KEGG-classificatie van annotatiebestanden.
  3. Markeer EC:3.2.2.1 (PN) rood in de geannoteerde map00230 en geef aan dat er geassembleerde Unigenes zijn geannoteerd bij PN.
    OPMERKING: Er waren drie Unigenes (Unigene10777, Unigene14697 en Unigene17827) geannoteerd naar PN na het klikken op het EC-nummer 3.2.2.1 en weergegeven in de geannoteerde kaart00230.
  4. Klik op EC-nummer 3.2.2.1 en toon de geannoteerde Unigenes-informatie.
  5. Open de LTFViewer-software en importeer het Unigene.fa-bestand met een Ctrl-O-snelkoppeling en toon de sequentie-informatie van geassembleerde Unigenes.
  6. Zoek naar sequentie-informatie van Unigene10777, Unigene14697 en Unigene17827 met een Ctrl-F-snelkoppeling .
  7. Download de sequentie-informatie van Unigene10777, Unigene14697 en Unigene17827 met Ctrl-C- en Ctrl-V-sneltoetsen.
  8. Elimineer Unigene10777 en Unigene17827 met te korte sequenties van open leesframe (ORF).
    OPMERKING: De basissequentie-informatie werd weergegeven in de LTFViewer-software.
  9. Selecteer Unigene14697 (grootte 1.705 bp, kloof 0 0%) met een geschikte lengte van de ORF voor verder onderzoek.

3. Bio-informatica analyse

  1. Analyseer de ORF van het PN-gen met ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Plak de reeks in het vak. Kies de parameters als volgt, minimale ORF-lengte (nt): 75, genetische code: 1. standaard, ORF-startcodon om te gebruiken: alleen ATG. Klik op de knop Verzenden om de ORF-informatie te verkrijgen.
  2. Gebruik de ProtParam-tool (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) om de theoretische molecuulmassa en het iso-elektrische punt te berekenen.
    1. Plak de aminozuursequentie (in code van één letter) in het vak en klik op de knop Parameters berekenen om de resultaten te verkrijgen.
  3. Pas SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) toe om de signaalpeptiden te voorspellen.
    1. Voer eiwitsequenties in FATA-formaat in. Kies de parameters als volgt, organismegroep: Eukarya, uitvoerformaat: Lange uitvoer. Klik op de knop Verzenden om de resultaten te verkrijgen.
  4. Pas BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) toe om de homologie van eiwitsequenties te analyseren.
    1. Klik op de knop Protein Blast en voer de sequentie in het vak in. Kies de parameters als volgt, database: Niet-redundante eiwitsequenties (nr), algoritme: blastp (eiwit-eiwit BLAST). Klik op de knop Explosie om de resultaten te verkrijgen.
  5. Pas het Clustal X-programma (http://www.clustal.org/) toe om de zuursequenties van PN van verschillende schimmels op één lijn te brengen.
    1. Upload een bestand of plak de sequenties in het vak. Stel de parameters als volgt in, uitvoerformaat: ClustalW met het aantal tekens. Klik op de knop Verzenden om de resultaten te verkrijgen. Clustal X kan alleen bestanden in het FASTA-formaat herkennen en het pad van bestanden kan alleen Engelse namen bevatten.
  6. Gebruik MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) om de fylogenetische boom uit te voeren.
    1. Open de software en klik op de knop Bestand om de sequenties te uploaden. Selecteer het gegevenstype als Eiwitsequenties, klik op de knop OK om door te gaan naar de volgende stap. Klik vervolgens op de knop Fylogenie en selecteer Bootstrap-testfylogenie en klik vervolgens op Buurman die zich bij de boom voegt. Selecteer de standaardparameters en klik op de knop Berekenen om de resultaten te verkrijgen.
  7. Pas InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) toe om het katalytische domein van PN te identificeren.
    1. Voer de volgorde in het vak in. Selecteer de standaardparameters en klik op de knop Zoeken om de resultaten te verkrijgen.
  8. Pas Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) online toe om de secundaire structuur van het eiwit te voorspellen.
    1. Voer een aminozuursequentie (code van één letter) in het vak in en klik vervolgens op de knop predictProtein om de resultaten te verkrijgen.
  9. Pas online tools SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) toe om de driedimensionale structuur van PN24 te evalueren.
    1. Klik op de knop Modelleren starten en plak de doelreeks in het vak. Vul de projecttitel en e-mailgegevens in en klik op de knop Zoeken naar sjablonen om de resultaten te verkrijgen.

4. Klonen van genen en constructie van recombinant plasmide

  1. Ontwerp primers waarvan de omgekeerde primer een NotI-site bevatte en de voorwaartse primer een EcoRI-site had.
  2. Toon de voorwaartse primer als: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), en de omgekeerde primer als: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') van Primer Express.
  3. Bereid de primers en het cDNA van rupsenschimmel voor op het klonen van het PN-gen . Voer de PCR als volgt uit: pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 5 min, denaturatie bij 94 °C gedurende 45 s, renaturatie bij 55 °C gedurende 60 s, verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, herhaling gedurende 35 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 min.
  4. Verkrijg de PCR-fragmenten en detecteer deze door middel van agarosegelelektroforese ter verificatie. Ligate de PCR-fragmenten met pMD18-T. Voer het ligatiesysteem van PMD18-T als volgt uit: 1 μL PMD18-T, 4 μL Solution1 en 5 μL Doelgen. Stel de voorwaarden als volgt in: 16 uur op 16 °C houden, inactiveren op 65 °C gedurende 15 minuten.
  5. Breng de recombinante plasmiden over naar de competente E. coli JM109-cellen volgens de gebruiksaanwijzing25.
  6. Verteer de recombinante pMD18-T/PN-plasmiden en vector ppic9K met EcoRI en NotI. Ligate de fragmenten na vertering met T4 DNA-ligase.
  7. Construeer het recombinante plasmide ppic9K/PN voor verdere heterologe expressie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ORF-sequentie van het PN-gen was 855 bp lang, wat codeerde voor 284 aminozuren met een berekende molecuulmassa van 30,69 kDa en een voorspeld iso-elektrisch punt van 11,55, wat aangeeft dat PN een alkalisch eiwit is. De toepassing van SignalP4.0 Server werd uitgevoerd om signaalpeptiden te identificeren, en de resultaten gaven aan dat PN geen signaalpeptiden heeft. Bovendien gaven de resultaten van het BLASTP-onderzoek aan dat PN afkomstig was van rupsenschimmel die de hoogst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke gezondheid wordt geconfronteerd met een reeks grote medische problemen, zoals tumor-, cardiovasculaire en cerebrovasculaire aandoeningen26,27. TCM wordt beschouwd als de bron van onderzoek en ontwikkeling van innovatieve geneeskunde, vanwege de rijke soortenbronnen en de diverse structuur en functies van actieve ingrediënten28,29. Rupsenschimmel is een schim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31871244, 81973733, 81803652), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), de Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZBC2018016), het Speciaal Fonds voor Economische en Technologische Ontwikkeling van het Longgang-district van de stad Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806(2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206(2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206(2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806(2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168(2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156(2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106(2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566(2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2(2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116(2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99(2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA seq analyserupsenschimmeladenosinesyntheseBLAST analyseeiwitstructuurvoorspellingagarosegelelektroforesetranscriptoomkloneringnucleosidehydrolase
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen