Electrocardiogram Opnames in verdoofde muizen met lead II

Samenvatting

We presenteren een ECG-protocol dat technisch eenvoudig, goedkoop, snel en betaalbaar is in kleine muizen en kan worden uitgevoerd met verbeterde gevoeligheid. We stellen deze methode voor als een screeningsbenadering voor het bestuderen van farmacologische agentia, genetische modificaties en ziektemodellen bij muizen.

Samenvatting

Het elektrocardiogram is een waardevol hulpmiddel voor de evaluatie van het cardiale geleidingssysteem. Dierlijk onderzoek heeft bijgedragen aan het genereren van nieuwe genetische en farmacologische informatie over het elektrocardiogram. Het maken van elektrocardiogrammetingen bij kleine dieren in vivo, zoals muizen, was echter een uitdaging. Hiertoe gebruikten we een elektrocardiogram opnamemethode bij verdoofde muizen met vele voordelen: het is een technisch eenvoudige procedure, is goedkoop, heeft een korte meettijd en is betaalbaar, zelfs bij jonge muizen. Ondanks de beperkingen met het gebruik van anesthesie, kunnen vergelijkingen tussen controle en experimentele groepen worden uitgevoerd met verbeterde gevoeligheid. We behandelden muizen met agonisten en antagonisten van het autonome zenuwstelsel om de geldigheid van dit protocol te bepalen en vergeleken onze resultaten met eerdere rapporten. Ons ECG-protocol detecteerde verhoogde hartslag- en QTc-intervallen bij de behandeling met atropine, verminderde hartslag en QTc-intervallen na de behandeling met Carbachol en hogere hartslagen en QTc-intervallen met isoprenaline, maar merkten geen verandering in ECG-parameters op het toedienen van propranolol. Deze resultaten worden ondersteund door eerdere rapporten, die de betrouwbaarheid van dit ECG-protocol bevestigen. Deze methode kan dus worden gebruikt als een screeningbenadering voor het uitvoeren van ECG-metingen die anders niet zouden worden geprobeerd vanwege hoge kosten en technische problemen.

Inleiding

Het elektrocardiogram (ECG), een test die de elektrische activiteit van iemands hartslag meet, is een waardevol hulpmiddel voor de evaluatie van het cardiale geleidingssysteem. De parameters die worden gemeten door een ECG zijn hartslag, PR-interval, QRS-duur en QT-interval. In het kort, PR-interval komt overeen met de tijd die nodig is voor een elektrische impuls om te reizen van de atriumsinusknoop door de atrioventriculaire knooppunt naar de Purkinje vezels; QRS duur is de tijd voor ventriculaire depolarisatie optreden via de Purkinje systeem en ventriculaire myocardium; en QT-interval is de duur van ventriculaire repolarisatie.

ECG-opnames bij muizen hebben onderzoekers geholpen de hartfunctie te onderzoeken en de fysiologische en pathofysiologische mechanismen van hartfenotypen te bepalen, zoals hartritmestoornissen, atriumfibrillatie en hartfalen. Het meeste cardiovasculaire onderzoek heeft studies in genetisch gemanipuleerde muismodellen betrokken. Het is vaak een uitdaging om zinvolle gegevens over ECG-opnames te verkrijgen van kleine muizen die genetisch gemanipuleerd zijn.

Er zijn verschillende methoden voor het uitvoeren van ECG's bij muizen¹. Studies suggereren dat ECG-opnames bij bewuste dieren de voorkeur hebben boven verdoofde dieren indien mogelijk, aangezien de effecten van anesthesie op de hartfunctie goed zijn vastgesteld². Twee protocollen die ECG registreren in bewuste muizen zijn van noot¹. Het ECG-radiotelemetriesysteem is de gouden standaard voor continue langetermijnmonitoring van ECG bij bewuste muizen^1,3. Ondanks hun kracht om in een bewuste staat te worden opgenomen, hebben radiotelemetrie-gekoppelde ECG-metingen verschillende beperkingen, waaronder de hoge kosten voor de installatie en voor het implantaat, de eis van een zeer ervaren operator, een stabilisatieperiode van meer dan 1 week, de behoefte aan grote muizen (> 20 g), en de verwerving van slechts één enkele lead van ECG-registratie¹. Een ander systeem dat gebruik maakt van geleidende elektroden ter grootte van pootformaat die in een platform zijn ingebed, maakt ECG-opnames in bewuste muizen mogelijk zonder verdoving of implantaten^1,4. Dit niet-invasieve systeem is een alternatieve methode in situaties waarin radiotelemetriesystemen niet beschikbaar zijn omdat het vele voordelen heeft: geen vereiste van chirurgische behandeling, geen noodzaak van anesthesie, lage kosten per muis (alleen de initiële installatie is duur), korte tijd voor meting en betaalbaarheid van neonaten^1,4. Het grootste nadeel van dit systeem is dat het niet geschikt is voor continue langetermijnmonitoring¹.

Hier introduceren we een andere goedkope, eenvoudige en snelle ECG-opnamemethode in verdoofde muizen en tonen we de geldigheid en gevoeligheid ervan door een ECG uit te voeren na autonome blokkade/stimulatie van het hartgeleidingssysteem. We stellen deze ECG-methode voor voor het screenen van de effecten van farmacologische agentia, genetische modificaties en ziektemodellen bij muizen.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het plaatselijke comité voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, de Kyung Hee University (licentienummer: KHUASP(SE)-18-108) en in overeenstemming met de Us National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Proefdieren

1. Houd alle muizen (39 muizen, Balb/c, man, 7\u20129 weken oud) in een ziekteverwekkervrije faciliteit volgens de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
2. Houd de muizen op een 12 uur licht/donkere cyclus op constante temperatuur met vrije toegang tot voedsel en water.

2. Bereiding van verdovingsmiddelen

OPMERKING: Tribromoethanol wordt gebruikt over ketaminecombinaties en isoflurane, gebaseerd op de stabiliteit van de hartslag en de reproduceerbaarheid van echocardiografie bij tribromoethanol-verdoofde muizen^1,5,6

1. Maak een voorraadoplossing van 2,2,2-tribromoethanol bij een concentratie van 1 g per 1 mL tertiaire amylalcohol. Warm bij 40\u201245 °C voor 24 uur. Bewaar 12 maanden bij 4 °C.
2. Verdun voor de werkoplossing 0,5 mL voorraadoplossing in 19,5 mL zoutoplossing (0,9% NaCl) tot 25 mg/mL. Warm bij 40\u201245 °C voor 1 uur. Bewaar 1 maand bij 4 °C.

3. ECG-systeemopstelling

1. Zorg ervoor dat u het systeem zo instelt dat er binnen 2 m geen geluid of trillingen zijn, omdat ECG-signalen in een muis gevoelig zijn voor het omgevingsgeluid en de beweging.
2. Bereid de hardware-installatie voor: een data-acquisitiesysteem, een bioversterker en een computer die is geïnstalleerd met een ECG-gegevensanalysesoftware.
   1. Sluit het data-acquisitiesysteem aan op het net (AC) via de voedingskabel.
   2. Sluit het gegevensverwervingssysteem aan op de computer via een USB-kabel.
   3. Sluit de signaaluitgang op het achterpaneel van de bioversterker aan op een analoge ingang op het voorpaneel van het data-acquisitiesysteem via een kabel.
   4. Sluit de I²C-uitgang van het data-acquisitiesysteem aan op de I²C-ingang van de bioversterker met behulp van de I²C-kabel.
   5. Sluit de 3-lead bioversterkerkabel aan op de 6-pins ingangsaansluiting op het voorpaneel van de bioversterker.
   6. Schakel het gegevensacquisitiesysteem in met de schakelaar op het achterpaneel.
      OPMERKING: In het kort worden de signalen versterkt door middel van een bioversterker en opgenomen met behulp van een geautomatiseerd data-acquisitie- en analysesysteem met de volgende kanaalinstellingen: sampling rate van 2 k/s, bereik van 20 mV en low-pass filterinstelling van 200 Hz.
3. Open het analysesoftwareprogramma en stel het in voor ECG-gegevensverwerving.
   1. Ga naar Setup | Kanaalinstellingen. Stel de steekproefsnelheid in op 2 k/s. Stel het bereik in op 20 mV. Stel de ingangsversterker in op 200 Hz Low Pass.
   2. Ga naar ECG-analyse | ECG-instellingen. Kies 'Muis' in de instellingen voor voorinstelling van detectie en analyse.
   3. Kies er in het middelingspaneel voor om N (bijvoorbeeld 4 slagen of 60 s) opeenvolgende hartcycli te herenigen tot één gemiddeld signaal voor gemiddelde weergave en tabelweergave.
   4. Selecteer in het QTc-paneel de methode "Bazett", die wordt gedefinieerd als de hartslaggecorrigeerde waarde van het QT-interval: QTc = QT / (RR/100)^0,5, RR-interval = 60 / hartslag⁷.

4. ECG-meting

1. Plaats een muis op een precisieschaal en noteren zijn gewicht.
2. Induceer anesthesie in de muis door intraperitoneale (i.p.) injectie van een werkende oplossing van tribromoethanol (18 mL werkoplossing per kg lichaamsgewicht (b.w.)).
3. Plaats een verdoofde muis in supine positie. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is (minder dan 2 min).
4. Steek de elektroden met acupunctuurnaalden onderhuids in de rechter- en linkervoorpoten en de linker achterpoot volgens het lead II ECG-schema en bevestig ze met tape (figuur 1). Zorg ervoor dat de diepte en positie van ingebrachte elektroden consistent zijn tijdens de experimenten.
5. Sluit de andere uiteinden van de elektroden aan door ze te klikken in de drie snap-connectors aan de andere kant van de looddraden van de 3-lead bioversterkerkabel.
6. Injecteer drugs (i.p.) 3 min nadat de verdoving is geleverd (figuur 2).
7. Begin met het opnemen van de ECG 10 min na het injecteren van verdovingsmiddelen. Zodra de opname is voltooid, gebruik maken van de ECG-gegevens van 12 tot 17 min na injectie van verdoving voor analyse.
8. Verwijder aan het einde van de ECG-opnamesessie de elektroden voorzichtig.

5. ECG-gegevensanalyse

1. Ga naar ECG-analyse | Gemiddeld Bekijk en zorg ervoor dat de software het begin en einde van de P-golf, QRS-complex en T-golf correct identificeert in individuele beats. Indien nodig is handmatige correctie van deze golven en intervallen mogelijk door misplaatste cursors naar de juiste posities te verplaatsen.
   OPMERKING: Zoals afgebeeld in figuur 3A,het PR-interval overspant het begin van de P-golf aan die van het QRS-complex (meestal ontbreekt Q-golf in een muis ECG). De QRS-duur strekt zich uit van het begin van de Q-golf (voornamelijk een R-golf in een muis ECG) tot het einde van de S-golf. Het QT-interval bestaat uit het begin van de Q-golf (meestal de R-golf in een muis ECG) tot het einde van de T-golf. Let op de kortere duur en afwezigheid van een Q-golf- en ST-segment in het muis ECG ten opzichte van de menselijke ECG⁸.
2. Ga naar ECG-analyse | Tabelweergave en selecteer de correct geïdentificeerde ECG-gegevens door afzonderlijke beats te controleren in het venster Gemiddelde weergave.
   OPMERKING: Figuur 3 toont verschillende voorbeelden van werkelijke muis ECG-signalen. Figuur 3A vertegenwoordigt een normaal wild-type signaal dat correct is geïdentificeerd met betrekking tot P golf, QRS complex, en T golf. Geautomatiseerde selectie van PQRS-golven kan foutieve misplaatsingen oplopen, zoals in figuur 3B een normaal wild-type signaal dat het begin van de P-golf misplaatst. In figuur 3C een ECG-signaal dat het einde van het QRS-complex misplaceert, wat resulteert in een overschatting van de QRS-duur. In figuur 3D een ECG-signaal dat het einde van het QRS-complex misplaceseert, wat resulteert in onderschatting van het QRS-complex als gevolg van de dubbelzinnige T-golf en figuur 3E een ECG-signaal met een niet-identificeerbare T-golf. Zonder uitsluiting of handmatige correcties kunnen PQRS-intervallen worden overschreden of onderschat. Zorg ervoor dat u de ECG-signalen selecteert die correct zijn geïdentificeerd en de signalen die de doelpieken niet missen. Bijgevolg zijn dergelijke gevallen, waaronder B, C, D en E (figuur 3), uitgesloten bij een nauwkeurige schatting van ECG-parameters in het algemeen.
3. Selecteer de ECG-gegevens die van belang zijn in tabelweergave en kopieer/plak ze naar een spreadsheetbestand.

6. Statistische analyse

1. Voer de statistische analyse uit met behulp van een statistiekenprogramma. Analyseer de gegevens met de experimentele omstandigheden verblind. Voer student t-testen Mann-Whitney U-test voor 2-groep vergelijkingen. De getallen in elke figuur geven het aantal muizen aan dat voor elke groep wordt gebruikt. Rapporteer de resultaten als gemiddelde ± SEM.
2. Beschouw verschillen met p < 0,05 per U-test als statistisch significant: *, p < 0,05; **, p < 0,01; en ***, p < 0,005 ten opzichte van de respectievelijke besturingselementen.

Resultaten

Farmacologische experimenten

Om te bepalen of onze niet-invasieve ECG-meting de invloed van autonome modulatie op het cardiale geleidingssysteem weerspiegelt, werden normale Balb/c-muizen uitgedaagd met agonisten en antagonisten van het autonome zenuwstelsel (ANS). Atropine en carbachol werden gebruikt om parasympathische autonome blokkade en stimulatie effect, respectievelijk, terwijl propranolol en isoprenaline werden toegediend aan sympathische autonome blokkade en stimulat...

Discussie

Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. De omgeving moet vrij zijn van lawaai en trillingen. De ECG-elektroden moeten stabiel en consequent onder de huid worden ingebracht, waarvan de invoegstap voorlopige experimenten vereist totdat de onderzoeker technisch ervaren is. Verder moet de verdoving op de juiste manier worden bereid en opgeslagen en bij de juiste dosis worden gebruikt. Ten slotte moeten de PQRS-golven zich op de juiste manier in afzonderlijke ECG-beats in het venster Gemiddelde weergave bevind...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c muizen, mannelijk, leeftijd 7-9 weken
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathisch antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australië	ML132	bio versterker
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathisch agonist
Elektroden met acupuncturnaalden	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0,20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathisch agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australië		data-analysesoftware
Muizenvoer	LabDiet, St. Louis, MO, VS	5L79	Muizenvoer
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australië		data-acquisitiesysteem
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathisch antagonist
SPSS Statistics programma	SPSS	SPSS 25.0	statistiekprogramma