Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.

Samenvatting

Er is een groeiende interesse in het gebruik van liposomen om verbindingen in vivo te leveren, met name voor gerichte behandelingsbenaderingen. Afhankelijk van de liposoomformulering kunnen liposomen bij voorkeur worden opgenomen door verschillende celtypen in het lichaam. Dit kan de werkzaamheid van het therapeutische deeltje beïnvloeden, omdat de progressie van verschillende ziekten weefsel- en celtypespecifiek is. In dit protocol presenteren we een methode voor het synthetiseren en fluorescerend labelen van liposomen met behulp van DSPC, cholesterol en PEG-2000 DSPE en de lipidekleurstof DiD als een fluorescerend label. Dit protocol presenteert ook een aanpak voor het in vivo afleveren van liposomen en het beoordelen van celspecifieke opname van liposomen met behulp van flowcytometrie. Deze benadering kan worden gebruikt om de soorten cellen te bepalen die liposomen opnemen en de verdeling en het aandeel van liposoomopname over celtypen en weefsels te kwantificeren. Hoewel niet vermeld in dit protocol, zullen aanvullende testen zoals immunofluorescentie en eencellige fluorescentiebeeldvorming op een cytometer alle bevindingen of conclusies versterken die worden gemaakt omdat ze een beoordeling van intracellulaire kleuring mogelijk maken. Protocollen moeten mogelijk ook worden aangepast, afhankelijk van het weefsel of de weefsels van belang.

Inleiding

Naarmate de interesse in het ontwikkelen van therapieën met behulp van nanodeeltjes medicijnafgifte groeit, moeten de methoden om deeltjesdistributie en -opname voor te bereiden en te beoordelen zich blijven ontwikkelen, uitbreiden en toegankelijk zijn voor de onderzoeksgemeenschap ^1,2. Dit protocol is ontwikkeld om de exacte celtypen te beoordelen die liposomen in vivo hebben opgenomen na een behandeling met DiD-gelabelde liposomen geladen met tesaglitazar, een peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR)-α/γ agonist ^3,4. In deze studies waren we in staat om te beoordelen welke celtypen direct werden beïnvloed door liposomale tesaglitazar-behandeling, de werkzaamheid van het richten op moieties en hypothesen te genereren om de behandelingsresultaten die we waarnamen te verklaren. Bovendien suggereren gevestigde biologische functies in een verscheidenheid aan celtypen dat fagocytische cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en leverspecifieke Kupffer-cellen de meeste liposomen ^5,6,7 opnemen. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat niet-klassieke fagocyten ook liposomen ^3,4 kunnen opnemen.

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde methode voor het oplossen van tesaglitazar, het bereiden van liposomen door omgekeerde fase verdamping en het gebruik van calciumacetaat als lokstof voor het op afstand laden van geneesmiddelen. De gepresenteerde methoden zijn toegankelijk voor veel laboratoria en missen moeilijk te verkrijgen materialen en stappen die hoge temperaturen vereisen. Het protocol produceert liposomen van grootte die optimaal zijn voor een verhoogde circulatie in vivo⁸. Bovendien, zoals samengevat door Su et al., zijn tot op heden methoden om in vivo liposoomverdeling en weefselopname te evalueren bestudeerd en diepgaand getest⁹. Positronemissietomografie (PET), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en fluorescentie moleculaire tomografie (FMT) methoden worden toegepast om weefselspecifieke biodistributie en opname te kwantificeren 9,10,11. Hoewel deze methoden zijn geoptimaliseerd om de detectie in vivo te maximaliseren, missen ze nog steeds de mogelijkheid om de opname van liposoomen in vivo bij cellulaire resolutie te kwantificeren. Het hier gepresenteerde protocol heeft tot doel aan deze behoefte te voldoen door het gebruik van flowcytometrie. Ten slotte werd voor dit protocol de cellulaire opname beperkt tot een paar weefsels, waaronder vetweefsel. Er is een groeiende hoeveelheid literatuur die het potentieel onderzoekt voor het gebruik van nanodeeltjes om therapieën te leveren in de setting van obesitas, dysmetabolisme en ontsteking 12,13,14,15,16,17. Als zodanig vonden we het belangrijk om een protocol te delen met effectieve methoden voor het verwerken en analyseren van vetweefsel - een van de weefsels die een belangrijke rol speelt bij deze pathologieën.

Protocol

Alle stappen in dit protocol zijn goedgekeurd door en volgen de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Virginia.

OPMERKING: Er zijn enkele belangrijke controles waarmee u rekening moet houden voor latere analysestappen, die zijn samengevat in tabel 1 en die moeten worden overwogen voorafgaand aan de toediening van liposoomen.

1. Bereiding van fluorescerend gelabelde liposomen, geladen met calciumacetaat en tesaglitazar

1. Combineer DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine), cholesterol, PEG-2000-DSPE en DiD. Combime hiervoor de DSPC, cholesterol en PEG-2000 DSPE met een massaverhouding van 2:1:1. Voeg DiD-lipidenkleurstof toe in een concentratie van 1 mg DiD per 1 ml liposomen (molaire verhouding van 46:1 DSPC:DiD).
   OPMERKING: DiD is een geaccepteerde afkorting voor 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'tetramethylindocarbocyanine kleurstof. Omdat het twee octadecyl "vette staarten" heeft van gelijke lengte als de DSPC die in deze formulering wordt gebruikt, moet het meestal in het lipidemembraan worden opgenomen. Lipidekleurstoffen zoals DiO, DiD en DiI worden routinematig gebruikt voor liposoomonderzoek⁸ en ze worden als niet-uitwisselbaar beschouwd¹⁸.
2. Gebruik een scintillatieflacon van 20 ml voor de omgekeerde fase-emulsie en het liposoompreparaat. Meng in deze injectieflacon een 2:1 ether-chloroformoplossing van lipiden met waterig calciumacetaat (Ca-acetaat, 1 M, pH 7,4). De verhouding tussen de organische en de waterige fase moet 4:1 zijn, bijvoorbeeld 4 ml organische fase en 1 ml waterige fase.
3. Emulgeer de ether-chloroform-oplossing van lipiden door sonicatie gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Bedien de sonicator op 20 KHz en 50% vermogen en gebruik een 1/2 in. sonde.
   OPMERKING: Houd de punt van de sonicatorsonde dichter bij de onderkant van de injectieflacon om schuimvorming te voorkomen. Raak het glas niet aan met de sondepunt tijdens het ultrasoonapparaat, het kan breken. Bovendien moet chloroform als co-oplosmiddel aan de ether worden toegevoegd: in aanwezigheid van cholesterol scheidt een emulsie met alleen ether zich snel, waardoor deze stap van de procedure onmogelijk wordt.
4. Plaats de injectieflacon met gehomogeniseerde water-in-olie-emulsie onmiddellijk op een roterende verdamper met een speciale adapter, manometermeter en een drukregelaarklep. De verdamper moet worden aangesloten op een vacuümleiding om de organische oplosmiddelen te verwijderen. Stel de rotatiesnelheid in op 100 tpm en het vacuüm op 0,5 atm en laat los als emulsieschuimvorming er overdreven uitziet. Nadat een gel zich vormt en verdwijnt, verhoogt u het vacuüm tot 0,9 atm.
   OPMERKING: Tijdens het verwijderen van vluchtige organische fasen moet het vacuümniveau geleidelijk worden aangepast om snel schuimen te voorkomen, omdat dit kan leiden tot inhoudsverlies van de injectieflacon in het lichaam van de roterende verdamper. Uiteindelijk, wanneer de ether en chloroform gedeeltelijk verdampen en de volumeverhouding tussen waterige en organische oplosmiddelfase dicht bij 1: 1 ligt, zal zich een gel vormen. De verdamping moet doorgaan totdat de gel verdwijnt en de resterende waterige media weer volledig vloeibaar zijn. Extra menging kan helpen de verwijdering van organische oplosmiddelen te versnellen. Dit kan worden bereikt door een polytetrafluorethyleenroerstaaf in de verdampingskolf te plaatsen om de convectie van de viskeuze gel tijdens roterende verdamping te verbeteren.
5. Filter de resulterende liposomen met behulp van rups-geëtste polycarbonaatmembranen om een homogene grootteverdeling te bereiken.
   1. Voer filtratie uit door de liposoom waterige dispersie meerdere keren heen en weer te laten gaan door een polycarbonaatfilter met 200 nm-poriën in een liposoomextruder uitgerust met twee gasdichte spuiten.
      OPMERKING: Kleinere spuiten hebben de voorkeur (bijv. 0,5 ml) omdat ze zorgen voor het genereren van voldoende druk voor filtratie. Met een hoog cholesterolgehalte in het liposoommembraan is een hoge temperatuur niet nodig en kan de procedure bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Een oneven aantal filtraties (bijv. 21) wordt uitgevoerd, zodat het resulterende materiaal vanaf het begin aan de andere kant van het filter terechtkomt en als het vooraf wordt gesteriliseerd, kan het steriele monster van gefilterde grootte aangepaste liposomen worden verzameld. De grootte van de resulterende liposomen ligt meestal dicht bij de geselecteerde filterporiegrootte. Twee filters kunnen worden gestapeld (in plaats van één) om fijnafstelling uit te voeren naar een lagere deeltjesgrootte.
   2. Controleer de grootteverdeling met behulp van dynamische laserlichtverstrooiing (DLS)^3,4.
      1. Voeg 1 tot 3 ml zoutoplossing toe aan een cuvette van 1 cm met vier transparante zijkanten. Voeg daar 10-01220 μL liposomen aan toe en meng voorzichtig. Plaats het monster in het apparaat en selecteer de volgende parameters om te meten: oplosmiddelviscositeit, brekingsindex, brekingsindex van lipiden. Klik op de knop Start . De metingen duren enkele minuten en bestaan uit 100 of meer runs.
6. Verwijder extern Ca-acetaat met behulp van een ontzoutende spinkolom. Voeg aan de helft van de batch waterige tesaglitazar toe in een HEPES-buffer van 10 mM (pH 7,4) en incubeer met mengen bij 37 °C gedurende 1 uur. Gebruik de tweede helft van de batch als een medicijnvrije controle liposoom formulering.
   OPMERKING: Breng de 2 ml ontzoutende spinkolom vooraf in evenwicht met 10 mM HEPES-buffer, pH 7,4, vóór gebruik. Om dit te doen, plaatst u 1 ml HEPES-buffer in de kolom en draait u gedurende 2 minuten in een centrifuge op 1000 x g . Verwijder de pass-through buffer en herhaal dit vier keer.
7. Verwijder niet-ingesloten tesaglitazar uit liposomen met behulp van een spinkolom van 2 ml en bepaal de concentratie van ingesloten geneesmiddelspectrofotometrisch.
8. Voeg niet meer dan 0,5 ml liposoommonster toe aan het droge kolomgelbed en wacht tot al het monster de gel binnenkomt. Centrifugeer onder precies dezelfde omstandigheden als eerder (1000 x g, 2 min) en verzamel het liposoommonster in de pass-through gezuiverd van kleine moleculaire massaverbindingen.
9. Kwantificeren van de uiteindelijke deeltjeskenmerken: deeltjesgrootte en -concentratie met behulp van DLS en zetapotentiaal met een gecombineerd DLS-elektroforetisch lichtverstrooiingssysteem (ELS) 3,4 in 10 mM HEPES-buffer pH ^7,4 en bij 25 °C.
   1. Net als bij stap 1.5.2, verdun liposoomdispersie in de meetbuffer (bijv. 10 μL liposomen per 1 ml bufferoplossing) in een U-vormige cuvette met behulp van een wegwerp Luer-spuit of een pipet met een snijpunt. Zorg ervoor dat er geen bellen in de "U" zijn, zodat er een ononderbroken oplossing is voor elektrische stroom.
   2. Plaats de cuvette in het apparaat (let op de voor- en achterkant van de cuvette, zodat de elektroden goed op het apparaat zijn aangesloten). Sluit de instrumentdeur; Hierna vindt de meting plaats (met meerdere herhalingen), onder controle van de geleidingssoftware.

2. Bereid liposomen voor voor in vivo toediening

1. Verdun in een bioveiligheidskast liposomen in steriele zoutoplossing tot de juiste concentratie in een eindvolume van 50 μL voor in vivo toediening.
   OPMERKING: In eerdere studies bevatte ons liposoompreparaat 2 mg / ml tesaglitazar, wat overeenkomt met ongeveer 4,89 μmol tesaglitazar / ml, en we dienden liposomen toe in een dosis van 1 μmol geneesmiddel / kg. Voor een muis van 40 g zouden we 8,2 μL liposomen tot een eindvolume van 50 μL in zoutoplossing brengen. Met behulp van DLS/ELS moet het aantal liposomen per volume-eenheid ook worden gekwantificeerd voor preparaten van met geneesmiddelen en voertuigen geladen liposomen om ervoor te zorgen dat een gelijk aantal voertuigliposomen per gram muisgewicht wordt toegediend in vergelijking met de liposomen met geneesmiddelen.
2. Laad de liposoomoplossing in een naald van 27 G in de bioveiligheidskast. Bewaar dit op kamertemperatuur om te voorkomen dat koude oplossing in de muis wordt geïnjecteerd.

3. Dien liposomen toe via retro-orbitale intraveneuze injectie

OPMERKING: Het is ook aangewezen om de intraveneuze injectie uit te voeren met andere methoden, zoals staartaderinjecties als dit de voorkeur heeft. Hoewel niet behandeld in dit protocol, zijn er gepubliceerde protocollen beschikbaar waarin deze methode^wordt uitgelegd.

1. Stel de werkruimte in voor het leveren van liposomen.
   1. Reinig de werkbank met 70% ethanol. Zorg ervoor dat u een ruimte selecteert die het gebruik van een isofluraan anesthesiesysteem toestaat.
   2. Zet een warming-pad aan en leg er een schoon maandverband of handdoek overheen om de muis op een schoon oppervlak te houden. Geef de pad voldoende tijd om op te warmen voordat u met muizen begint te werken.
   3. Stel het anesthesiesysteem zo in dat de kamer in de buurt is en de neuskegel zich op het verwarmingskussen bevindt.
      1. Zorg ervoor dat alle andere aspecten van het systeem klaar zijn (bijvoorbeeld, het isofluraanniveau is hoog genoeg in de verdamper, het houtskoolfilter is gewogen, de slang is correct aangesloten).
   4. Verzamel de andere materialen die nodig zijn voor dit gedeelte van het protocol: oogheelkundige glijmiddelgel, een lokaal verdovingsmiddel voor nabehandeling, steriele gaasjes.
2. Verdoof de muis met isofluraan in de inductiekamer. Zodra het niet meer reageert op een zachte voettik, brengt u de muis snel over naar de werkruimte terwijl u de sedatie door een neuskegel behoudt.
   OPMERKING: Het dier moet op 1,5% tot 2,5% isofluraan worden gehouden en worden beoordeeld op een geschikte diepte van anesthesie (via een gebrek aan respons op teenknijpen) voordat de procedure wordt voortgezet.
3. Verplaats de muis naar één kant voor liposoomtoediening. Omdat de muis niet zal knipperen tijdens het verdoven, brengt u een kleine hoeveelheid oogheelkundig glijmiddel aan op beide ogen om ze gehydrateerd te houden tijdens de rest van de procedure.
4. Druk zachtjes op de huid boven en onder het blootgestelde oog. Het oog moet boven het vlak van het gezicht uitstijgen.
5. Steek voorzichtig de punt van de naald bij de mediale canthus, zorg ervoor dat de naald zich onder het oog bevindt en raak deze niet aan. Zodra de naald onder het oog is ingebracht, injecteert u de liposomen langzaam in de retro-orbitale ruimte. Bij het terugtrekken van de naald kan het nodig zijn om de oogleden een paar seconden te sluiten om hemostase te bereiken.
   1. Als de naald niet ver genoeg wordt ingebracht, kan de oplossing rond het oog ontstaan. Stop onmiddellijk met injecteren als dit wordt gezien en plaats de naald opnieuw.
6. Breng een lokaal verdovingsmiddel, zoals proparacaïne, aan op het oog om pijn en ongemak na de procedure te voorkomen.
7. Houd de muis op een opwarmkussen en controleer totdat deze ontwaakt om ervoor te zorgen dat hij goed is en de juiste lichaamstemperatuur behoudt.
8. Breng de muis terug naar zijn kooi en zijn normale woonomgeving totdat het moment van interesse arriveert.
   OPMERKING: Dit moet worden gedaan in overeenstemming met de lokale IACUC-richtlijnen.

4. Bereid materialen voor op de weefseloogst, weefselverwerking en flowcytometriekleuring

1. Bereid oplossingen voor de oogst, verwerking en kleuring (secties 5\u20127): fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-Heparine, HEPES Buffer, 2 mg/ml Collagenase type I, AKC lysis buffer, FACS buffer, PBS, Fixatie buffer (Tabel 2). Houd alle oplossingen behalve de fixatiebuffer op 4 °C of op ijs tijdens de procedure.
2. Bereid buizen voor met buffers en andere materialen voor het oogsten en verwerken van weefsels.
   1. Voeg voor bloed van elke muis 10 μL 0,5 M EDTA toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml voor het verzamelen van het bloed. De EDTA voorkomt dat het bloed stolt. Een spuit van 1 ml met een naald van 25 G en een conische buis van 15 ml zijn ook nodig.
   2. Verzamel voor de milt één microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml met 1 ml HEPES-buffer, een spuit van 1 ml, twee conische buizen van 50 ml en twee filters van 70 μm per milt.
   3. Verzamel voor elk vetweefseldepot een polyethyleen injectieflacon van 20 ml met 1,5 ml HEPES-buffer voor het fijnhakken van het weefsel, een conische buis van 50 ml en een filter van 70 μm per vetweefseltype per muis.
3. Bereid de werkruimte voor op de oogst.
   1. Reinig de bankruimte met 70% ethanol. Maak een rubberen bakje klaar voor het vastzetten van de muis tijdens de oogst door hem schoon te maken met 70% ethanol en af te dekken met een absorberend kussen of papieren handdoeken. Zorg ervoor dat er minstens 5 pinnen beschikbaar zijn om mee te werken.
   2. Vul een spuit van 10 ml met PBS-heparine en bevestig deze op een naald van 25 G voor perfusie.
   3. Verzamel gereedschappen en materialen om te gebruiken tijdens de oogst. Tangen (twee paar), scharen, papieren handdoeken, pluisvrije doekjes, de microcentrifugebuis(en) met EDTA, de microcentrifugebuis(en) met HEPES-buffer en de polyethyleen injectieflacon(s) met HEPES-buffer zijn nodig.

5. Oogst de weefsels

1. Euthanaseer de muis door CO 2-verstikking. Voer geen cervicale dislocatie uit, omdat dit effectieve bloedafname en weefselperfusie in latere stappen kan voorkomen.
2. Op een schoongemaakte bank met voldoende werkruimte en verlichting om de muis goed te zien, plaatst u een rubberen snijbak, een emmer ijs voor het opslaan van monsters en een spuitfles met 70% ethanol. Spray de muis in met 70% ethanol om vervuiling te verminderen en de verspreiding van het haar onder controle te houden. Plaats de muis op zijn rug op de rubberen bak en pin zijn poten gespreid weg van zijn lichaam.
3. Om je voor te bereiden op het verzamelen van bloed, maak je voorzichtig een incisie in de huid aan de rand van het caudale uiteinde van de ribbenkast van de muis. Knip een kleine, rechte lijn omhoog naar de kop van de muis (ongeveer 1 cm) totdat de borstspieren bloot komen te liggen.
   1. Maak op de eerste incisieplaats twee kleine sneden loodrecht op de lijn naar het hoofd. Snijd vervolgens voorzichtig de borstspier aan één kant van de ribbenkast in het blootgestelde gebied weg. Dit zorgt voor een betere toegang en visualisatie van waar de naald moet worden ingebracht.
   2. Om bloed te verzamelen, steekt u de naald tussen de derde en vierde ribben aan de kant waar de spier is verwijderd. Omdat het hart van de muis zich in het midden van de borstholte bevindt, moet u de naald zo dicht mogelijk bij de middellijn van de ribbenkast houden. Eenmaal ingebracht, trekt u voorzichtig aan de spuit om te beginnen met het verzamelen van bloed.
   3. Eenmaal verzameld, breng het bloed over naar de voorbereide microcentrifugebuis met EDTA en bewaar op ijs.
      OPMERKING: Als ongeveer 100 μL volume wordt opgetrokken en er geen bloed in de spuit komt, probeer dan de spuit naar rechts of links te draaien voor het geval de naaldopening tegen de wand van het hart wordt gedrukt. Als dit niet helpt, beweeg de naald dan langzaam verder in de borstholte of begin met verwijderen. Als het bloed zich op dit punt in de spuit begint te verzamelen, blijft u de spuit langzaam terugtrekken. Overweeg om de spuit en naald te draaien voor een succesvolle extractie. Ten slotte, als er geen bloed wordt verzameld, verwijdert u de naald omdat deze mogelijk het hart heeft gemist. Probeer de naald opnieuw in te brengen en het bovengenoemde proces opnieuw te herhalen.
4. Vervolgens, om de muis te doordrenken, opent u de borstholte om toegang te krijgen tot het hart.
   1. Om dit te doen, snijdt u de huid langs het uiteinde van de ribbenkast aan elke kant naar de kant van de muis. Gebruik vervolgens de tang om het borstbeen weg te houden van het werkoppervlak. Maak een kleine, ondiepe incisie net onder het uiteinde van het borstbeen om door de peritoneale holte te snijden. Snijd langs het peritoneale membraan langs het uiteinde van de ribbenkast aan elk van de zijkanten van de muis. Dit moet de lever en galblaas blootleggen. Pas op dat u niet in een van deze weefsels snijdt.
   2. Maak vervolgens een kleine, ondiepe snede in het middenrif, craniaal naar de lever. Snijd vervolgens het middenrif langs de rand van de ribbenkast om de borstholte te openen. Zorg ervoor dat u geen van de organen in de borstholte snijdt.
   3. Maak twee sneden langs de ribbenkast naar het hoofd op ongeveer 2-3 mm van de middellijn van de muis en ongeveer 0,75 cm lang.
      OPMERKING: Als ze te hoog worden gesneden, worden de slagaders aan de bovenkant van de ribbenkast doorgesneden. Dit zal de werkzaamheid van perfusie verstoren.
   4. Til het middelste stuk van de ribbenkast terug om de borstholte bloot te leggen. Verplaats vet of weefsel weg om toegang te krijgen tot het hart.
   5. Maak een kleine snee in het rechteratrium van het hart van de muis om een opening te maken waardoor het bloed naar buiten kan worden geduwd.
   6. Gebruik een spuit van 10 ml PBS-heparine om de naald in de linkerkamer van het hart van de muis te steken.
   7. Begin voorzichtig PBS zo langzaam mogelijk in het hart te duwen.
      OPMERKING: Er moet bloed worden waargenomen dat uit de rechterboezems komt en de borstholte vult. Zorg ervoor dat u het hart op zijn fysiologische locatie houdt om te voorkomen dat de stroom van PBS-heparine van het hart door de aorta wordt geremd.
   8. Zodra alle 10 ml PBS-heparine door de muis is geperfuseerd, gooit u de spuit en naald weg en verwijdert u overtollig bloed en PBS-heparine uit de borstholte met behulp van papieren handdoeken of pluisvrije doekjes.
5. Om vervolgens te beginnen met het extraheren van weefsels, snijdt u de huid en het peritoneale membraan naar de staart van de muis om de peritoneale holte te openen.
6. Haal eerst het inguinale vetweefselkussen uit elke kant van de muis.
   OPMERKING: Lees dit proces zorgvuldig door: zorg ervoor dat u de inguinale lymfeklier uit elk depot haalt om te voorkomen dat de cellulaire samenstelling van het vetweefsel in de resultaten scheeftrekt.
   1. Houd met behulp van een tweede set tangen het peritoneale membraan vast met één set tangen en de rand van de huid bedekt boven het membraan aan die kant met de andere tang. Trek de huid voorzichtig weg van het peritoneale membraan om deze lagen van elkaar te scheiden. Zoek naar het inguinale vetweefseldepot langs de huid. Pin de buitenrand van de huid vast om beter toegang te krijgen tot het vetdepot.
   2. Lokaliseer voorafgaand aan de extractie de inguinale lymfeklier in het midden van het vetdepot en verwijder deze indien nodig met een tang en een schaar.
      OPMERKING: Zoek indien mogelijk de drie grotere slagaders die van de buitenranden van het depot naar het midden lopen. De lymfeklier bevindt zich rond waar deze slagaders samenkomen.
   3. Nadat de lymfeklier is verwijderd, houdt u voorzichtig het uiteinde van het vetdepot het dichtst bij het vastgepinde punt met de tang en begint u kleine sneetjes te maken bij het bindmembraan tussen het vetweefsel en de huid. Til het vetweefsel weg van de huid terwijl u snijwonden maakt om betere toegang tot het membraan te krijgen en ervoor te zorgen dat het hele depot wordt geëxtraheerd.
   4. Plaats het vetdepot in een voorbereide polyethyleen injectieflacon met HEPES-buffer op ijs om het weefsel levensvatbaar te houden tijdens de rest van de oogst.
   5. Herhaal dit proces aan de andere kant van de muis om beide depots te extraheren. Depots kunnen samen of afzonderlijk worden verteerd en verwerkt. Als elk depot afzonderlijk moet worden verwerkt, moeten er meer buizen worden voorbereid.
7. Haal vervolgens de epididymale vetdepots uit het caudale uiteinde van de peritoneale holte. Trek met een tang voorzichtig het eerste epididymale vetdepot weg van het dorsale uiteinde van de muis en lokaliseer de bijbal en zaadleider die aan dit depot zijn bevestigd.
   OPMERKING: Er zijn twee epididymale vetdepots: één bevestigd aan elke bijbal en zaadleider.
   1. Snijd voorzichtig tussen het vetdepot en de bijbal en zaadleider om het vet van deze andere weefsels te scheiden. Plaats het vetdepot in een polyethyleen injectieflacon met HEPES-buffer op ijs om het weefsel levensvatbaar te houden tijdens de rest van de oogst.
8. Extraheer ten slotte de milt, die zich links van de maag in de buurt van het middenrif bevindt. Trek met een tang de maag voorzichtig naar het midden van de peritoneale holte om de milt bloot te leggen.
   1. Houd het ene uiteinde van de milt voorzichtig vast en trek het iets weg van de maag. Snijd het membraan tussen de milt en het aangrenzende weefsel totdat het orgaan is losgemaakt. Plaats de milt in de voorbereide microcentrifugebuis met HEPES-buffer en bewaar op ijs.
9. Voordat u tissues verwerkt of tissues van de volgende muis oogst, gooit u het karkas en eventuele bevuilde papieren handdoeken of pads weg. Veeg ook gereedschappen af.
   OPMERKING: Als er meerdere muizen zijn, herhaalt u deze oogststappen voor elke muis voordat u doorgaat naar de volgende verwerkingsstap. Als een controlemuis /muizen is opgenomen, overweeg dan om deze te oogsten voorafgaand aan met liposomen behandelde muizen om besmetting te voorkomen.

6. Procesweefsels

OPMERKING: Aangezien het vetweefsel een lange incubatie van de spijsvertering heeft, wordt aanbevolen om eerst met dat proces te beginnen en te werken aan het verwerken van het bloed en de milt tijdens de verteringsperiode.

1. Hak eerst het vetweefsel fijn en verteer het. Gebruik een of twee schaartjes om het vetweefsel in elke polyethyleen injectieflacon te hakken totdat het weefsel in kleine stukjes van minder dan 0,5 mm groot is. Dit zorgt voor een efficiëntere vertering.
   1. Zodra de weefsels in alle injectieflacons zijn gehakt, voegt u 1,5 ml collagenasebuffer toe aan elke injectieflacon. Plaats de injectieflacons in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 150 tpm. Incubeer gedurende 30 tot 45 min.
      OPMERKING: Als de vetweefsels bijzonder groot zijn, overweeg dan om nog eens 0,5 ml tot 1,5 ml HEPES-buffer en een gelijk volume collagenasebuffer aan de injectieflacon (s) toe te voegen om ervoor te zorgen dat weefsels volledig ondergedompeld zijn en voldoende enzym aanwezig is. De uiteindelijke concentratie collagenase type I bij de spijsvertering moet 1 mg/ml zijn, ongeacht het uiteindelijke volume van de oplossing. Bovendien kunnen, als er geen schudincubator beschikbaar is, monsters in een waterbad worden geplaatst dat wordt verwarmd tot 37 °C. Schud de monsters voorzichtig om de 5 minuten om de spijsvertering te mengen en opnieuw te suspenderen.
   2. Controleer de monsters op 30 min. Gebruik een pipet van 1 ml om het monster op en neer te pijpen. Als de weefselstukken nog steeds te groot zijn om gemakkelijk te pipetteren, breng de monsters dan nog eens 15 minuten terug naar de couveuse.
   3. Zodra de monsters volledig zijn verteerd, blijft u het monster nog eens 10 keer op en neer pipetten om ervoor te zorgen dat er een eencellige suspensie is gemaakt.
      OPMERKING: (Optioneel) Controleer de monsters op 30 min. Gebruik een pipet van 1 ml om het monster op en neer te pijpen. Als de weefselstukken nog steeds te groot zijn om gemakkelijk te pipetteren, breng de monsters dan nog eens 15 minuten terug naar de couveuse.
   4. Pipetteer de celsuspensie door een filter van 70 μm in een conische buis van 50 ml. Voeg 5 ml FACS-buffer toe aan de lege injectieflacon om de injectieflacon uit te spoelen. Breng deze wasbuffer door het filter om toe te voegen aan de celsuspensie.
   5. Bewaar monsters op ijs terwijl andere worden verwerkt. Zodra alle monsters zijn gefilterd, draait u ze gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C.
   6. Verwijder het adipocytensupernatant door aspiratie en verwijder vervolgens voorzichtig het infranatant tussen het adipocytensupernatant en de pellet door aspiratie om de stromaal-vasculaire fractie (SVF) pellet te verlaten.
   7. Resuspendeer deze pellet in 1 ml FACS-buffer en breng over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml. Aliquote cellen nu indien gewenst of nodig. Blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring.
      OPMERKING: Als de verteerde vetdepots groot waren, overweeg dan om slechts 50% of 25% van het monster te gebruiken voor flowcytometrische kleuring en analyse. Bovendien, als fluorescentie-minus-één (FMO) controles of aanvullende controles voor flowcytometrie-analyse (tabel 1) nodig zijn, zorg er dan voor dat u extra monster in een aparte buis plaatst voor verwerking. FMO's worden gebruikt om onderscheid te maken tussen negatief en positief signaal voor een individueel fluorofoor-geconjugeerd antilichaam binnen het anders complete panel dat in het experiment wordt gebruikt.
2. Ten tweede, verwerk het bloed.
   1. Breng 50 μL bloed over in een conische buis van 15 ml.
   2. Voeg 1 ml AKC-lysisbuffer toe aan elke buis en pipet op en neer om een eencellige suspensie te bereiken. Voeg een extra 4 ml AKC-lysisbuffer toe aan elke buis en incubeer gedurende 5-01210 minuten. Als er een shaker of rotator beschikbaar is, sluit u de buisdoppen goed af en plaatst u de buizen op een van deze om het mengen te verbeteren.
   3. Voeg 5 ml FACS-buffer toe om het lysisproces te blussen en draai de monsters gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en controleer de pellet. Als het nog steeds vrij rood is, herhaal dan het lysisproces. Anders resuspendeert u de pellets in 1 ml FACS-buffer en brengt u over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml. Blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring.
3. Verwerk ten slotte de milt. Breng de milt over op een filter van 70 μm over een conische buis van 50 ml. Was het weefsel met 1 ml FACS-buffer en pureer vervolgens de milt door het filter met behulp van het zuigeruiteinde van een spuit van 1 ml. Was tijdens het maischproces de cellen in de conische buis van 50 ml met behulp van meer FACS-buffer. Het uiteindelijke volume in de conische buis moet 10 ml zijn.
   1. Draai de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspensie in 1 ml AKC-lysisbuffer. Voeg een extra 4 ml AKC-lysisbuffer toe en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 5 ml FACS-buffer toe om het lysisproces te blussen en draai de monsters gedurende 5 minuten op 300 x g bij 4 °C.
   2. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 1 ml FACS-buffer. Breng de suspensie door een tweede, schoon filter van 70 μm over in een conische buis van 50 ml. Voeg 4 ml FACS-buffer toe om de originele buis uit te spoelen en breng de buffer door het filter over voor een eindvolume van 5 ml.
   3. Breng 50 μL van de celsuspensie over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml en blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring. Extra aliquots kunnen worden overgebracht naar buizen als er meer gewenst of nodig zijn.
      OPMERKING: Splenocyten zijn uitstekende cellen om te gebruiken voor een levende / dode enkele vlek. Overweeg een extra aliquot over te dragen voor dit besturingselement.

7. Kleurcellen uit weefsels voor flowcytometrie

1. Spin genoteerde monsters af bij 400 x g, 4 °C gedurende 5 minuten.
2. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters in 50 μL Fc Block (verdund) (tabel 2). Incubeer op ijs gedurende 5 min.
3. Voeg 50 μL 2x antilichaammengsel (tabel 3) toe aan elk monster. Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
   OPMERKING: Eventuele enkele vlekken mogen NIET worden gekleurd met deze antilichaammix. Als FMO's moeten worden gebruikt, moeten FMO-antilichaammengsels bovendien afzonderlijk worden bereid.
4. Was monsters met 1 ml PBS en draai op 400 x g, 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 200 μl levensvatbaarheidsvlek (tabel 3). Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
   OPMERKING: Vergeet niet om cellen te kleuren die tijdens deze stap zijn gereserveerd voor een Live / Dead enkele vlek.
5. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters (behalve levende/dode enkele vlek) in 50 μl fixatiemedium (reagens A) om monsters te fixeren. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 min.
   1. Resuspendeer de Live/Dead enkele vlek in 100 μL van 2% PFA. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 min.
   2. Was het monster met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters in 250 tot 500 μL FACS-buffer. Bewaren bij 4 °C totdat monsters op de flowcytometer kunnen worden uitgevoerd.
6. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie monsters in 50 μL permeabilisatiemedium (reagens B) plus antilichaam(en) tegen intracellulaire eiwitten. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten.
7. Was de monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 100 μL 2% paraformaldehyde (PFA). Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 min.
8. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 250 tot 500 μL FACS-buffer. Bewaren bij 4 °C totdat monsters op de flowcytometer kunnen worden uitgevoerd.

Resultaten

Liposoom productie

De resultaten die hier zijn gepubliceerd, zijn vergelijkbaar met die in ons eerder gepubliceerde werk ^3,4,20. Met behulp van het hier gepresenteerde protocol verwachten we liposomen van ongeveer 150-150-160 nm groot te produceren. DLS toont een gemiddelde liposoomdiameter van 163,2 nm en een zetapotentiaal van -19,2 mV (figuur 1A). Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) beeldvorming onthult circulaire liposomen (figuur 1B) en het DLS-diagram onthult een relatief kleine standaardafwijking van de gemiddelde diameter (figuur 1C).

Positieve liposoombinding vereist een met PBS behandelde controle

Eerdere studies van onze groep die dit protocol gebruikten, onderzochten welke celsubsets in vetweefsel SVF, milt en bloed gebonden aan liposomen na een week in vivo toediening ^3,4. Met behulp van een met PBS behandelde muis werden peritoneale holte- en miltcellen gekleurd met hetzelfde antilichaampaneel dat werd gebruikt op monsters van met liposomen behandelde muizen. Weefsels werden geoogst na een week van behandelingen (figuur 2A). De monsters van de met PBS behandelde muis dienden als een DiD FMO waarmee positieve DiD-poorten konden worden gemaakt (figuur 2B,C). Een positieve poort kan worden gemaakt met behulp van DiD-positief signaal, maar monsters zonder DiD-signaal moeten ook worden gebruikt om te controleren of de positieve poort geen DiD-negatieve monsters bevat.

Titraties zijn nodig om fluorescentiesignalen te optimaliseren

Voorafgaand aan het uitvoeren van een volledig experiment moeten verschillende omstandigheden, waaronder de concentratie van fluorescerend geconjugeerde antilichamen die worden gebruikt tijdens celkleuring en van lipidekleurstof die wordt gebruikt tijdens liposoombereiding, worden geoptimaliseerd. Flowcytometers hebben een bovengrens van detectie voor fluorescentie-intensiteit, dus te veel kleurstof opgenomen in de liposomen zal leiden tot niet-kwantificeerbare niveaus van DiD-signaal in monsters die door de cytometer lopen. Bovendien kan te veel DiD in de liposomen leiden tot hoge niveaus van niet-specifieke kleurstofoverdracht, wat de cellulaire opnameresultaten kan vertekenen. Figuur 3 rapporteert resultaten van een experiment waarbij concentraties lipidekleurstof werden getitreerd om de concentratie te identificeren die een optimaal signaal zou produceren binnen het detectiebereik van de gebruikte flowcytometer. Dit werd uitgevoerd op de weefsels die van belang waren voor het laatste experiment: bloed (figuur 3A), inguinaal vet SVF (figuur 3B) en epididymaal vet SVF (figuur 3C). De voor de test geselecteerde concentraties waren 10 mg DiD (Hoog, rood), 1 mg DiD (Midden, blauw) of 0,1 mg DiD (Laag, grijs) per 1 ml liposomen. De hoogste concentratie die in de liposomen werd gebruikt, was te hoog en overtrof het kwantificeerbare bereik van de cytometer in alle drie de weefsels (figuur 3A\u2012C, rood). De laagste concentratie DiD vertoonde enig signaal (figuur 3 A\u2012C, grijs), maar een duidelijke populatie buiten de met PBS behandelde cellen (figuur 3A\u2012C, zwart) werd niet waargenomen. Bij kwantificering toonde het rekenkundig gemiddelde van de DiD MFI voor elk weefsel en elke concentratie een duidelijk onderscheid tussen PBS-controles en de middelste concentratie van DiD (figuur 3D). Dus, zoals aangegeven in het protocol, selecteerden we de middelste concentratie (figuur 3, blauw) om te gebruiken in ons liposoompreparaat.

Het gebruik van multi-antilichaampaneel maakt identificatie van liposoomopname door verschillende celsubsets mogelijk

Met behulp van het paneel in tabel 3 werden cellen gekleurd met antilichamen tegen markers voor macrofagen, B-cellen, T-cellen, dendritische cellen, monocyten en endotheelcellen (figuur 4). Voor elk weefseltype zijn iets andere gatingstrategieën vereist, maar de meeste van dezelfde celtypen kunnen in elk type worden geïdentificeerd. Enkele uitzonderingen zijn endotheelcellen, die normaal niet in het bloed worden aangetroffen, en monocyten, die meestal vaker in het bloed voorkomen dan andere weefsels. Zodra populaties zijn geïdentificeerd, kan de totale grootte van elke celpopulatie en de frequentie waarmee ze DiD ⁺ zijn, worden gekwantificeerd. Verdere berekeningen kunnen worden uitgevoerd om de DiD + -populatie te karakteriseren: welk percentage van DiD ⁺ -cellen zijn macrofagen, endotheelcellen, enz. Let op, dit zijn voorbeelden van gatingstrategieën, maar niet de enige manier om de monsters te analyseren. De analyse wordt bepaald door het geselecteerde panel en de beschikbare flowcytometer(s).

Figuur 1: Voorbeeldkenmerken van geprepareerde liposomen.
(A) De grootte en het zeta-potentieel zijn gemeten zoals hierboven beschreven en zijn in tabelvorm gerapporteerd. Elke parameter wordt gepresenteerd als het gemiddelde ± de standaarddeviatie. (B) Cryo-EM werd gebruikt om de geprepareerde liposomen in beeld te brengen. De witte schaalbalk is 50 nm lang. (C) DLS werd gebruikt om een histogram van de diameter van liposomen in dit preparaat te genereren. Deze figuur is overgenomen uit Osinski et ^al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve DiD-kleuring van met PBS of liposoom behandelde muizen.
(A) Experimenteel schema voor PBS- en liposoombehandelingen. PBS of liposomen werden in de loop van een week drie keer geïnjecteerd. Weefsels werden geoogst op dag 8 van de behandeling. (B, C) Representatieve stromingsplots onthullen positieve DiD-kleuring in liposoom-behandelde (C), maar niet PBS-behandelde (B) muizen. FSC, voorwaartse verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Titratie van DiD in liposomen.
Liposomen werden bereid met drie verschillende concentraties DiD en geïnjecteerd in muizen. Grijs geeft de lage concentratie aan bij 0,1 mg DiD per 1 ml liposomen, blauw geeft de middelste concentratie aan bij 1 mg DiD/ml liposomen en rood geeft de hoge concentratie aan bij 10 mg DiD/ml liposomen. Een met PBS behandelde muis werd gebruikt als negatieve controle (zwart). Bloed (A, cirkel), inguinaal vet (B, triange) en epididymaal vet (C, vierkant) werden 24 uur na injectie geoogst en verwerkt om een eencellige suspensie te isoleren. Deze monsters werden uitgevoerd op een flowcytometer tot het niveau van detecteerbare DiD. Weefselspecifieke histogrammen met overlays van elke behandelingsgroep worden gepresenteerd om de fluorescentie-intensiteit per concentratie (A\u2012C) aan te tonen. Het rekenkundig gemiddelde van DiD werd ook gekwantificeerd voor elk weefsel en elke concentratie en uitgezet (D). SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve flowcytometrie-analyse van celsubsets in vetweefsel SVF, bloed en milt.
(A\u2012C) Schematische representatie van gatingstrategie om celsubsets en DiD⁺ -cellen in vet-SVF (A), milt (B) en bloed (C) te identificeren. Afkortingen: FSC = forward scatter; LD = levend/dood; L-DC's = lymfoïde dendritische cellen; M-DC's = myeloïde dendritische cellen; SSC = zijverstrooiing. Deze figuur is overgenomen uit Osinski et ^al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beheersen	Doel
Muis behandeld met PBS of zoutoplossing	Gebruik de cellen van deze muis voor de volgende flowcytometriecontroles:
	1. Onbevlekte cellen
	2. Levende/dode enkele vlek
	3. Cellen gekleurd met het volledige paneel, maar missen de liposoomfluorescentie om het positieve liposoomsignaal tijdens de analyse te bepalen
	Deze muis/muizen zullen ook worden gebruikt om te bepalen of liposomen in vivo effecten hebben, omdat u in uw experiment een niet-liposoomcontrole zult hebben.
Onbelaste liposomen	Als u een verbinding in uw liposomen laadt, moet een deel van uw liposoombatch worden gesynthetiseerd zonder de verbinding. Dit verklaart alleen eventuele in vivo effecten van de liposomen.
DiD alleen	Omdat DiD ook kan worden opgenomen door celmembranen, zal het toewijzen van sommige muizen om vrije kleurstof te ontvangen in een hoeveelheid die gelijk is aan die in de liposomen, helpen rekening te houden met eventuele achtergrondmembraankleuring.
Fluorescentie-minus-één (FMO) controles	Dit zijn cellen die gekleurd zijn met alle antilichamen in uw paneel, op één na. Zoals # 3 in het bovenstaande vak, helpt dit bij het bepalen van het echte positieve signaal voor dat antilichaam tijdens de analyse

Tabel 1: Besturingselementen die in dit protocol moeten worden gebruikt.

Oplossing	Onderdelen	Geschatte benodigde hoeveelheid per batch/muis
Liposoompreparatie
Calciumacetaat	1 M calciumacetaat in H2O	50 ml
HEPES-buffer	10 mM HEPES in H2O, pH 7,4	50 ml
Tesaglitazar in HEPES	in 10 mM HEPES	10 ml
Weefseloogst, -verwerking en -kleuring
Fosfaat-gebufferde oplossing (PBS)	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 in gedestilleerd H2O	2 ml
PBS-Heparine	0,1 mM heparine in PBS	10 ml
HEPES-buffer	20 mM HEPES in PBS	5 ml
Digestiebuffer	2 mg/ml collagenase type I in HEPES-buffer	5 ml
AKC lysis buffer	0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7,2	15 ml
FACS-buffer	1% BSA, 0,05% NaN3 in PBS	15 ml
Fc Block (verdund)	1:50 Fc Blok in FACS buffer	250 μL
Fixatiebuffer	2% paraformaldehyde in PBS	200 μL

Tabel 2: Oplossingen om voor te bereiden.

Een	B	C	D
Extracellulaire kleuring (2x antilichaammix)
Antigeen	Fluorofoor	Ab-volume per 100 μL-test	Totaal benodigde volume:
CD45	PerCP	0,5 μL	Kolom C x 1,2 x totaal # monsters
CD11b	PerCP Cy5,5	0,25 μL	(0,5 μL/test) x (1,2) x (# monsters)
F4/80	PE Cy7	0,25 μL	(0,25 μL/test) x (1,2) x (# monsters)
CD19	PE-CF594	1 μL	(0,25 μL/test) x (1,2) x (# monsters)
CD3	Fitc	1 μL	(1,0 μL/test) x (1,2) x (# monsters)
CD31	Bv605	0,25 μL	enz...
CD11C	APC EF780	1 μL
CD115	PE	1,5 μL
Om uw antilichaammix te maken, combineert u de antilichamen berekend in kolom D met FACS-buffer of Brilliant Violet Staining Buffer * tot een eindvolume van (50 μL x 1,2 x Total # monsters)
Live/Dead kleuring (1x)
Levend/Dood	Fluorofoor	L/D volume per 200 uL test	Totaal benodigde volume:
Levend/Dood	Aqua	0,67 μL	Kolom C x 1,2 x totaal # monsters
Intracellulaire kleuring (1x)
Antigeen	Fluorofoor	Ab-volume per 50 μL-test	Totaal benodigde volume:
αSMA	Fitc	0.125	Kolom C x 1,2 x totaal # monsters
*Brilliant Violet Staining Buffer moet worden gebruikt als er meer dan één antilichaam geconjugeerd aan een Brilliant Violet fluorofoor in uw paneel wordt gebruikt.

Tabel 3: Voorbeeld antilichaampaneel en berekeningen van kleurmengsels om te gebruiken voor stromingskleuring.

Discussie

Hier beschrijven we een driedelig protocol om (i) liposomen te bereiden die zijn gelabeld met een fluorescerende lipidekleurstof en geladen met een anti-diabetische verbinding, tesaglitazar, (ii) liposomen toedienen aan een muis via retro-orbitale injectie, en (iii) weefsels oogsten, verwerken en kleuren om liposoomopname op cellulair niveau te detecteren door flowcytometrie. Dit protocol beoordeelt de bereiding van ongeveer 150-μm liposomen en de beoordeling van de opname in vet, bloed en de milt. Het liposoompreparaat is schaalbaar, wordt meestal bij kamertemperatuur uitgevoerd en maakt gebruik van omgekeerde fase verdamping om het laden van geneesmiddelen en het verwijderen van organische oplosmiddelen te maximaliseren. Met behulp van dit protocol kan tot 2 mg / ml tesaglitazar concentratie worden bereikt in het gezuiverde liposoommonster. De bereide liposomen kunnen meer dan een jaar in HEPES-buffer bij 4 °C worden bewaard. In onze ervaring toonden ze een minimale variatie in de gemiddelde deeltjesgrootte. Minder dan 10% van het verlies van het geneesmiddelgehalte werd spectrofotometrisch aangetoond, na ultrafiltratiescheiding van liposomen van externe geneesmiddelen met een centrifugaalfilter van 10 kDa.

Tijdens de liposoomvoorbereiding zijn er enkele kritieke stappen en factoren waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste is de volgorde van de protocolstappen belangrijk en moet deze worden nageleefd. Ten tweede moet de pH van de oplossing die wordt gebruikt bij het laden van tesaglitazar op 7,4 worden gehouden om de oplosbaarheid en effectieve belasting te maximaliseren. Ten derde zorgt een goede montage van apparatuur en filters ervoor dat de uitvoer van elke stap van de juiste grootte en zuiverheid is. Als bijvoorbeeld 100- en 200-nm-filters niet goed zijn geassembleerd, kan een meer heterogene en onjuist grote partij liposomen het gevolg zijn. Ten vierde is volledige verwijdering van Ca-acetaat voorafgaand aan het laden van geneesmiddelen nodig om de overdracht van tesaglitazar in de liposomen te maximaliseren. Om te testen op volledige verwijdering van Ca-acetaat, gebruikt u snelle sedimentatie om de liposomen te verwijderen en vervolgens Ca-acetaatniveaus in de niet-liposomale oplossing te meten. Ten vijfde is het belangrijk om de massa van alle materialen die aan het liposoompreparaat worden toegevoegd bij elke stap te wegen en te registreren. Dit zorgt ervoor dat de juiste concentraties kunnen worden berekend en de benodigde verhoudingen van materialen worden gehandhaafd. Ten slotte, als de techniek niet goed wordt uitgevoerd, kan er een ongewenst niveau van heterogeniteit zijn. Het is belangrijk om deze parameter grondig te controleren met behulp van DLS en andere benaderingen zoals elektronenmicroscopie. Als u de homogeniteit wilt verbeteren, kunt u overwegen de geselecteerde filtergrootte aan te passen of twee filters te stapelen.

Bovendien is het van cruciaal belang dat controles en een antilichaampanel voor flowcytometrie worden gepland en geoptimaliseerd voordat dit protocol volledig wordt uitgevoerd (tabel 1, tabel 3). Antilichamen moeten worden getest om ervoor te zorgen dat de juiste concentraties worden gebruikt voor kleuring en dat de overlap tussen fluoroforen minimaal is. De excitatie en emissie van de kleurstof die wordt gebruikt tijdens de liposoombereiding moet ook worden meegenomen in de paneelplanning. In onze resultaten gebruikten we DiD, dat een vergelijkbare excitatie en emissie heeft als fluoroforen zoals Allophycocyanin (APC) en AlexaFluor 647. We selecteerden dus geen antilichamen geconjugeerd aan deze fluoroforen in ons antilichaampanel. Bovendien zijn isotypecontroles niet opgenomen in dit protocol. Dit komt omdat de antilichamen die voor dit protocol zijn geselecteerd, goed gevalideerde, commercieel beschikbare antilichamen zijn. Als u echter geïnteresseerd bent in het gebruik van een antilichaam dat nog niet eerder is geoptimaliseerd, overweeg dan om het antilichaam te testen tegen een isotypecontrole op de weefsels van belang voordat u het volledige experiment uitvoert.

Hoewel dit protocol laat zien hoe het bloed, de milt, het inguinale vetweefsel en de epididymale vetweefsels na de behandeling uit de muis kunnen worden geëxtraheerd en verwerkt, kan deze algemene benadering worden toegepast op andere weefsels. Afhankelijk van het weefsel van belang, kunnen verwerkings- en verteringsprotocollen moeten worden gewijzigd zoals is gepubliceerd voor de volgende weefsels: long²¹, lever²², peritoneale holte 3, beenmerg^3,23, hersenen ²⁴.

Een belangrijke beperking van deze methode om te overwegen is dat de opname slechts op één tijdstip per dier kan worden beoordeeld. Het kan dus voordelig zijn om dit protocol te koppelen aan andere niet-invasieve beeldvormingstechnieken of dienovereenkomstig te plannen om te zorgen voor voldoende middelen voor het uitvoeren van de beoordeling. Timing van cellulaire opname en cellulaire omschakeling zijn belangrijke factoren om te overwegen: liposomen zullen in de eerste 24 uur door het lichaam circuleren en afhankelijk van de levensduur van de cellen die liposomen opnemen of hoe ze reageren op opname, kan celdood of verdere fagocytose optreden. Onze vorige studie toonde veranderingen aan in de populatiekenmerken van DiD ⁺ -populaties op verschillende tijdstippen³. Om die reden is het evalueren van opname op eerdere tijdstippen of tijdstippen die het meest relevant zijn voor de biologie van het mechanisme van belang belangrijk. Bovendien, terwijl kwantificering van celopname in het hele weefsel kan worden uitgevoerd met dit protocol, kan flowcytometrie geen weefsellokalisatie onthullen. Het koppelen van deze aanpak aan histologische methoden kan helpen om deze beperking aan te pakken.

Over het algemeen is dit protocol een aanvulling op bestaande methodologie zoals histologie en fluorescentiebeeldvorming van het hele lichaam. Met de voortdurende vooruitgang in flowcytometrie-instrumenten en -methoden zal de ontwikkeling van grotere panelen naar steeds meer specifieke celpopulaties mogelijk worden. We stellen voor dat dit protocol wordt gebruikt in aanvulling op de bovengenoemde methoden, omdat dit de evaluatie van cellulaire opname zal verbeteren en ook de mogelijkheid biedt om de resultaten die door flowcytometrie worden waargenomen, te valideren. Bijvoorbeeld, zou blijken dat een meerderheid van de deeltjes in vetweefsel werd opgenomen door macrofagen door flowcytometrie. Immunofluorescentie van een extra aliquot van hetzelfde vetweefsel kan worden opgeslagen, gefixeerd, gesegmenteerd en gekleurd voor macrofaagmarkers om te controleren of het celtype inderdaad liposomen opneemt. Deze aanpak zou strengheid moeten toevoegen aan de uitgevoerde biodistributietests van nanodeeltjes: het valideren van celspecifieke targeting, het kwantificeren van cellulaire opname, het identificeren van off-target opname en hopelijk het verstrekken van informatie om mechanistische hypothesen te genereren voor waargenomen therapeutische uitkomsten. Dit protocol kan ook worden aangepast voor toekomstige studies met verschillende liposomen, het onderzoeken van opname in andere weefsels en het testen van nieuwe verbindingen in de setting van obesitas en dysmetabolisme of een andere ziekte waarbij nanodeeltjesafgifte een haalbare therapeutische optie is.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-mL spuit	BD	309659
10-mL spuit	BD	302995
25-gauge naald, steriel voor retro-orbitale injectie	BD	305122
27-gauge naald, steriel voor retro-orbitale injectie	BD	305620
Anti-muis B220 BV421	Biolegend	103251	Clone RA3-6B2
Anti-muis CD115 PE	eBioscience	12-1152-82	Clone AFS98
Anti-muis CD11b PerCP Cy5.5-antilichaam	BD Biosciences	550993	Clone M1/70
Anti-muis CD11c APC ef780-antilichaam	eBioscience	47-0114-82	Clone N418
Anti-muis CD19 PE CF594	BD Biosciences	562291	Clone 1D3
Anti-muis CD3 FITC-antilichaam	BD Biosciences	553061	Clone 145-2C11
Anti-muis CD31 BV605	Biolegend	102427	Clone 390
Anti-muis CD45 PerCP	BD Biosciences	557235	Clone 30-F11
Anti-muis F4/80 PE Cy7	Biolegend	123114	Clone BM8
Rundserum albumine	Gemini Bio-products	700-107P
Ontzoutings spin-column	ThermoFisher	89889, 89890	Zeba spin column
DPBS	Gibco	14190-144
Dynamische lichtverstrooiing, Nicomp 370	Particle Sizing System, Inc
FIX & PERM Cell Permeabilisatie Kit	ThermoFisher Scientific	GAS004
Gaasjes	Dermacea	441211
Heparine	Sigma	3393-1MU
Liposomen extruder	Millipore Sigma	Z373400	LiposoFast
Live/Dead Aqua	ThermoFisher Scientific	L34957
Nanosight	Malvern Instruments Ltd	NS300
Oogheelkundige glijmiddel	Optixcare		20g/70 oz steriele
Paraformaldehyde, 16% w/v waterige oplossing, methanol vrij	Alfa Aesar	433689L
Polyethyleen fleson voor hakslager	Wheaton	986701
Rotorend verdamper	Buchi	Re111
Sonificator	Misonix	XL2020
T/Pump Warmtetherapiepomp en pad	Gaymer Industries	TP-500
Tesaglitazar	Tocris	3965
Track-etched polycarbonaatmembranen	Thomas Scientific	1141Z**	Whatman, Nuclepore Polycarbonaat hydrofiele membranen
ZetaSizer/DLS-ELS systeem	Malvern Instruments Ltd