Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het verzamelen van thoracale kanaallymfocyten en het observeren van de migratie van darm-tropenlymfocyten in de patches van rat Peyer gedurende 3 uur met behulp van time-lapse fotografie. Deze techniek kan verduidelijken hoe de dynamiek van lymfocyten wordt beïnvloed onder inflammatoire omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microscopische observatie van lymfocytendynamiek in rat Peyer's patches
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naïeve lymfocyten recirculeren van het bloed naar de lymfoïde weefsels onder fysiologische toestand en het wordt algemeen erkend als een belangrijk fenomeen in de darmimmuniteit. Het stroma van secundaire lymfoïde organen, zoals Peyer's patches (PPs) of mesenterische lymfeklieren, zijn waar naïeve lymfocyten antigenen voelen. Naïeve lymfocyten circuleren door de bloedbaan om hoge endotheel venules te bereiken, het portaal van binnenkomst in PPs. Sommige immunomodulatoren worden geschat om lymfocytenmigratie te beïnvloeden, maar de nauwkeurige evaluatie van microcirculatiedynamiek is zeer moeilijk, en het vaststellen van een methode om lymfocytenmigratie in vivo te observeren kan bijdragen aan de verduidelijking van de precieze mechanismen. We hebben de methode verfijnd om lymfocyten uit het lymfekanaal te verzamelen en de gedetailleerde dynamiek van darmtroeplymfocyten in rat-PPs te observeren. We kozen voor confocale laserscanmicroscopie om rat-PPs in vivo te observeren en namen het op met behulp van time-lapse-fotografie. We kunnen nu duidelijke beelden verkrijgen die kunnen bijdragen aan de analyse van de lymfocytendynamiek.
Inleiding
Peyer's patches (PPs) bestaan uit honderden lymfoïde follikels in de lamina propria van de dunne darm. PPs zijn onderverdeeld in follikels, het interfolliculaire gebied en kiemcentra in het onderste deel van de follikels, waar lymfocyten worden gestimuleerd door antigeenpresentatie. Er zijn geen afferente lymfevaten en de antigenen dringen de lamina propria van het darmlumen binnen via de epitheelcellaag. Het epitheelgebied dat lymfoïde follikels omvat, wordt het follikel-geassocieerde epitheel genoemd, waarbinnen gespecialiseerde afgewisselde M-cellen slijmvliesantigenen innemen. M-cellen nemen antigenen op van de luminale kant en antigenen worden vervolgens gevangen door dendritische cellen en gepresenteerd in de richting van naïeve lymfocyten die in PPs stromen via het endotheel van hoge endotheel venules (HEVs)1. PPs spelen een belangrijke rol in de darmimmuniteit en zijn gerelateerd aan het vroege stadium van ontsteking. Veel moleculaire interacties omvatten de ingang van lymfocyten tot secundaire lymfoïde organen (SLA's), waaronder hechtingsmoleculen, chemokines2,3en sfingosine-1-fosfaat4; er zijn dus veel verwachte therapeutische doelen. Daarom stelt het observeren van de lymfocytendynamiek binnen PPs ons in staat om een glimp op te vangen van het zeer vroege stadium van ontsteking en het nut van verschillende veelbelovende geneesmiddelen te onderzoeken.
De methode richt zich hier op de migratie van lymfocyten in PPs, die verschillende procedures omvat (cannulatie in het thoracale kanaal5 en het verzamelen van lymfocyten en langetermijnobservatie na de injectie in verzamelde lymfocyten). Aangezien deze procedures complex zijn en het moeilijk was om precies te zien hoe elke procedure in eerdere rapporten werd uitgevoerd, hebben we hier enkele tips genoemd om tot een succesvolle observatie te komen. Cannulatie van de buizen in het thoracale kanaal was bijvoorbeeld erg moeilijk en het aanvankelijke slagingspercentage van cannulatie was minder dan 50%. We hebben de methode echter verbeterd en een slagingspercentage van meer dan 80% bereikt. We noemden enkele andere tips in dit manuscript die nodig zijn voor de succesvolle observatie om de kwantitatieve evaluatie van de transendotheliële migratie van lymfocyten onder verschillende omstandigheden mogelijk te maken.
In eerdere rapporten was het moeilijk om de driedimensionale veranderingen in de loop van de tijd te begrijpen, zoals de intraveneuze injectie van Indiase inkt om de vasculaire structuur van PPs6te bevlekken , of de microscoop die monofocaalis 7. In de afgelopen jaren heeft een observationele methode met behulp van enkele fotoconverteerbare fluorescentie-eiwittransgene dieren zoals Kaede-muizen systematische cellulaire bewegingen in vivo8verduidelijkt . De andere studie verduidelijkte cd69 onafhankelijke uitschakeling van lymfocytenuitgang van PPs9. We gebruikten confocale laser scanning microscopie (CLSM) vanwege het hoge analytische vermogen. Nu kunnen we gemakkelijk afbeeldingen met een hoge resolutie verkrijgen en ze gebruiken om de lymfocytendynamiek te analyseren.
In dit verslag hebben we een reeks methoden gedemonstreerd voor de evaluatie van lymfocytenmigratie bij PPs. Ten eerste toonden we verfijnde methoden van thoracale kanaalconnulatie om lymfocyten te verzamelen. Ten tweede hebben we de observatiemethoden op verschillende manieren verbeterd om objectieve organen waar mogelijk onder microscopische observatie te behouden, waardoor we gedurende 3 uur beelden van hoge kwaliteit kunnen verkrijgen. Ten derde hebben we de cellulaire bewegingen van lymfocytenmigratie gekwantificeerd om de effecten van sommige medicijnen te evalueren. Deze gewijzigde protocollen zullen bijdragen aan de ontwikkeling van evaluaties van mucosale immunologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Animal Research Committee van het National Defense Medical College (nr. 16058). De dieren werden onderhouden op standaard laboratorium chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan). De proefdieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. Verzameling en scheiding van lymfocyten
OPMERKING: Aangezien lymfocyten vers moeten zijn en niet kunnen worden opgeslagen, moeten ze voor elk experiment bij ratten worden verzameld. Bovendien moeten darmtroeplymfocyten rechtstreeks worden verzameld uit het thoracale kanaal waar ze circuleren. Alle procedures worden naar verwachting binnen 6 uur voltooid en alle instrumenten, handschoenen en oppervlakken zijn schoon. Om de dieren in een fysiologisch stabiele toestand te houden, moeten alle zoutoplossing en andere vloeistoffen die in het experiment worden gebruikt, warm worden gehouden.
- Vorm een cannulatiebuis (diameter 1 mm) als een heparinecurve (een straal van ongeveer 5 mm) nadat u deze in heet water (ongeveer 80-90 °C) hebt gedompeld en bevestig deze enkele uren van tevoren met plakband aan een plastic plaat.
- Verdoof een mannelijke Wistar-rat (8-12 weken) met intraperitoneale injectie van een mengsel van Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) en Betulphar (2,5mg/kg) en knip het lichaamshaar van de buik met behulp van een haarknipper. Verwijder het haar stevig na het scheren zodat het haar niet in de buikholte komt.
- Nadat u hebt bevestigd dat de stabiele diepte van anesthesie die nodig is voor de procedure wordt verkregen door een teenknijper, maakt u een incisie met een chirurgische schaar horizontaal van de middellijn naar het linker subcostale gebied. Zorg ervoor dat u de bloedvaten in het pariëtale buikvlies niet beschadigt door de bloedvaten onder licht te bekijken.
- Wikkel de maag met nat gaas en beweeg de maag voorzichtig naar de rechterkant van het lichaam om de retroperitoneale organen te onthullen. Steek een inkeping tussen de erectorspieren van de wervelkolom en het vetweefsel met behulp van een chirurgische schaar en scheid ze botweg met vingers.
- Verwijder voorzichtig het bindweefsel rond het thoracale kanaal. Het overtollige bindweefsel neemt toe met de leeftijd. Stel het thoracale kanaal bloot van net onder de linker crus van het middenrif tot een lengte van 20 mm van het thoracale kanaal zichtbaar was. Scheid de verklevingen tussen het thoracale kanaal en de aorta voorzichtig met behulp van een precisiepincet of natte wattenstaafjes.
- Voer dit proces zorgvuldig uit omdat sommige ratten slagaders hebben die zich vertakken vanuit de buikslagader die over het thoracale kanaal of een kort thoracaal kanaal kruist vanwege een hogere positie van de lymfevlecht (kleine thoracale kanalen die zich verspreiden als spinnenwebben). Vermijd onnodig contact met het thoracale kanaal om oedeem te voorkomen.
- Breng een ligatuur aan met een snaar (3-0 zijde) op het borstkanaal net onder de linker crus van het middenrif. Het caudale thoracale kanaal wordt opgezwekt.
- Maak een gat (5 mm diameter) in de buikwand door de snijkant van de chirurgische schaar te steken, passeer de haarspeldgebogen cannulatiebuis en ligate de buis op de iliopsoas-spier op een gegeven moment. Vul de cannulatiebuis met normale zoutoplossing met 10 U/ml heparine.
- Na het plaatsen van een koord (3-0 zijde) onder het opgezwepen thoracale kanaal, steekt u het thoracale kanaal met de scherp gesneden rand van een cannulatiebuis, canuleert u het ongeveer 5 mm naar de staart en bindt u het thoracale kanaal met cannulatiebuis voor fixatie.
- Om zoutoplossing te leveren om uitdroging te voorkomen, maakt u met behulp van een precisiepincet een gat (diameter van 3 mm) op de voorwand van de maag en geeft u de siliconenbuis (met een diameter van 2 mm) door aan de twaalfvingerige darm. Na het hechten van een wond en het onderhouden van de dieren in bollmans kooien, begin je met suiker beladen zoutoplossing uit de siliciumbuis in de twaalfvingerige darm van elke rat te infuseren met een debiet van 3 ml /h. Bedek de hele kooi met een keukenpapier om het warm te houden.
- Bevestig de cannulatiebuis aan het gat in het midden van het deksel van een conische buis van 50 ml op ijs met 6 U/ml heparine, 10% foetaal runderserum en RPMI 1640 medium (pH 7,4; zie de tabel met materialen) en verzamel thoracale ductlymfocyten (TDLs) op ijs. Zorg ervoor dat u de punt van de buis niet contacteert met de wand van de conische buis om occlusie van canules te voorkomen als gevolg van de vorming van fibrinestolsels in de buis. Lymfevocht (ongeveer 20 ml) inclusief ongeveer 1,0 x 108~109 lymfocyten kan in 6 uur worden verkregen. Om de lymfocyten onder volledige anesthesie te verkrijgen, wordt het vlak van anesthesie gecontroleerd en wordt de lymfestroom op de juiste manier geobserveerd. Dezelfde verdovingsmiddelen worden toegevoegd in dezelfde dosis ongeveer 3 uur nadat ratten in ballmans kooi zijn geplaatst om gedurende 6 uur onafgebroken diepe anesthesie te verkrijgen.
2. Lymfocytenetikettering met carboxyfluoresceïnediacetaatsuccinimidylester (CFDSE)
- Los CFDSE (Materials Table of Materials) op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 15,6 mM (500 μg CFDSE opgelost in 60 μL DMSO).
- Incubeer lymfocyten (1 x 108~109) in 50 ml RPMI 1640 met 50 μL CFDSE-oplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C zoals eerder beschreven10.
3. Experimentele opstelling voor microvasculaire studies
- Verdoof de ontvangende ratten (8-12 weken) met intraperitoneale injectie van een mengsel van Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) en Betulphar (2,5mg/kg) en bevestig de diepte van de anesthesie door teenknijpen. Maak de buik nat voordat u de vacht verzorgt om haarbesmetting te minimaliseren. Open vervolgens de buik van de ontvangende Wister-rat via een middenlijnincisie.
- Leg een rat op een draagbare roestvrijstalen plaat (ongeveer 120 x 300 mm) met een rechthoekgat rond het midden bedekt met een glazen glijbaan (24 x 50 mm). Kies ongeveer 10 cm van het ileale segment inclusief PPs ter observatie.
- Houd de darm zo warm mogelijk en vochtig met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) opgewarmd tot 37 °C. Week gaas dat wordt gebruikt om de dunne darm te bedekken met PBS.
- Terwijl u continue anesthesie geeft met 2 % isofluraan (zie tabel met materialen), plaatst u de dia op het podium van de microscoop en kiest u geschikte gebieden voor observatie van de microcirculatie in PPs waar sommige HEVs door de serosa lopen. PPs variëren in grootte; grotere zijn geschikt voor observatie van de microcirculatie met behulp van CLSM. De dunne darm is op sommige plaatsen niet recht; een recht segment van minstens 2 cm lang zonder enige spanning is geschikt voor observatie.
- Bedek het aangrenzende darmsegment en mesentery met absorberend katoen gedrenkt in PBS. Plaats het darmsegment tussen twee opgerolde katoenen ballen en plaats het zo ver mogelijk van het lichaam van de rat om te voorkomen dat het wordt getrild door de hartslag en ademhaling van de rat.
- Injecteer met een spuit met 1 ml langzaam (meer dan 1 min) CFSE-gelabelde TDLs (1 x 108 cellen) in de halsader van de ontvangende ratten. Een snelle intraveneuze injectie kan de systemische circulatie beïnvloeden.
4. Microcirculatie van lymfocyten
- Controleer continu TDLs in de microvasculatuur van PPs met behulp van CLSM en neem gedurende 3 uur op op een computer met behulp van time-lapse fotografie met intervallen van 30 s. De diepte van de serosa tot de HEV van PPs is ongeveer 25 μm, waardoor de stroma- en capillaire lymfevaten kunnen worden geobserveerd tot een diepte van 30 μm.
- Injecteer Texas Red-dextran (25 mg/kg) in de halsader van elke ontvangende rat om de bloedbaan te bevlekken en Hoechest 33342 (5 mg/kg) om de celkernen te bevlekken.
- (Optioneel) Om de lymfocytendynamiek te kwantificeren, definieert u lymfocyten die zich meer dan 30 seconden aan HEV's hechten als "zelfklevende lymfocyten" en lymfocyten die van HEV's naar stroma emigreren als "migrerende lymfocyten". Bereken vervolgens het gemiddelde migratiepercentage (migrerende lymfocyten / zelfklevende lymfocyten + migrerende lymfocyten) per gezichtsveld (ongeveer 0,3 mm2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lymfocyten verzamelen uit lymfe
Om de rat voor te bereiden op thoracale kanaalkannulatie, maakt u een incisie in het gespannen thoracale kanaal zoals weergegeven in figuur 1 en onderhoudt u de rat vervolgens in een bollmanskooi zoals weergegeven in figuur 2.
Wanneer de lymfocyten goed zijn verzameld, kunnen we ongeveer 20 ml/6 uur lymfevocht verkrijgen dat ongeveer 107~ 108/ ml lymfocyten beva...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven we een protocol voor het verzamelen van naïeve darm-tropen lymfocyten en het observeren van hun migratie in rat PPs. Deze procedures kunnen onthullen hoe lymfocyten bewegen in de microvasculatuur van PPs en maken het mogelijk om hun dynamiek visueel te vergelijken onder een normale of medicinale aandoening. De directe observatie van deze dynamiek heeft veel verdienste om een aanwijzing te krijgen voor immunologische modificatie door sommige geneesmiddelen, hoewel de observatieperiode beperkt is tot slecht...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van het National Defense Medical College en een onderzoeksbeurs voor gezondheid en arbeidswetenschappen voor onderzoek naar hardnekkige ziekten van het Ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn, Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | Comfocal Laser Scanning Microscopy | |
| Carboxyfluorescein diacetaat succinimide ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isofluraan | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Referenties
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
