Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61580

⸱

1 september 2020

 , 
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten is een opkomende techniek voor de structurele karakterisering van eiwitten. Verschillende oplosmiddel additieven en liganden hebben verschillende hydroxyl radicale opruimeigenschappen. Om de eiwitstructuur in verschillende omstandigheden te vergelijken, is real-time compensatie van hydroxylradicalen die in de reactie worden gegenereerd nodig om reactieomstandigheden te normaliseren.

Samenvatting

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een op massaspectrometrie gebaseerde structurele biologietechniek die het oplosmiddel toegankelijke oppervlakte van eiwitten sondes. Deze techniek is gebaseerd op de reactie van aminozuurzijketens met hydroxylradicalen die zich vrij verspreiden in oplossing. FPOP genereert deze radicalen in situ door laser fotolyse van waterstofperoxide, het creëren van een uitbarsting van hydroxyl radicalen die is uitgeput in de orde van een microseconde. Wanneer deze hydroxylradicalen reageren met een oplosmiddel-toegankelijke aminozuurzijketen, vertonen de reactieproducten een massaverschuiving die kan worden gemeten en gekwantificeerd door massaspectrometrie. Aangezien de reactiesnelheid van een aminozuur gedeeltelijk afhangt van het gemiddelde toegankelijke oppervlak van dat aminozuur, kunnen gemeten veranderingen in de hoeveelheid oxidatie van een bepaald eiwitgebied direct worden gecorreleerd met veranderingen in de oplosmiddeltoegankelijkheid van dat gebied tussen verschillende conformaties (bijvoorbeeld ligand gebonden versus ligand-vrij, monomeer vs. aggregaat, enz.) FPOP is toegepast in een aantal problemen in de biologie, waaronder eiwit-eiwit interacties, eiwit conformatie veranderingen, en eiwit-ligand binding. Aangezien de beschikbare concentratie hydroxylradicalen varieert op basis van vele experimentele omstandigheden in het FPOP-experiment, is het belangrijk om de effectieve radicale dosis te controleren waaraan de eiwitanalyt wordt blootgesteld. Deze monitoring wordt efficiënt bereikt door het opnemen van een inline dosimeter om het signaal van de FPOP reactie te meten, met laser fluence aangepast in real-time om de gewenste hoeveelheid oxidatie te bereiken. Met deze compensatie kunnen veranderingen in eiwittopografie die conformatieveranderingen, ligandbindende oppervlakken en/of eiwit-eiwitinteractie-interfaces weerspiegelen, worden bepaald in heterogene monsters met relatief lage monsterhoeveelheden.

Inleiding

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een opkomende techniek voor de bepaling van eiwittopografische veranderingen door ultrasnelle covalente modificatie van het oplosmiddel blootgestelde oppervlak van eiwitten, gevolgd door detectie door LC-MS1. FPOP genereert een hoge concentratie hydroxylradicalen in situ door UV-laserflitsfotolyse van waterstofperoxide. Deze hydroxyl radicalen zijn zeer reactief en van korte duur, verbruikt op ongeveer een microseconde tijdschaal onder FPOP voorwaarden2. Deze hydroxylradicalen verspreiden zich door water en oxideren verschillende organische componenten in oplossing tegen kinetische snelheden die over het algemeen variëren van snel (~106 M-1 s-1) tot diffusiegecontroleerde3. Wanneer de hydroxylradical een eiwitoppervlak tegenkomt, oxideert de radicaal de aminozuurzijketens op het eiwitoppervlak, wat resulteert in een massaverschuiving van dat aminozuur (meestal de netto toevoeging van één zuurstofatoom)4. De snelheid van de oxidatiereactie bij elk aminozuur hangt af van twee factoren: de inherente reactiviteit van dat aminozuur (dat afhankelijk is van de zijketen en de volgordecontext)4,5 en de toegankelijkheid van die zijketen aan de diffuserende hydroxylradica, die nauw correleert met het gemiddelde oplosmiddel toegankelijk oppervlak6,7. Alle standaard aminozuren, behalve glycine, zijn waargenomen zoals gelabeld door deze zeer reactieve hydroxylradicalen in FPOP-experimenten, zij het bij zeer uiteenlopende opbrengsten; in de praktijk worden Ser, Thr, Asn en Ala zelden gezien als geoxideerd in de meeste monsters, behalve onder hoge radicale doses en geïdentificeerd door zorgvuldige en gevoelige gerichte ETD fragmentatie8,9. Na oxidatie worden monsters gedoofd om waterstofperoxide en secundaire oxidanten (superoxide, singlet oxygen, peptidylhydrperoxiden, enz.) te verwijderen De gedoofde monsters worden vervolgens proteolytisch verteerd om mengsels van geoxideerde peptiden te genereren, waarbij de structurele informatie wordt bevroren als een chemische "momentopname" in de patronen van oxidatieproducten van de verschillende peptiden(figuur 1). Vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) wordt gebruikt om de hoeveelheid oxidatie van aminozuren in een bepaald proteolytisch peptide te meten op basis van de relatieve intensiteiten van de geoxideerde en niet-geoxideerde versies van dat peptide. Door deze oxidatieve voetafdruk van hetzelfde eiwit te vergelijken die onder verschillende conformatieomstandigheden wordt verkregen (bijvoorbeeld ligand-gebonden versus ligand-vrij), kunnen verschillen in de mate van oxidatie van een bepaald eiwitgebied direct worden gecorreleerd met verschillen in het oplosmiddel-toegankelijke oppervlakte van dat gebied6,7. De mogelijkheid om eiwittopografische informatie te verstrekken maakt FPOP een aantrekkelijke technologie voor de hogere orde structuur bepaling van eiwitten, ook in eiwit therapeutische ontdekking en ontwikkeling10,11.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van FPOP. Het oppervlak van het eiwit wordt covalent gewijzigd door zeer reactieve hydroxylradicalen. De hydroxylradicalen zullen reageren met aminozuurzijketens van het eiwit in een tempo dat sterk wordt beïnvloed door de oplosmiddel toegankelijkheid van de zijketen. Topografische veranderingen (bijvoorbeeld als gevolg van de binding van een ligand zoals hierboven afgebeeld) zullen aminozuren in het interactiegebied beschermen tegen reageren met hydroxylradicalen, wat resulteert in een afname van de intensiteit van gemodificeerd peptide in het LC-MS-signaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Verschillende bestanddelen die aanwezig zijn in de FPOP-oplossing (bijvoorbeeld liganden, excipiënten, buffers) hebben verschillende opruimingsactiviteit naar de hydroxylradicalen gegenereerd op de laserfotolyse van waterstofperoxide3. Op dezelfde manier kan een kleine verandering in peroxideconcentratie, laserfluence en buffersamenstelling de effectieve radicale dosis veranderen, waardoor de reproductie van FPOP-gegevens uitdagend is voor de monsters en tussen verschillende laboratoria. Daarom is het belangrijk om de hydroxylradicale dosis die beschikbaar is om te reageren met eiwitten in elk monster te kunnen vergelijken met een van de verschillende beschikbare hydroxylradicale dosimeters12,13,14,15,16. Hydroxyl radicale dosimeters handelen door te concurreren met de analyt (en met alle aaseters in oplossing) voor de pool van hydroxyl radicalen; de effectieve dosis hydroxylradicalen wordt gemeten door de hoeveelheid oxidatie van de dosimeter te meten. Merk op dat "effectieve hydroxyl radicale dosis" is een functie van zowel de initiële concentratie van hydroxyl radicaal gegenereerd en de halftijds van de radicale. Deze twee parameters zijn gedeeltelijk afhankelijk van elkaar, waardoor de theoretische kinetische modellering enigszins complex is (figuur 2). Twee monsters zouden een wild verschillende initiële halflevenshelft kunnen hebben, terwijl ze nog steeds dezelfde effectieve radicale dosis behouden door de initiële concentratie hydroxylradicalen te veranderen; ze zullen nog steeds identieke voetafdrukken genereren17. Adenine13 en Tris12 zijn handige hydroxyl radicale dosimeters omdat hun niveau van oxidatie kan worden gemeten door UV-spectroscopie in real-time, waardoor onderzoekers snel te identificeren wanneer er een probleem is met effectieve hydroxyl radicale dosis en om hun probleem op te lossen. Om dit probleem op te lossen, is een inline dosimeter die zich direct na de plaats van bestraling in het stroomsysteem bevindt die het signaal van adenine-absorptieveranderingen in real-time kan controleren, belangrijk. Dit helpt bij het uitvoeren van FPOP experimenten in buffers of een andere excipiënt met zeer uiteenlopende niveaus van hydroxyl radicale opruimcapaciteit17. Deze radicale dosering compensatie kan worden uitgevoerd in real-time, waardoor statistisch niet te onderscheiden resultaten voor dezelfde conformer door het aanpassen van de effectieve radicale dosis.

In dit protocol hebben we gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van een typisch FPOP-experiment met radicale doseringscompensatie met adenine als interne optische radicale dosimeter. Met deze methode kunnen onderzoekers voetafdrukken vergelijken tussen FPOP-omstandigheden die verschillende opruimcapaciteit hebben door compensatie in real-time uit te voeren.

figure-introduction-2
Figuur 2: Kinetische simulatie van op dosimetrie gebaseerde compensatie. 1 mM adenine dosimeter respons wordt gemeten in 5 μM lysozyme analyt met een 1 mM initiële hydroxyl radicale concentratie (▪OH t1/2=53 ns), en ingesteld als een doel dosimeter respons (zwart). Na de toevoeging van 1 mM van de aasgier excipiënt histidine, de dosimeter respons (blauw) afneemt samen met de hoeveelheid eiwit oxidatie op een evenredige manier (cyaan). De halftijd van de hydroxylradicalen neemt ook af (▪OH t1/2=39 ns). Wanneer de hoeveelheid hydroxylradical gegenereerde wordt verhoogd om een gelijkwaardige opbrengst van geoxideerde dosimeter in het monster te geven met 1 mM histidine-aasgier zoals bereikt met 1 mM hydroxylradical bij afwezigheid van aaseters (rood), wordt de hoeveelheid eiwitoxidatie die op dezelfde manier optreedt identiek (magenta), terwijl de hydroxylradicale halfwaardetijd nog verder afneemt (▪OH t1/2=29 ns). Aangepast met toestemming van Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid de optische bank en de capillaire voor FPOP

LET OP: KrF excimer lasers zijn extreme oogrisico's, en direct of gereflecteerd licht kan leiden tot blijvende oogschade. Draag altijd de juiste oogbescherming, vermijd de aanwezigheid van reflecterende objecten in de buurt van het bundelpad waar mogelijk, en gebruik technische bedieningselementen om ongeoorloofde toegang tot een actieve laser te voorkomen en om eventuele verdwaalde reflecties te beperken.

  1. Bereid de FPOP optische bank voor.
    1. Zet de laser aan om op te warmen. Stel de laser in op Externe Trigger, Constante Energie, Geen gasvervanging. Stel de laserenergie per puls in (meestal tussen 80-120 mJ/puls).
    2. Zet de optische bank met de plano-convex lens (30 mm Dia. x 120 mm FL ongecoat) direct in het pad van de laserstraal en een niet-reflecterende backstop om het licht te absorberen, zoals weergegeven in figuur 3A.

figure-protocol-1
Figuur 3: Optische bank voor het FPOP-experiment. (A) Het monster wordt gemengd met H2O2, adenine radicale dosimeter, en glutamine aaseters en geladen in de spuit. Het monster wordt door de gesmolten silica capillaire geduwd door de gerichte bundel pad van een KrF excimer UV-laser. Het UV-licht fotolyseert H2O2 in hydroxylradicalen, die het eiwit en de adenine dosimeter oxideren. De spuitstroom duwt het verlichte monster uit het pad van de laser vóór de volgende laserpuls, met een onverlicht uitsluitingsvolume tussen verlichte gebieden. Onmiddellijk na oxidatie wordt het monster doorgegeven via een inline UV-spectrofotometer, die de UV-absorptie van adenine meet bij 265 nm. Het monster wordt vervolgens afgezet in een blusbuffer om de resterende H2O2 en secundaire oxidanten te elimineren. (B) De spotgrootte wordt gemeten na het bestralen van een gekleurde plakbrief die achter de capillaire met de laser op 248 nm is aangebracht. De breedte van de spot wordt gebruikt voor het berekenen van de monsterstroomsnelheid, en het silhouet van de capillaire in het midden van de spot wordt gebruikt om de optische bank uit te lijnen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Snijd een geschikte lengte van de gesmolten silica capillair (360 μm buitendiameter en 100 μm binnendiameter) en sluit met behulp van een mouw de gasdichte spuit aan met behulp van een low dead volume connector.
  2. Verbrand voorzichtig de polyimidecoating van de capillaire met een butaanfakkel op de plaats waar de inline dosimeter het absorptiesignaal op 265 nm leest na blootstelling aan de monsters. Veeg het puin op de capillaire voorzichtig met behulp van methanol op een pluisvrij doekje. De polyimide coating op de plaats van laser incidentie kan op dezelfde manier worden afgebrand met de butaan fakkel of afgebrand met de excimer laser vuren op een laag vermogen.
    LET OP: Wacht tot de capillaire is afgekoeld, want het is brandgevaar om de methanol op de hete capillaire te gebruiken.
  3. Plaats deze capillaire door de bundel pad van de laser en in de inline dosimeter.
    1. Druk op de hendel aan de bovenkant van de inline dosimeter om het scharnier te openen. Verwijder de magnetische houders. Plaats de capillaire in de bewerkte groef van de inline dosimeter, met behulp van de magnetische houders om de capillaire op zijn plaats te houden. Sluit het dosimeterscharnier over de capillaire en druk erop totdat de hendel op zijn plaats wordt vergrendeld.
  4. Klik met de dosimetriesoftware op de knop Flash starten om de excimerlaser te beginnen afvuren. Stel de vooraf ingestelde laserkracht in tussen 50-100 mJ/puls op de laserbesturingssoftware zelf en stel de vooraf ingestelde herhalingssnelheid in tussen 10-20 Hz op het tabblad Instellingen van de dosimetriesoftware.
    1. Focus de laserstraal met behulp van een plano convex lens gemonteerd op een lineaire gemotoriseerde fase. Meet de breedte en de hoogte van de laserspot op de positie van het capillair op een kleverige noot, precies met behulp van een remklauw om incidentfluence (mJ/mm2) te berekenen, zoals aangegeven in figuur 3B.
  5. Plaats een ondoorzichtig diafragma in de buurt van de capillaire om een consistente verlichte breedte van het capillair te garanderen, ongeacht veranderingen in de bundelgrootte als gevolg van beweging van de lens of het veranderen van de energie per puls van de laser18.
    1. Met de laser vuren, beweeg de gemotoriseerde fase door zijn bereik van de beweging. Zorg ervoor dat de balk gecentreerd blijft op het diafragma en dat het silhouet van de capillaire overal kan worden waargenomen. De diameter van het diafragma moet kleiner zijn dan de breedte van de impinging focused beam op elk punt in het bereik van de gemotoriseerde fase.
  6. Voer water minstens één minuut door de capillaire op 20 μL/min om de capillaire te wassen.
    1. Klik op de knop Gegevens starten + AutoZero op de dosimetersoftware om de dosimeter te geven om water te geven en te beginnen met het verzamelen van gegevens.
      OPMERKING: Als het buffersysteem voor FPOP een aanzienlijke UV-absorptie heeft bij 265 nm, moet het FPOP-systeem op de buffer worden afgenomen, niet op water.
  7. Stel de berekende debiet op de spuitpomp in.
    1. De stroomsnelheid van het eiwitmonster is afhankelijk van het bestraalde volume per shot(VIrr), het aantal lasershots per seconde(R)en de gewenste niet-bestraalde uitsluitingsvolumefractie (FEx) om te corrigeren voor laminaire stroomeffecten en monsterdiffusie (0,15-0,30 aanbevolen)2,19,20. Bereken de VIrr (in μL) op basis van de binnendiameter van het capillair in mm (d) en de breedte van de laserspot die de capillaire (d.w.z. de breedte van het diafragma) in mm (w) belemmert met behulp van de volgende vergelijking:
      VIrr = π(d/2)2w
    2. Bereken de gewenste debiet (in μL/min) op basis van de volgende vergelijking:
      Flow = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. Bereiding van de eiwitoplossing voor FPOP

  1. Bereid het eiwit in de twee of meer verschillende omstandigheden voor om te vergelijken (bijvoorbeeld ligand-gebonden en ligand-vrij; aggregaat en monomeer; alleen en met een eiwitbindende partner; enz.) voor het detecteren van de conformatieveranderingen.
  2. Stel het totale volume in dat wordt gebruikt voor FPOP op de behoeften van het experiment. De minimumlimiet is meestal afhankelijk van de omvang van de bestralingskapping en het materiaal dat nodig is voor robuuste detectie en relatieve kwantificering, en zal grotendeels variëren afhankelijk van het gebruikte LC-MS/MS-systeem en de methode voor monsterverwerking na het etiketteren. Het totale volume voor FPOP-oplossingen die vaak in onze groep worden gebruikt, is 20 μL na de toevoeging van waterstofperoxide. De uiteindelijke concentratie van het eiwit is meestal 1-10 μM, met 17 mM glutamine (om de levensduur van de hydroxylradicalen te beperken), 1 mM adenine (om op te treden als een radicale dosimeter)13,17 en 10 mM fosfaatbuffer (een buffer die een slechte aaseters van hydroxylradicalen is). Monsters worden over het algemeen bereid met meerdere replica's om statistische modellering van de resultaten mogelijk te maken.
    1. Voor de meeste algemene doeleinden, bereiden monsters in drievoud in beide staten, plus ten minste een monster te gebruiken als een no-laser controle om achtergrond oxidatie te meten. Bereid 18 μL van deze FPOP-oplossingsmix voor.
      OPMERKING: Veel buffers en additieven die vaak worden gebruikt in de biochemie zijn hydroxyl radicale aaseters. Deze additieven en buffers kunnen worden gebruikt; oxidatie als gevolg van hydroxylradicalisering van de buffer kan echter worden afbouwen. Houd in het algemeen alle additieven tot een minimum dat het biologische systeem vereist om de opbrengst van eiwitoxidatie te maximaliseren. Dimethylsulfoxide moet worden vermeden vanwege de neiging om secundaire radicalen te genereren; dimethylformamide is een nuttig alternatief in onze handen. Bij het gebruik van buffers die sterke hydroxylradicale aaseters zijn, kan glutamine vaak worden uitgesloten van de FPOP-oplossingsmix.
  3. Bereid 1 M waterstofperoxide vlak voor het FPOP experiment.
    OPMERKING: 30% waterstofperoxide zoals gewoonlijk verkocht door leveranciers omvat een stabilisator, die de houdbaarheid verhoogt. Eenmaal verdund, waterstofperoxide moet snel worden gebruikt, zeker binnen dezelfde dag. Waterstofperoxide moet ook regelmatig worden getest op ontbinding door FPOP met behulp van een hydroxyl radicale dosimeter.
  4. Bereid microcentrifugebuizen met 25 μL blusoplossing van 0,5 μg/μL methionine temidden en 0,5 μg/μL catalase. Als een monstervolume van meer dan 20 μL wordt gebruikt voor FPOP, verhoogt u het volume van de blusoplossing proportioneel.

3. Voer het FPOP-experiment uit

  1. Voeg 2 μL waterstofperoxide toe aan de 18 μL van de FPOP-oplossingsmix. Meng de inhoud voorzichtig met een pipet en draai snel de oplossing naar de bodem van de microcentrifugebuizen. Direct verzamelen met een gasachtige spuit en laad in de spuitpomp.
  2. Start de stroom op de spuitpomp met de stroomsnelheid zoals bepaald in stap 1.8.1 (meestal tussen 8-16 μL/min) door op de knop Startpomp op de dosimetersoftware te klikken.
  3. Monitor de real-time adenine lezing met behulp van de inline dosimeter (zie Tabel van materialen)en verzamel het monster in afval. Wacht tot het Abs265 signaal stabiliseert.
  4. Klik op de Knop Start Flash in de dosimetersoftware om de laser te starten met de vooraf ingestelde herhalingssnelheid en energie.
  5. Controleer de real-time adenine lezing met behulp van een inline dosimeter (zie Tabel van materialen); het verschil in Abs265 met de laser uit en de laser op is de ΔAbs265 lezing.
    OPMERKING: Het verschijnen van zeer onstabiele Abs265 metingen bij het afvuren van de laser in aanwezigheid van waterstofperoxide is te wijten aan de generatie van bellen in oplossing. Verminder de fluence van de laser en/of de concentratie waterstofperoxide om de bellen te elimineren.

4. Compensatie uitvoeren

OPMERKING: Verschillende liganden, buffers, enz. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat vergelijkbare effectieve hydroxylradicale doses beschikbaar zijn om te reageren met eiwitten in verschillende monsters. Dit wordt bereikt door te zorgen voor gelijke hydroxyl radicale dosimeter reactie tussen monsters. Met behulp van adenine dosimetrie weerspiegelt de verandering in UV-absorptie bij 265 nm (ΔAbs265)de effectieve hydroxylradicale dosis; hoe groter de ΔAbs265,hoe hoger de effectieve hydroxylradicale dosis.

  1. Vergelijk de ΔAbs265 met verkregen met de inline dosimeter met de gewenste ΔAbs265-meting verkregen door eerdere experimenten of besturingselementen. Een ΔAbs265-lezing lager dan de gewenste meting duidt op een onvoldoende effectieve dosis hydroxylradicalen; een ΔAbs265 lezing geeft een effectieve radicale dosis aan die te hoog is. Als de ΔAbs265-meting zich op het gewenste niveau bevindt, verzamelt u het monster onmiddellijk na laserbestraling in de blusbuffer17.
  2. Compenseer de effectieve radicale dosis om de ΔAbs265gelijk te maken. Deze compensatie kan op drie manieren worden uitgevoerd: verander de concentratie van waterstofperoxide, verhoog de laserfluentie door de laserenergie per puls te veranderen of de laserfluence te verhogen door het brandpuntsvlak van de scherpstellens te veranderen.
    1. Om een grote verandering (>10 mAU) in ΔAbs265 lezing, remake van het monster met min of meer waterstofperoxide en herhaal het monster volgens sectie 3.
    2. Om een kleine verandering in ΔAbs265 lezing in real-time, pas het brandpuntsvlak van de incidentbundel door het aanpassen van de positie van de scherpstellens met behulp van de 50 mm Gemotoriseerde Stage. Door het brandpuntsvlak dichter bij de positie van de capillaire te brengen, zal de ΔAbs265-lezing toenemen; het bereiken van het brandpuntsvlak verder van de positie van de capillaire zal de ΔAbs265 lezing verminderen.
  3. Controleer de adenine ΔAbs265 om de effectieve hoeveelheid hydroxylradicalen in het monster te meten na laserbestraling13. Real-time monitoring met een inline UV-capillaire detector zorgt voor real-time compensatie zoals beschreven in punt 4.2.2; de lenspositie aan te passen met behulp van de gemotoriseerde fase totdat de ΔAbs265-meting gelijk is aan de gewenste meting. Post-experimentele absorptiemetingen met een UV-spectrofotometer zijn ook nauwkeurig, maar vereisen nieuwe monsters die moeten worden gebruikt voor elke effectieve radicale dosis.

5. Verteren de eiwitmonsters

OPMERKING: Trypsine wordt meestal gebruikt om eiwitmonsters voor FPOP te verteren en is de protease die in dit protocol wordt gebruikt. Het is een betrouwbare protease die peptiden genereert met basissites, zowel op de N- en C-terminus, het bevorderen van vermenigvuldigen geladen peptide ionen bij MS. Bovendien klitten het na lysine en arginine, twee aminozuren die slechts matig reactief zijn op hydroxylradicalen; daarom zijn veranderingen in het spijsverteringspatroon als gevolg van analytoxidatie zeldzaam. Andere proteases zijn met succes gebruikt met FPOP21,maar zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen spijsverteringspatronen zijn vergelijkbaar tussen niet-geoxideerde en geoxideerde monsters.

  1. Meet het uiteindelijke volume van het gedoofde FPOP-monster. Voeg 500 mM Tris, pH 8.0 met 10 mM CaCl2 met 50 mM dithiothreitol (DTT) toe aan de eiwitoplossing na het blussen tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM Tris, 1 mM CaCl2 en 5 mM DTT.
  2. Verwarm het eiwitmonster gedurende 15 minuten op 95 °C.
  3. Koel het monster onmiddellijk 2 min af op ijs.
  4. Voeg de gewichtsverhouding van 1:20 trypsine/eiwit toe aan de monsters.
  5. Verteren het eiwit 's nachts bij 37 °C met mengen.
  6. Stop de spijsverteringsreactie door de toevoeging van 0,1% mierenzuur en/of verwarm het monster gedurende 10 minuten tot 95 °C.
  7. Voeg 2 mM DTT toe aan de monsters en verwarm 15 minuten voor LC-MS/MS bij 60 °C.
    OPMERKING: Terwijl andere groepen alkylation van thiolen in FPOP-experimenten hebben gemeld, hebben we in onze handen zijproducten opgemerkt over alkylation van geoxideerde eiwitten (mogelijk als gevolg van reactie met nucleofiele carbonylen gevormd als een klein oxidatieproduct). Daarom kiezen we ervoor om alkyleratie van thiolen te vermijden wanneer mogelijk.

6. Vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) uitvoeren

  1. Bereid de mobiele fase A voor bestaande uit water met 0,1% mierenzuur en mobiele fase B bestaande uit acetonitril met 0,1% mierenzuur.
  2. Laad het monster eerst op een C18-valkolom (300 μm I.D. x 5 mm 100 Å poriegrootte, 5 μm deeltjesgrootte) vangcartridge en was 3 minuten met 2% oplosmiddel B bij een stroomsnelheid van 5,0 μL/min om zouten en hydrofiele kleine moleculen te verwijderen.
  3. Scheid vervolgens de peptiden op C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte) bij een stroomsnelheid van 300 nL/min. De helling bestaat uit een lineaire toename van 2 tot 35% oplosmiddel B over 22 min, gehelopt tot 95% oplosmiddel B meer dan 5 min en gehouden gedurende 3 min om de kolom te wassen, en vervolgens terug naar 2% B over 3 min en gehouden voor 9 min om de kolom opnieuw te equiliben.
    OPMERKING: Dit verloop is voldoende voor LC-MS/MS van de meeste een- en tweeeirijke FPOP-mengsels die peptide-niveau kwantificering willen doen. Het percentage van oplosmiddel B kan nodig zijn om te worden gewijzigd om peptide resolutie te verhogen in zeldzame gevallen waarin peptiden interfereren met elkaar als gevolg van vergelijkbare retentietijden en m / z waarden. Proteome-schaal FPOP22 of experimentele ontwerpen op zoek naar peptide oxidatie product isomeren1,,23,2424,25 kan vereisen langere LC gradiënten en zijn buiten het toepassingsgebied van dit rapport.
  4. Elute de peptiden direct in de nanospray bron van een hoge resolutie massa spectrometer met behulp van een geleidende nanospray zender.
  5. Verwerf de gegevens in de positieve ionenmodus. Stel de sproeispanning in op 2400 V en de temperatuur van de ionentransportbuis op 300 °C.
  6. Verwerf de volledige MS-scans van m/z 250 tot 2000 bij een nominale resolutie bij m/z 200 van 60.000, gevolgd door acht latere dataafhankelijke lineaire ionval MS/MS-scans op de bovenste acht meest voorkomende peptide-ionen met behulp van botsings-geïnduceerde dissociatie bij 35% genormaliseerde energie om de peptiden te identificeren. Fragment de peptiden tot vijf keer binnen 30 s en vervolgens over te dragen aan een uitsluiting lijst voor 60 s.

7. Gegevensverwerking en berekening van de gemiddelde oxidatie van peptiden

  1. Bepaal de sequentiedekking van het eiwit, m/z-waarden en bewaartijden van niet-geoxideerd peptiden met behulp van de MS/MS proteomics zoekmachine.
  2. Stel de voorloper massatolerantie in op 10 ppm en laat maximaal twee gemiste decolletéplaatsen toe voor de trypsine verteerde monsters, met behulp van standaard trypsine decolleté specificiteit.
  3. Stel het peptide massafragment massatolerantie in op 0,4 Daltons.
  4. Op basis van de m/z-verhouding van de niet-gewijzigde peptiden die worden gedetecteerd en de bekende massaverschuivingen van de belangrijkste oxidatieproducten, berekent u de m/z van de verschillende theoretische oxidatieproducten van elk peptide4,26,27,28,29.
  5. Identificeer het geëxtraheerde ionenchromatogram van deze m/z-waarden met behulp van software om de massaspectrometrische run te bekijken (figuur 4). Identificeer de peptide oxidatie producten op basis van hun m / z,hun lading staat, en de gelijkenis in elution tijd aan de ongewijzigde peptide. In onze handen, peptide oxidatie producten elute tussen 240 seconden voor tot 180 seconden na de ongewijzigde peptide met behulp van de LC gradiënt hierboven. Aangezien oxidatie vaak zal resulteren in meerdere isomerische oxidatieproducten, is het gebruikelijk om meerdere gedeeltelijk opgeloste pieken in de geëxtraheerde ionchromatogrammen van peptide oxidatieproducten waar te nemen, zoals weergegeven in figuur 4. Peptide oxidatie producten worden gekwantificeerd op basis van het gebied van de piek(en) in de geëxtraheerde ionchromatogrammen.

figure-protocol-2
Figuur 4: Geëxtraheerd ionenchromatischogram van een peptide en zijn oxidatieproducten na FPOP. De m/z van de peptide oxidatieproducten worden berekend op basis van de m/z van het niet-geoxidiseerde peptide en de bekende oxidatieproducten; en de gebieden van deze peptide producten worden bepaald. Het gebied van de peptide producten wordt vervolgens gebruikt voor de berekening van de gemiddelde oxidatie gebeurtenissen per peptide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Bereken de gemiddelde oxidatie van de peptiden met behulp van de volgende vergelijking.

figure-protocol-3

waar P het gemiddelde aantal oxidatiegebeurtenissen per peptidemolecuul aangeeft, en ik het piekgebied van het niet-geoxideerde peptide(Iunoxidized)en het peptide met n oxidatiegebeurtenissen vertegenwoordigt. Merk op dat ik (afzonderlijk geoxideerd) zou niet alleen toevoegingen van een enkel zuurstofatoom, maar ook andere minder voorkomende enkele oxidatie gebeurtenissen die de onderzoeker kan kiezen om te meten (bijvoorbeeld oxidatieve decarboxylation, carbonyl vorming, enz.) 4,26,27,28,29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergelijking van de zware keten peptide voetafdruk van de adalimumab biosimilar in fosfaat buffer en bij verhitting bij 55 °C voor 1 uur tonen interessante resultaten. Student t-test wordt gebruikt voor de identificatie van peptiden die aanzienlijk worden veranderd in deze twee voorwaarden (p ≤ 0,05). De peptiden 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 en 414-420 tonen aanzienlijke bescherming tegen oplosmiddel wanneer het eiwit wordt verwarmd tot aggregaten(figuur 5)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Mass spectrometrie gebaseerde structurele technieken, met inbegrip van waterstof-deuterium uitwisseling, chemische cross-linking, covalente etikettering, en native spray massaspectrometrie en ionen mobiliteit zijn snel groeiende in populariteit als gevolg van hun flexibiliteit, gevoeligheid, en het vermogen om complexe mengsels te behandelen. FPOP heeft verschillende voordelen die zijn populariteit op het gebied van massaspectrometrie gebaseerde structurele technieken heeft versterkt. Net als de meeste covalente etikette...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Joshua S. Sharp onthult een aanzienlijk financieel belang in GenNext Technologies, Inc., een klein bedrijf dat technologieën wil commercialiseren voor eiwitrijke analyse van de orderstructuur, waaronder hydroxylradicale eiwitvoetafdruk.

Dankbetuigingen

We erkennen onderzoeksfinanciering van het National Institute of General Medical Sciences grant R43GM125420-01to ter ondersteuning van commerciële ontwikkeling van een benchtop FPOP-apparaat en R01GM127267 voor de ontwikkeling van standaardisatie- en dosimetrieprotocollen voor hoogenergetische FPOP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AdenineAcros Organics147440250Oplosbaar in water tot 3,5 mM
ApertureEdmund Optics39-9051000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holderEdmund Optics53-28725,8 mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
CatalseSigma AldrichC-40Catalase uit runderlever, gevriesdroogd poeder, ≥10.000 eenheden/mg eiwit
COMPex Pro laserCoherent1113836COMPexPRO 102, F-Vversie, KrF laser, geen XeCl
Dithiotheitol (DTT)PromegaV3151DTT, moleculaire kwaliteit (DL-Dithiothreitol)
Fraction collectorGenNext Technologies, Inc.N/AGeautomatiseerde fractiecollector
Fused silica capillayMolex1068150023Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
GlutamineAcros Organics119951000L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lensEdmund Optics03-66853 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxideFisher ScientificH325-100Waterstofperoxide, 30% (gecertificeerd ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS systemThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCXDionex Ultimate 3000 gekoppeld aan Orbitap Fusion Tribrid massaspectrometer
Mas spec grade AcetonitrileFisher ScientificA955-1Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acidFisher ScientificA117-50Mierenzuur, 99,0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade waterFisher ScientificW6-4Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES bufferSigma AldrichM0164MES hemisodiumzout
Methionine amideBachem4000594.0005H-met-NH2.HCl
Micro V clampThor LabsVK250Micro V-klem met roestvrijstalen messen
Motorized stageEdmund Optics68-63850 mm reis gemotoriseerde stage systeem met handmatige bediening
Nano C18 columThermo Scientific164534Acclaim PepMap 100 C18 HPLC-kolommen
Optical benchEdmund Optics56-93518" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module SystemGenNext Technologies, Inc.N/AInline FPOP Radical Dosimetry System
Post holderEdmund Optics58-9793" lengte, ¼-20 draad, Post Holder
Sodium phosphate dibasicFisher ScientificBP331-500Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat (kleurloze tot witte kristallen), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasicFisher ScientificBP330-500Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (kleurloze tot witte kristallen), Fisher BioReagents
SyringeHamilton81065100 µL, Model 1710 RN SYR, Kleine verwijderbare NDL, 22s ga, 2 in, puntstijl 3
Syringe pumpKD Scientific788101Legato 101 spuitpomp
Trap C18 columnThermo Scientific160454Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC-kolommen
TrisSigma Aldrich252859Tris(hydroxymethyl)aminomethaan
TrypsinPromegaV5111Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lensEdmund Optics84-28530 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

Referenties

  1. Kaur, P., Kiselar, J., Yang, S., Chance, M. R. Quantitative protein topography analysis and high-resolution structure prediction using hydroxyl radical labeling and tandem-ion mass spectrometry (MS). Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1159-1168 (2015).
  2. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  3. Buxton, G. V., Greenstock, C. L., Helman, W. P., Ross, A. B. Critical review of rate constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals (·OH/·O- in Aqueous Solution. Journal of Physical and Chemical Reference Data. 17 (2), 513(1988).
  4. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification and reactivity of amino acid residues serving as structural probes for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (14), 4549-4555 (2005).
  5. Sharp, J. S., Tomer, K. B. Effects of anion proximity in peptide primary sequence on the rate and mechanism of leucine oxidation. Analytical Chemistry. 78 (14), 4885-4893 (2006).
  6. Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
  7. Xie, B., Sood, A., Woods, R. J., Sharp, J. S. Quantitative protein topography measurements by high resolution hydroxyl radical protein footprinting enable accurate molecular model selection. Scientific Reports. 7 (1), 4552(2017).
  8. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  9. Li, X., et al. Structural analysis of the glycosylated intact HIV-1 gp120-b12 antibody complex using hydroxyl radical protein footprinting. Biochemistry. 56 (7), 957-970 (2017).
  10. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  11. Li, J., Chen, G. The use of fast photochemical oxidation of proteins coupled with mass spectrometry in protein therapeutics discovery and development. Drug Discovery Today. 24 (3), 829-834 (2019).
  12. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic buffer hydroxyl radical dosimetry using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  13. Xie, B., Sharp, J. S. Hydroxyl radical dosimetry for high flux hydroxyl radical protein footprinting applications using a simple optical detection method. Analytical Chemistry. 87 (21), 10719-10723 (2015).
  14. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  15. Niu, B., et al. Incorporation of a reporter peptide in FPOP compensates for adventitious scavengers and permits time-dependent measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (2), 389-392 (2017).
  16. Garcia, N. K., Sreedhara, A., Deperalta, G., Wecksler, A. T. Optimizing hydroxyl radical footprinting analysis of biotherapeutics using internal standard dosimetry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1563-1571 (2020).
  17. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real time normalization of fast photochemical oxidation of proteins experiments by inline adenine radical dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  18. Zhang, B., Cheng, M., Rempel, D., Gross, M. L. Implementing fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) as a footprinting approach to solve diverse problems in structural biology. Methods. 144, 94-103 (2018).
  19. Konermann, L., Stocks, B. B., Czarny, T. Laminar flow effects during laser-induced oxidative labeling for protein structural studies by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (15), 6667-6674 (2010).
  20. Gau, B. C., Sharp, J. S., Rempel, D. L., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of protein footprints faster than protein unfolding. Analytical Chemistry. 81 (16), 6563-6571 (2009).
  21. Li, K. S., et al. Hydrogen-Deuterium exchange and hydroxyl radical footprinting for mapping hydrophobic interactions of human bromodomain with a small molecule Inhibitor. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2795-2804 (2019).
  22. Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating biological interactions with in vivo protein footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
  23. Charvatova, O., et al. Quantifying protein interface footprinting by hydroxyl radical oxidation and molecular dynamics simulation: application to galectin-1. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (11), 1692-1705 (2008).
  24. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  25. Gau, B. C., Chen, J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing solvent-accessibility changes accompanying protein folding: Data processing and application to barstar. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1230-1238 (2013).
  26. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins. Chemical Reviews. 87 (2), 381-398 (1987).
  27. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of sulfur-containing amino acid residues in model peptides: fundamental studies for protein footprinting. Analytical Chemistry. 77 (8), 2437-2449 (2005).
  28. Xu, G., Chance, M. R. Radiolytic modification of acidic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 76 (5), 1213-1221 (2004).
  29. Xu, G., Takamoto, K., Chance, M. R. Radiolytic modification of basic amino acid residues in peptides: probes for examining protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 75 (24), 6995-7007 (2003).
  30. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated hydroxyl radical protein footprinting measures buffer and excipient effects on conformation and aggregation in an adalimumab biosimilar. AAPS Journal. 21 (5), 87(2019).
  31. Simmons, D. A., Konermann, L. Characterization of transient protein folding intermediates during myoglobin reconstitution by time-resolved electrospray mass spectrometry with on-line isotopic pulse labeling. Biochemistry. 41 (6), 1906-1914 (2002).
  32. Vahidi, S., Konermann, L. Probing the time scale of FPOP (fast photochemical oxidation of proteins): radical reactions extend over tens of milliseconds. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (7), 1156-1164 (2016).
  33. Chance, M. R. Unfolding of apomyoglobin examined by synchrotron footprinting. Biochemical and Biophysical Research Communications. 287 (3), 614-621 (2001).
  34. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  35. Zhang, Y., Rempel, D. L., Zhang, H., Gross, M. L. An improved fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) platform for protein therapeutics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (3), 526-529 (2015).
  36. Cornwell, O., Radford, S. E., Ashcroft, A. E., Ault, J. R. Comparing hydrogen deuterium exchange and fast photochemical oxidation of proteins: a structural characterisation of wild-type and ΔN6 β(2)-microglobulin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (2), 2413-2426 (2018).
  37. Xie, B., Sharp, J. S. Relative Quantification of sites of peptide and protein modification using size exclusion chromatography coupled with electron transfer dissociation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1322-1327 (2016).
  38. Srikanth, R., Wilson, J., Vachet, R. W. Correct identification of oxidized histidine residues using electron-transfer dissociation. Journal of Mass Spectrometry. 44 (5), 755-762 (2009).
  39. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Improved identification and relative quantification of sites of peptide and protein oxidation for hydroxyl radical footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1767-1776 (2013).
  40. Li, X., Li, Z., Xie, B., Sharp, J. S. Supercharging by m-NBA Improves ETD-Based Quantification of Hydroxyl Radical Protein Footprinting. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (8), 1424-1427 (2015).
  41. Khaje, N. A., Sharp, J. S. Rapid quantification of peptide oxidation isomers from complex mixtures. Analytical Chemistry. 92 (5), 3834-3843 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Snelle fotochemische oxidatiehydroxylradicaal dosimetrieinline dosimeterlaserfluens aanpassingconformationele eiwitveranderingenmassaspectrometrieanalyseoplosmiddeltoegankelijkheidcapillaire elektroforese
Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.