Een benadering om vormafhankelijke transcriptie te bestuderen op een enkelcellig niveau

Summary

Dit document presenteert methoden voor het kweken van cardiale myocyten met verschillende vormen, die verschillende pathologieën vertegenwoordigen, en het sorteren van deze aanhangende cardiale myocyten op basis van hun morfologie op een celniveau. Het voorgestelde platform biedt een nieuwe benadering van hoge doorvoer en drug screening voor verschillende soorten hartfalen.

Abstract

Verschillende soorten cardiale hypertrofie zijn geassocieerd met een verhoogd volume van cardiale myocyten (CMs), samen met veranderingen in CM morfologie. Hoewel de effecten van celvolume op genexpressie bekend zijn, zijn de effecten van celvorm niet goed begrepen. Dit artikel beschrijft een methode die is ontworpen om systematisch de effecten van CM morfologie op genexpressie te analyseren. Het beschrijft de ontwikkeling van een nieuwe eencellige overvulstrategie die vervolgens wordt gevolgd door eencellige mRNA-sequencing. Er is ook een micropatterned chip ontworpen, die 3000 rechthoekige fibronectine micropatronen bevat. Dit maakt het mogelijk om CMs te laten groeien in verschillende lengte:width aspect ratio's (AR), die overeenkomen met verschillende soorten hartfalen (HF). Het papier beschrijft ook een protocol dat is ontworpen om enkele cellen op te halen uit hun patroon, met behulp van een semi-geautomatiseerde micro-pipetting celkiezer, en individueel injecteren ze in een aparte lyse buffer. Dit heeft het mogelijk gemaakt om de transcripto's van afzonderlijke CMs te profileren met gedefinieerde geometrische morfotypen en deze te karakteriseren volgens een reeks normale of pathologische omstandigheden: hypertrofische cardiomyopathie (HCM) of afterload/concentric versus verwijde cardiomyopathie (DCM) of preload/excentriek. Samengevat presenteert dit artikel methoden voor het kweken van OEM's met verschillende vormen, die verschillende pathologieën vertegenwoordigen, en het sorteren van deze aanhangende CMs op basis van hun morfologie op een eencellig niveau. Het voorgestelde platform biedt een nieuwe benadering van hoge doorvoer en drug screening voor verschillende soorten HF.

Introduction

Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie is hart- en vaatziekten (CVD) wereldwijd een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. CVD heeft een grote invloed op de kwaliteit van het leven van mensen en heeft een enorme sociaal-economische impact. Cardiomyopathieën, zoals HCM en DCM, zijn primaire aandoeningen van de hartspier en de belangrijkste oorzaken van HF zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit. Er zijn vele oorzaken van HF, met inbegrip van milieu-effecten, zoals infecties en blootstelling aan toxines of bepaalde geneesmiddelen⁸. HF kan ook worden veroorzaakt door genetische aanleg, namelijk mutaties⁹. Er wordt aangenomen dat de veranderingen in de genetische samenstelling die van invloed zijn op extracellulaire matrix (ECM) moleculen, integrins of cytoskeletale eiwitten kunnen verantwoordelijk zijn voor verminderde mechanosensatie en verschillende soorten hartziekte¹⁰.

Het belangrijkste kenmerk van HCM is onverklaarbare hypertrofie van de linker ventrikel¹¹, en soms van de rechter ventrikel¹², en dit presenteert vaak met overheersende betrokkenheid van het interventriculaire septum. HCM wordt ook gekenmerkt door diastolische disfunctie en myocyte wanorde en fibrose^13. In de meeste gevallen wordt het contractiele apparaat van het hart beïnvloed door mutaties in sarcomerische eiwitten, wat leidt tot een verhoogde contractiliteit van de myocyten¹⁴. DCM daarentegen wordt gekenmerkt door dilatatie van één of beide ventrikels en heeft een familiale etiologie in 30% tot 50% van de gevallen¹⁵. DCM beïnvloedt een breed scala van cellulaire functies, wat leidt tot verminderde samentrekking van de myocyten, celdood en fibrotische reparatie¹⁶.

Genetica heeft aangetoond dat bepaalde soorten mutaties afzonderlijke CMs dwingen om specifieke vormkenmerken aan te nemen tijdens HCM³, namelijk vierkante cellen met een lengte:breedte AR die bijna gelijk is aan 1:1⁴ (AR1). Hetzelfde geldt voor DCM, met langwerpige cellen met een AR die bijna gelijk is aan 11:1 (AR11). Bovendien kan HF worden veroorzaakt door verhoogde afterload (bijvoorbeeld bij hypertensie). In deze gevallen, hemodynamic eisen dwingen CMs aan te nemen vierkante vormen, volgens de wet van de Laplace, en de AR verandert van 7:1⁵ (AR7) tot 1:1^6,7. HF kan ook worden veroorzaakt door een toename van de voorbelasting (bijvoorbeeld in omstandigheden die leiden tot overbelasting van het volume). Wanneer dit gebeurt, dwingen de biofysische beperkingen CMs om te verlengen en verandert de AR van 7:1 naar 11:1.

Signalering activiteit bij membranen is afhankelijk van globale cel geometrie parameters, zoals de cellulaire AR, grootte, het membraan oppervlak en het membraan kromming¹⁸. Wanneer neonatale ratten-CMs werden verguld op substraten die patroon waren om de cellen te beperken in een specifieke lengte:breedte AR, toonden ze de beste contractiele functie aan wanneer de verhoudingen vergelijkbaar waren met de cellen in een gezond volwassen hart. In tegenstelling, presteerden zij slecht toen de verhoudingen aan die van myocyten in het ontbreken harten¹⁹waren. In de vroege stadia van hypertrofie worden cellen breder, zoals blijkt uit een toename van het transversale gebied. HF komt voor in de latere stadia van hypertrofie en cellen lijken meestal langwerpig. Daarom is het niet verwonderlijk dat in vivo ratmodellen van chronische hypertrofie een toename van de linker ventriculaire myocytelengte van ongeveer 30%²⁰hebben gemeld, maar volwassen CMs van transgene muismodel dat acuut werden behandeld met hypertrofische stimuli in vitro vertoonden een vergelijkbare toename van de celbreedte in plaats^{van 21}.

Single-cell RNA sequencing, die een nauwkeurige analyse van de transcriptie van enkele cellen mogelijk maakt, is momenteel een revolutie in het begrip van de celbiologie. Deze technologie was de voorkeursmethode als het ging om het beantwoorden van de vraag hoe individuele celvormen de genexpressie beïnvloedden. We vergeleken enkele cellen met verschillende vormen, met name met ARs van 1:1, 7:1 of 11:1. Dit werd gedaan door het zaaien van de neonatale rat ventriculaire CMs op een speciaal ontworpen chip gevuld met de fibronectin-gecoate micropatronen² met gedefinieerde ARs van 1:1, 7:1 of 11:1. De micropatronen werden vervaardigd met behulp van fotolithografie technologie. De micropatronen werden gecoat door fibronectine, omgeven door cytofobisch oppervlak. Daarom zullen CMs hechten, verspreiden en vangen de gedefinieerde AR van micropatronen door uitsluitend te groeien op de fibronectine substraat, terwijl het vermijden van de cytofobische gebied. De micropatronen zijn niet in een goed vormig formaat. In plaats daarvan is het fibronectinniveau precies op dezelfde hoogte van het omringende cytofobische gebied. Dit bood vergelijkbare omstandigheden aan groeiende cellen in een petrischaaltje, omdat er geen stress is van de omliggende muren. Bovendien is het oppervlak van micropatronen met verschillende ARs gelijk.

Er waren twee bijzonder belangrijke aspecten van het experimentele ontwerp, wat leidde tot het gebruik van eencellige RNA-sequencing in plaats van bulkRNA-sequencing. Ten eerste kunnen slechts een paar percentages van de micropatronen door één cel worden ingenomen. Ten tweede, soms een enkele cel niet volledig bezetten het micropatroon oppervlak. Eén cel die een micropatroon volledig bedekt, moeten worden gekozen voor eencellige RNA-analyse. Omdat slechts een subgroep van de vergulde cellen op een chip aan beide criteria voldeed, was het niet haalbaar om de hele chip eenvoudig te trypsiniseren en alle cellen te verzamelen voor bulkRNA-sequencing. Gekwalificeerde cellen moesten individueel worden geplukt met behulp van een semi-geautomatiseerde celkiezer.

Het is op dit moment nog onbekend of cm-vorm op zichzelf een intrafunctionele impact heeft op het myocardsyncytium. Het belangrijkste doel van de methoden die in dit document werden voorgesteld, was om een nieuw platform te ontwikkelen om te onderzoeken of de celvorm op zich een impact had op het transcriptoom¹⁷. Hoewel in vitro studies verschillen van in vivo studies, was het doel van deze studie om het effect van verschillende celvormen op genexpressie te onderzoeken, rekening houdend met het feit dat het vergelijken van cellen met verschillende vormen in vivo zeer veeleisend is. Deze experimenten werden geïnspireerd door Kuo et al.¹⁹, die een soortgelijke aanpak gebruikt en gemeld dat ze veranderingen in fysiologische parameters als gevolg van veranderingen in de celvorm waargenomen.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren waren in overeenstemming met de voorschriften van de comité voor dierethiek van het Karolinska Institutet, Stockholm, Zweden.

1. Chip-indeling met micropatroon

1. Gebruik een op maat ontworpen chip (Tabel van materialen) ( Figuur1A): een 19,5 mm x 19,5 mm coverslip met geactiveerde micropatronen, gedrukt door fotolithografie op borosilicaat glas.
   OPMERKING: Deze micropatronen zijn omgeven door een cytofobisch gebied. Daarom kan een gezaaide cel alleen hechten en groeien op een van deze micropatronen en de AR van dat micropatroon vastleggen. De chip is verdeeld in drie zones en elke zone bestaat uit micropatronen met een specifieke AR. De chiplay-out wordt weergegeven in figuur 1B. De geometrie van de gedefinieerde ARs wordt gepresenteerd in tabel 1. Vergroot fluorescerende beelden van de verschillende vormen van de fibronectin micropatronen worden weergegeven in de lagere afbeeldingen in figuur 1B.

2. Coating micropatterned chips

1. Bereid 2x coating eiwitoplossing voor elke chip door 80 μg fibronectine toe te voegen aan 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS^-/-).
2. Breng een chip over naar een 35 mm Greiner Petri schotel en voeg onmiddellijk 2 mL PBS^{toe -/-}. Voeg vervolgens 2 mL van de 2x coating eiwitoplossing toe.
3. Broed de chips op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
4. Was de coatingoplossing door opeenvolgende verdunningsstappen met PBS^-/-. Het spaanoppervlak moet altijd nat zijn. Vervang vervolgens de PBS door 2 mL beplatingsmedium en incubeer bij 37 °C tot de zaadcellen.

3. Isolatie van CM's

1. Bereid het beplatingsmedium voor door DMEM:M199 (4:1) aan te vullen met 10% paardenserum, 4% foetale runderserum, 2% HEPES (1 M) en 1% penicilline/streptomycine (10.000 U/mL)²².
2. Ontleed het weefsel uit de linkerventrikel van 2 dagen oude neonatale rattenharten en breng over op een schaal van 10 cm met PBS. Snijd het weefsel in ongeveer 1 mm³ stukken.
3. Breng het geoogste weefsel over in een rotordopbuis, uitgerust met een rotor in de dop voor weefseldissociatie(Tabel van materialen). Laat het weefsel settelen en verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant.
4. Voeg 2,5 mL van het mengsel van enzymmix 1 en 2 toe, bereid met behulp van de Neonatale Heart Dissociation Kit(Tabel van materialen),aan de C-buis en sluit de dop stevig af.
5. Plaats de rotordopbuis op de mouw van de dissociator, uitgerust met kachels (figuur 2A en B) ( Tabel vanmaterialen). Voer het incubatieprogramma uit 37C_mr_NHDK_1(figuur 2C),dat ongeveer een uur duurt.
6. Terwijl het incubatieprogramma loopt, bereidt u PEB-buffer voor met 2 mM EDTA en 0,5% bovine serum albumine (BSA) in PBS, pH 7.2, en houd deze op 4 °C.
7. Na beëindiging van het incubatieprogramma trekt u de rotordopbuis(figuur 2D)los en voegt u 7,5 mL voorverwarmd beplatingsmedium toe.
8. Het monster opnieuw opschorten en de celsuspensie filteren met een zeef van 70 μm.
9. Was de zeef met nog eens 3 mL beplatingsmedium.
10. Centrifuge de celsuspensie op 600 x g gedurende 5 minuten. Aspirate de supernatant volledig.
11. Resuspend de celpellet in 60 μL koude PEB buffer.
12. Voeg 20 μL neonatale cardiomyocyte isolatiecocktail(tabel van materialen)toe, met kralen van micronformaat die zich richten op niet-CMs.
13. Voeg 20 μL anti-rode bloedcelkralen(tabel van materialen) toe.
14. Meng de vering en incubeer op 4 °C gedurende 15 minuten.
15. Voeg 400 μL PEB-buffer toe.
16. Breng de celsuspensie aan op de LD-kolom(Tabel van materialen),die verticaal in een magneetstandaard is geplaatst en goed is gewassen met peb-buffer.
17. Verzamel niet-gelabelde cellen en was kolom met 0,5 mL PEB buffer.
18. Voeg 8 mL beplatingsmedium toe en breng de celsuspensie over in een 75 cm² ongecoate kweekkolf en incubbate bij 37 °C gedurende 1,5 uur. De resterende niet-CMs zullen zich beginnen te houden aan de ongecoate celcultuur en de celsuspensie zal worden verrijkt door de CM-populatie.

4. Patronen van CM's

OPMERKING: We vergeleken afzonderlijke CD's met ARs van 1:1, 7:1 of 11:1. Dit wordt gedaan door de geïsoleerde neonatale rat-CMs op een speciaal ontworpen chip gevuld met met fibronectine gecoate micropatronen met gedefinieerde ARs van 1:1, 7:1 of 11:1 te zaaien. De micropatronen werden gecoat door fibronectine, omgeven door cytofobisch oppervlak. Daarom zullen CMs hechten, verspreiden en vangen de gedefinieerde AR van micropatronen door uitsluitend te groeien op de fibronectine substraat. Patroon van de geïsoleerde CMs volgens de volgende stappen.

1. Breng de celsuspensie over naar een buis van 15 mL, tel de cellen en verdun tot een concentratie van 100.000 cellen per mL door het toevoegen van de juiste beplating medium.
2. Voeg 2 mL celsuspensie toe aan de chip, die al is ondergedompeld in 2 mL warm beplatingsmedium in een 35 mm Greiner Petri schotel.
3. Broed de schotel bij 37 °C met 5% CO₂ om de CMs aan de met fibronectin gecoate micropatronen te laten hechten en elke CM in staat te stellen de AR van zijn substraatmicropatronen te verwerven.
4. Na 18 uur, controleer de chip. Als de meeste cellen zijn bevestigd, los en verwijder het puin en dode cellen die zijn bevestigd aan de patroon cel. Doe dit door het beplatingsmedium te verwijderen en pbs voorzichtig toe te voegen^-/- dropwise, vanaf het midden van de chip en vervolgens naar de zijkanten te bewegen. Herhaal dit 2 keer.
5. Aspirate de PBS met vers onderhoudsmedium door DMEM:M199 (4:1) aan te vullen met 4% paardenserum, 4% foetale runderserum, 2% HEPES (1 M) en 1% penicilline/streptomycine (10.000 U/mL).

5. Het plukken van aanhangende CMs

OPMERKING: Na een kweekperiode van 72 uur worden afzonderlijke CMs met een patroon uit hun fibronectin-micropatronen geplukt met behulp van een semi-geautomatiseerde celkiezer (Tabel van materialen) ( figuur3). De celkiezer gebruikt een software²³ om de gemotoriseerde fase te regelen(figuur 3A). Een 70 μm glazen microcapillary (Figuur 3B) wordt gebruikt om de patroon neonatale rat CMs te plukken en te injecteren. De celkiezer sorteert aanhangende cellen door een vacuüm te genereren en de cellen te injecteren door druk uit te oefenen. Het vacuüm in spuit nummer 1 wordt aangebracht door de spuit te trekken met behulp van de spuitpomp(figuur 3C). De hydrostatische druk is gebaseerd op de zwaartekracht en veroorzaakt door het plaatsen van spuit nummer 2 op een afstand van 87 cm over de microscoop bureau. Spuiten 1 en 2 zijn respectievelijk via PTFE-buizen verbonden met kleppen 1 en 2, die zijn ingebed in de besturingseenheid (figuur 3D). De PTFE buizen zijn volledig gevuld met RNase-vrij water. De geplukte eencellige wordt vervolgens geïnjecteerd in de polymerasekettingreactie (PCR) buis, met 3,55 μL lysebuffer.

1. Verwijder na een kweekperiode van 72 uur het oude medium en spoel het spaanoppervlak voorzichtig door met warme DPBS^-/-.
   1. Houd de schotel plat en knijp het oude medium voorzichtig aan met een pipet van 1000 μL van de ene kant van de schotel. Zorg ervoor dat de chip te allen tijde nat blijft.
   2. Voeg 2 mL DPBS^-/- voorzichtig en drop-wise los de meeste van de dode cellen die zijn bevestigd aan de patrooncellen, vanaf het midden van de chip en vervolgens verplaatsen naar de zijkanten.
   3. Aspirate het grootste deel van de DPBS om zo veel losstaande drijvende cellen mogelijk te verwijderen, vanaf het midden van de chip en vervolgens naar de zijkanten.
   4. Herhaal de stappen 5.1.2 en 5.1.3 nogmaals.
2. Gebruik schuine tangen om de rand van de chip te grijpen en breng deze onmiddellijk over naar een nieuwe steriele Greiner Petri schotel van 35 mm om het aantal drijvende cellen tijdens het plukken te verminderen.
3. Voeg onmiddellijk 1,5 mL DPBS^{toe -/-} zodat de chip niet uitdroogt.
4. Voeg 1,5 μL Vibrant Dye Cycle green toe om de kernen van de levende cellen te visualiseren.
5. Plaats de chip in het midden van de Greiner Petri schotel met behulp van de punt van de tang.
6. Leg een kamer(Tabel van materialen) over de chip. De kamer zal de chip vast te stellen aan de onderkant van de schotel, zonder het blokkeren van de toegang tot de cel patronen.
7. Monteer de Greiner Petri schotel op de schotelhouder van de celkiezer stadium en steek de magnetische dop.
8. Kalibreer de automatische injectie.
   1. Zoek het vizier, dat is gegraveerd op het gemotoriseerde podium in het midden van de afbeelding in het venster Live View.
   2. Focus op het kruishaar en selecteer de kalibratie voor geautomatiseerde injectieknop in het venster Scannen en sorteren.
9. Vervang de DPBS^-/- door 1,5 mL DPBS/trypsin^-/- (1:1) terwijl de schotel zich op het podium bevindt, om de cellen los te maken van de fibronectine, zodat een vloeibaar vacuüm kan worden gebruikt om de cellen te plukken.
10. Scan de hele chip met het tabblad Scannen in het venster Scannen en sorteren. Zoek de linkerbovenhoek van de chip in het gezichtsveld en klik op De huidige microscooppositie in de linkerbovenhoek rij ophalen.
    1. Verplaats vervolgens het gemotoriseerde podium naar de rechterbenedenhoek van de chip. Focus de microscoop en klik op Ontvang huidige microscoop positie in de rechterbenedenhoek rij.
11. Klik op de scherpste vlakknop instellen en klik in het opgedoken venster op de rechtsbovenhoek Gaan. Focus de microscoop en klik op Ga naar de linkerbenedenhoek en stel de focus. Klik als u klaar bent op de knop Voltooien en begin met scannen.
12. Wanneer het scannen is beëindigd, gaat u naar het tabblad Analyseren en selecteert u de afzonderlijke cellen die aan de studiecriteria voldoen.
13. Zorg ervoor dat de glazen microcapillaire zich in het midden van de live view van de microscoop bevindt.
14. Bedien de spuitpomp met behulp van het pompvenster van de software. Creëer een vacuüm door 4 mL uit een 50 mL nummer 1 spuit te halen, die een diameter heeft van 27 mm.
15. Op het tabblad Sorteren
    1. Stel de injectieparameters van de kleppen in. Er werd berekend dat het injectievolume dat een gekozen eencellige cel leverde 1 μl was, als klep 2 gedurende 120 milliseconden werd geopend en vervolgens klep 1 geopend voor 20 milliseconden was na een timelape van 200 milliseconden. Vanwege de elasticiteit van de buizen, open klep 1 om te stoppen met het injecteren van de stroom.
    2. Stel de ophaalparameters van de kleppen in. Er werd berekend dat als klep 1 werd geopend voor 20 milliseconden en vervolgens klep 2 werd geopend voor 10 milliseconden, na een time lapse van 10 milliseconden, de meeste van de patrooncellen kunnen worden opgepikt. Dit komt omdat hun fibronectin bindingen werden losgemaakt na te zijn behandeld door trypsine.
    3. Klik op de knop De pad berekenen. De software berekent het snelste pad van cel naar cel, om de geselecteerde cellen in de chip op te halen en te injecteren.
    4. Richt de microscoop op een patroon cel op de chip oppervlak.
    5. Met behulp van de joystick beweegt u de microcapillaire voorzichtig naar beneden, zodat het scherpste beeld van de punt van de microcapillaire kan worden verkregen zonder de cel aan te raken.
    6. Klik op de knop Instellen in de sectie Micropipette offset. Er verschijnt een nieuw venster met de microcapillaire dwarsdoorsnede. Klik op het exacte midden van de capillaire. De software registreert dan de tipverschuiving van de capillaire in de x-, y- en z-coördinaten.
    7. Start sorteren met de knop Sorteren starten.

Results

Weefsel werd ontleed uit de linker ventrikel van de 2-dagen oude neonatale rattenharten en verdeeld in enkele cellen. Vervolgens werden de verrijkte CMs gezaaid op een chip met fibronectine patronen met verschillende ARs. Na 72 uur kweken werd het medium vervangen door 1:1000 Vibrant Dye Cycle green in DPBS^-/- gedurende 2 minuten om de kernen van de levende cellen te visualiseren. Vervolgens werden de cellen behandeld met DPBS^-/-/trypsine (1:1) om de cellen los te maken van de fibronectine, zodat een vloeibaar vacuüm kan worden gebruikt om celplukken te vergemakkelijken. Ondertussen werd de hele chip gescand op een vergroting van 10x, met behulp van een omgekeerde microscoop aangesloten op de celkiezer. Dit werd uitgevoerd voordat de cellen werden afgerond als gevolg van trypsine behandeling. De gekwalificeerde cellen werden geselecteerd op basis van de gescande afbeelding en hun coördinaten werden opgeslagen in de celkiezersoftware. De micropatronen werden alleen geselecteerd als ze een mononucleated eencellige eencellige cel bevatten en alleen wanneer de cel zijn fibronectine micropatroon volledig bedekte. De celsorteerder koos de geselecteerde cellen één voor één en elke enkele cel die met succes werd geplukt, werd onmiddellijk in een afzonderlijke PCR-buis geïnjecteerd en op het microscoopstadium geplaatst. Elke PCR-buis bevatte 3,55 μL lysebuffer(tabel 2). Het sorteerproces, dat begon met het verwijderen van de media, werd binnen 40 minuten voltooid. De complementaire deoxyribonucleïnezuur (cDNA) synthese, PCR pre-versterking en zuivering werden uitgevoerd op de lysed single cells, gebaseerd op het Smart-Seq2 protocol²⁴ (Tabel 3). De kwaliteit van de gezuiverde cDNA werd gecontroleerd door een geautomatiseerde elektroforese analyzer. Het elektroferogram van de voorversterkte cDNA van één gekozen eencellige wordt gepresenteerd in figuur 4. De RNA-Seq bibliotheken werden voorbereid volgens het Smart-Seq2 protocol²⁴.

Om de sarcomerestructuur van de patroon-CMs in acht te nemen, werden de patroon-CMs besmeurd met sarcomerische α-actinineantilichaam. De cellen werden geïncubeerd met Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur voor de secundaire kleuring. Kernen werden gekleurd met 1 μg/mL DAPI. Immunofluorescente beelden werden verworven met een omgekeerde confocale microscoop, met behulp van een 63x olie-onderdompeling (NA 1.4) doelstelling (Figuur 5).

Figuur 1: Lay-out van de chip met fibronectin micropatronen.
(A) Afbeelding van de op maat ontworpen chip. De chip is een 19,5 mm x 19,5 mm coverslip met fibronectin micropatterns, gedrukt door fotolithografie op een borosilicaat glas. (B) Chip lay-out. De chip is verdeeld over drie zones en elke zone bestaat uit fibronectine micropatronen met specifieke AR. Fluorescerende beelden van verschillende vormen van fibronectin micropatterns worden weergegeven in vergrote weergave voor elke zone. Dit cijfer is gewijzigd op grond van "aanvullend materiaal 1" door Haftbaradaran Esfahani et al.², gebruikt onder http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Dissociator uitgerust met kachelapparatuur.
A) Het gehele dissociatorinstrument dat wordt gebruikt voor de volledig geautomatiseerde dissociatie van twee dagen oude neonatale rattenverklikkerventrikels. (B) Verwarmingseenheid. (C) Rotor-cap buis. (D)Kant-en-klare programma's voor een volledig geautomatiseerde workflow van weefseldissociatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Celkiezerapparaat.
(A) Vergrote weergave van de gemotoriseerde fase van de celkiezer. Een petrischaalhouder en 80 gaten voor 10 PCR strips en een gat voor kalibratie crosshair is ingebed op het podium. (B) Vergrote weergave van een glazen microcapillaire. (C) De spuitpomp. (D) De bedieningseenheid, die het openings- en sluitingstijdvenster van kleppen 1 en 2 regelt, is in de bedieningseenheid gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Het elektroferogram van de voorversterkte cDNA van één gekozen enkele cel.
19 PCR-cycli van pre-versterking werden gebruikt om 15 μL van 1 ng/μL gezuiverde cDNA-opbrengst te verkrijgen. Een duidelijke band in gel-achtige densitometrie plot wordt waargenomen die overeenkomt met de piek op 1852 bp in het elektropherogram. De gemiddelde grootte van fragmenten is 1588 bp. Bovendien duidt de kleine hoeveelheid fragmenten die korter zijn dan 300 bp op een goede cDNA-bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Immunofluorescente kleuring van α-actinine sarcomerische structuur (groen) en kern (blauw) van cms met patronen met verschillende ARs.
De chromatine werd gekleurd door DAPI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Morphotype	Ar	Lengte (μm)	Breedte (μm)	Fibronectin gebied (μm2)
AR1 (AR1)	1:1	47	47	2209
AR7 (AR7)	7:1	126	18	2268
AR11 (AR11)	11:1	155	14	2170

Tabel 1: Geometrie van cms met patroon.

Component	Volume (μL)
Nucleasvrij water	0.65
(0,4% vol/vol) Triton X-100	1.8
dNTP-mix (25 mM)	0.8
RNase-remmer (40 U μL-1)	0.1
Oligo-dT30VN oligonucleotiden (100 μM)	0.1
ERCC RNA Spike-In Mix (2,5 x 105 verdunning)	0.1
Geïnjecteerde eencellige cel	1
Totaal volume	4.55

Tabel 2: Aangepaste lysisbuffer met één cel.

Component	Volume (μL)
Superscript II first-strand buffer (5x)	2
DTT (100 mM)	0.5
Betaïne (5 M)	2
Mgcl2 (1 M)	0.1
RNase-remmer (40 U μL-1)	0.25
Superscript II reverse transcriptase (200 U μL-1)	0.5
TSO (100 μM)	0.1
Totaal volume	5.45

Tabel 3: Reverse transcriptie (RT) mix voor een RT reactie te synthetiseren eerste streng cDNA uit het lysaat van een enkele CM.

Discussion

Deze studie gebruikte single-cell RNA sequencing, dat is een nieuwe en krachtige technologie die de transcriptie van enkele cellen kan detecteren. Het werd gecombineerd met een innovatieve benadering van het kweken van afzonderlijke CMs, zodat ze verschillende ARs aangenomen die anders alleen in vivo konden worden waargenomen.

De studie had een aantal beperkingen. Neonatale CMs moesten bijvoorbeeld worden gebruikt om verschillende morfotypes te genereren, omdat het uitzonderlijk uitdagend is om voldoende vitale volwassen CMs te cultuuren gedurende 72 uur in gedefinieerde vormen. Bovendien werden CMs 72 uur lang gekweekt ex vivo, wat een impact zou kunnen hebben gehad op het genexpressiepatroon. Deze kweek was echter noodzakelijk, zodat de cellen specifieke morfotypes konden vormen. Bovendien werden alleen enkele cellen geselecteerd die mononucleated waren en volledig bedekt waren met het fibronectin micropatroon voor sortering. Patrooncellen op elke chip moeten slechts in één ronde van sortering worden gesorteerd. Ten slotte werden ongeveer 50 cellen die ongeveer een derde van de geselecteerde cellen zijn met succes opgehaald van elke chip. Er zijn twee redenen die het aantal met succes geplukte cellen beperkten. Ten eerste waren sommige cellen te strak gehecht aan het fibronectin-patroon en was de pick-upstroom niet te dwingen genoeg om ze met succes op te rapen. Ten tweede, als gevolg van de trypsine behandeling, de gehechtheid tussen sommige cellen en fibronectin werd te los. Bijgevolg werden deze cellen weggeduwd van hun fibronectine micropatronen, toen de microcapillaire hen benaderde en niet werden opgepikt. De auteurs beweren niet dat deze opzet is hetzelfde als een in vivo omgeving, maar het bleek een haalbare benadering van het beantwoorden van de onderzoeksvraag.

De voorgestelde methode is van toepassing op verschillende celtypen (bijvoorbeeld voor hiPS-CMs). De volgende factoren moeten echter worden geoptimaliseerd om andere celtypen te bestuderen. Geschikte ECM-lijmmoleculen voor bevestiging van het specifieke celtype moeten worden gebruikt voor het coaten van de micropatronen. De geometrie van de micropatronen moet worden aangepast aan de studievraag en het celtype. De kweekperiode kan worden aangepast op basis van de studievraag. Het ontkoppelingsreagens en de incubatietijd moeten nauwkeurig worden geoptimaliseerd voor het type studiecel. Accutase kan bijvoorbeeld worden gebruikt in plaats van TryplE voor het losmaken van embryonale en neuronale stamcellen. De openingstijd parameters van de kleppen moeten worden onderzocht om cellen te plukken met succes, maar voorzichtig. Samengevat hebben we een nieuw platform ontworpen om celvorm te bestuderen die een waardevolle bron kan zijn voor onderzoekers in het veld. In deze context ontwierpen we een experimentele benadering die in vitro karakteristieke vormen nabootste die cm in vivo werden opgelegd door hemodynamische beperkingen om het samenspel tussen cellulaire architectuur en genexpressie te identificeren. We rapporteren ook de ontwikkeling van een nieuw platform om HF in vitro te bestuderen en de identificatie van celvorm als een krachtige determinant van genexpressie. Dit is een nieuwe observatie met verstrekkende implicaties voor biologie en geneeskunde.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Automated electrophoresis analyzer
Anti-Red Blood Cell MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-109-681
Axio Observer microscope	Zeiss	Z1	Inverted microscope
Betaine solution (5 M)	Sigma-Aldrich, MERCK	B0300
CellSorter	CELLSORTER	https://www.singlecellpicker.com/	Cell picker
CYTOOchamber	CYTOO	30-010	Custom-designed chip
CYTOOchip	CYTOO	10-950-00-18	Chamber
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31966-021	high glucose, GlutaMAX Supplement
dNTP mix (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R1122
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Abcam PLC	ab150105
DTT (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	18064071
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Fibronectin	Sigma-Aldrich, MERCK	F4759
gentleMACS C Tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Rotor-cap tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427	Dissociator with heater
Greiner CELLSTAR Petri dish	Sigma-Aldrich, MERCK	P6987
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-056
Horse Serum	Sigma-Aldrich, MERCK	H0146
LD column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	31150-022
NE-1000 syringe pump	New Era Pump Systems	NE-1000	Syringe pump
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat	Miltenyi Biotec	130-105-420
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-098-373
Oligo-dT30VN oligonucleotides	IDT Technology	5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′
RNAse inhibitor (40 U µL-1)	Clontech	2313A
sarcomeric α-actinin	Sigma-Aldrich, MERCK	EA-53
SP8 confocal microscope	Leica Microsystems	SP8	Confocal microscope
Superscript II first-strand buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Triton X-100	Sigma-Aldrich, MERCK	T9284
TryplE Express enzyme, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013
TSO (100 µM)	QIAGEN	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′
Vibrant Dye Cycle green	Thermo Fisher Scientific	V35004