Onderscheid maken tussen intrapulmonale immuuncellen en intravasculaire immuuncelpopulaties: de intrajugulaire benadering

Samenvatting

Het doel van de huidige studie is het beschrijven van een protocol voor het differentiëren tussen intravasculaire en intraparenchymale immuuncellen in onderzoeken naar longontsteking. We gebruiken een intrajugulaire injectie van een fluorescerend gelabeld antilichaam voorafgaand aan de longoogst. Verder gebruiken we een op inflatie gebaseerd longverteringsproces om de opbrengst van leukocyten uit de longen te verbeteren.

Samenvatting

Circadiane ritmes verwijzen naar oscillaties in verschillende biologische processen die optreden met een periode van 24 uur. Op moleculair niveau bestaan dergelijke ritmes uit een web van transcriptionele-translationele feedbacklussen (TTFL) van kernklokgenen. Individuele weefsels en orgaansystemen, waaronder het immuunsysteem, hebben hun eigen klok. In de systemische circulatie oscilleren verschillende leden van de CD45⁺ -populatie gedurende de dag; veel van deze ritmes zijn echter niet identiek of zelfs maar vergelijkbaar in de weefselresidente CD45⁺ -leukocytenpopulatie. Bij het bestuderen van de rol van circadiane regulatie van longontsteking, kan CD45⁺ in de long nodig zijn om te worden onderzocht. Ondanks geoptimaliseerde perfusiemethoden blijven leukocyten die uit de bloedsomloop zijn opgesloten echter in de longen. Het doel bij het ontwerpen van dit protocol was om onderscheid te maken tussen intravasculaire en intraparenchymale leukocyten. Hiertoe worden muizen kort voor de longoogst intrajugulair geïnjecteerd met een fluorescerend gelabeld CD45-antilichaam. Daarna wordt de long verteerd met behulp van een op maat gemaakte longverteringstechniek om een eencellige suspensie te verkrijgen. Het monster wordt gekleurd voor het reguliere panel van antilichamen voor intraparenchymale immuuncellen (inclusief een ander CD45-antilichaam). Flowcytometrische analyses laten een duidelijke opheldering van de populaties zien. De methode voor het labelen en definiëren van intrapulmonale CD45⁺ -cellen zal dus bijzonder belangrijk zijn wanneer het gedrag van intrapulmonale en circulerende immuuncellen numeriek en functioneel verschillend is.

Inleiding

We beschrijven hier efficiënte en betrouwbare methoden om intravasculaire leukocyten te onderscheiden van pulmonale leukocyten. Zelfs met de beste perfusietechnieken hebben onderzoeken aangetoond dat restanten CD45⁺ uit de bloedsomloop in de longen aanwezig zijn. Dit schaadt het vermogen om onderscheid te maken tussen de ritmes in de bloedsomloop en de longen. Dit effect wordt verder versterkt in gevallen van longontsteking. Dit is met name relevant voor de studie van circadiane regulatie van ontstekingen.

Circadiane ritmes verwijzen naar de dagelijkse oscillaties in verschillende biologische processen die optreden met een periode van 24 uur. Het circadiane systeem is een evolutionair geconserveerd anticipatiemechanisme dat bescherming biedt aan de gastheer wanneer deze wordt geconfronteerd met veranderingen in zijn omgeving, zoals de dreiging van infecties. Op cellulair niveau is de klok georganiseerd in zelfvoorzienende transcriptionele-translationele feedbacklussen die de kernklokgenen¹ omvatten. Het immuunsysteem heeft zijn eigen klok die invloed heeft op zijn reactie op ziekteverwekkers en inflammatoire beledigingen ^2,3. Als orgaan dat voortdurend wordt blootgesteld aan de omgeving, zijn circadiane ritmes bijzonder belangrijk in de^{longen 4}. Verschillende immuunprocessen in de longen staan onder klokcontrole ^5,6,7. De fase van verschillende biologische processen in de long en de systemische circulatie zijn echter niet hetzelfde⁸, wat bij uitbreiding ook suggereert dat de oscillaties van leukocyten in de long en de bloedsomloop mogelijk niet identiek zijn. Het hebben van een methode om efficiënt onderscheid te maken tussen pulmonale en intravasculaire leukocyten zal dus van cruciaal belang zijn in de circadiane context.

Het doel van deze studie was om een methode te bedenken die op betrouwbare wijze onderscheid kan maken tussen intravasculaire en intraparenchymale leukocyten. Hiervoor gebruikten we een labeling van intravasculaire leukocyten en longspijsverteringsmethode. Voor de etikettering van intravasculaire leukocyten gebruiken we intrajugulaire injectie, die gericht is op een groot bloedvat en reproduceerbaar kan worden gebruikt bij muizen van alle stammen en maten. Veel andere methoden hebben staartaderinjectie ^9,10 gebruikt, die notoir moeilijker uit te voeren zijn bij Bl6-muizen¹¹. De intrajugulaire injectie vereist het gebruik van anesthesie en kan het beste worden gedaan onder directe visualisatie met een ontleedmicroscoop of vergrotende loepen. Het gemak en de betrouwbaarheid van de intrajugulaire injectie moeten dus worden afgewogen tegen de noodzaak van anesthesie en speciale apparatuur. Gezien de gemakkelijke beschikbaarheid van deze apparatuur in de meeste onderzoekslaboratoria, beschouwen we dit echter niet als een beperkende factor. Een afweging van geval tot geval lijkt echter verstandig.

Protocol

Alle dierstudies werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pennsylvania en voldeden aan de bepalingen van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

OPMERKING: Het algehele proces kan worden onderverdeeld in 1) intraveneuze CD45-etikettering, 2) oogst, 3) spijsvertering en 4) kleuring en flowcytometrie. Deze stappen zijn samengevat in figuur 1.

1. Bereiding van oplossingen/reagens

1. Bereid dissociatiemedia voor door 5 ml 2 ml L-glutamine, 20 ml foetaal runderserum (FBS), 1 ml 2-mercaptoethanol en 10 ml pen/streptokokken toe te voegen aan 500 ml DMEM.
   OPMERKING: Dissociatiemedia zijn tot 2 maanden stabiel bij opslag bij 2-4 °C.
2. Bereid Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)-buffer voor door 10 ml FBS en 500 mg natriumazide toe te voegen aan 500 ml PBS zonder magnesium of calcium.
   OPMERKING: Met de toevoeging van natriumazide kan FACS-buffer maandenlang bij 2-4 °C worden bewaard.
3. Voeg op de dag van monsterafname de DNase- en Liberase-oplossingen toe aan dissociatiemedia in een verdunning van 1:100 (d.w.z. voeg 10 μL DNase en Liberase toe voor elke 1 ml dissociatiemedia).
   OPMERKING: Voor elke muis is voor het verteren van de hele long 10 ml/muis nodig en voor de helft van de long 5 ml/muis.

2. Intraveneuze CD45-etikettering

1. Gebruik voor dit experiment volwassen C57Bl6-muizen van 8-12 weken oud.
2. Verdoof de muizen met middelen naar keuze. Hiervoor werd een combinatie van xylazine en ketamine gebruikt, maar ook andere middelen zijn acceptabel. Het doel is om een matig tot diep niveau van anesthesie te krijgen dat ongeveer 5-10 minuten aanhoudt.
   OPMERKING: Het anesthesiemengsel van xylazine en ketamine wordt intraperitoneaal toegediend. Gebruik 10-15 mg/kg xylazine en 120-150 mg/kg ketamine.
3. Zodra de pedaalreflex negatief is, plaatst u het dier op zijn rug en plakt u zijn ledematen voorzichtig vast om het hoofd zo centraal mogelijk te houden.
4. Leg de halsader en borstspier bloot door de huid op te tillen met een tang en af te knippen met een scherpe chirurgische schaar.
5. Injecteer 200 μl anti-CD45-antilichaam (antilichaam van flowcytometriegraad; verdund 1:300 in PBS) in de halsader met behulp van een naald van 28 G. Wacht 2-4 minuten zodat het antilichaam door het vaatstelsel kan circuleren.
   OPMERKING: Door vanuit een ondiepe hoek via de borstspier in de halsader te komen, wordt voorkomen dat er aanzienlijke bloedingen optreden.
6. Euthanasie vervolgens het dier door blootstelling aan CO₂ gedurende 10 minuten. Ga verder met longperfusie en oogst longen en andere weefsels.
   LET OP: Elke andere methode van humane euthanasie die voldoet aan de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren is ook acceptabel.

3. Dissectie/oogst (Figuur 1)

1. Plaats het dier op zijn rug op een plat bord en speld de poten vast, waarbij u de kop in het midden houdt.
2. Spuit het lichaam in met 70% ethanol. Open de borstholte met een tang en een schaar om de longen, het hart en de luchtpijp bloot te leggen.
3. Doordrenk de long door een kleine incisie te maken in de linker hartkamer en 10 ml koude PBS door de rechterventrikel te injecteren.
4. Knip een opening in de luchtpijp af en breng een intraveneuze canule in. Zodra de canule erin zit, haalt u een hechtdraad van ongeveer 6-8 cm lang onder de luchtpijp en knoopt u deze twee keer aan de canule.
5. Stop het chirurgische touwtje in de canule en bevestig een spuit met dissociatiemedia (5 ml voor een halve long of 10 ml voor een hele long) zoals afgebeeld in afbeelding 1B.
6. Snijd de long voorzichtig weg van de rest van het lichaam en plaats de spuit met de long bevestigd in een conische buis van 50 ml.

4. Spijsvertering tot eencellige suspensie

1. Incubeer de long bij 37 °C gedurende 30-40 minuten, waarbij u elke 5 minuten 1 ml (voor de helft van de long) of 2 ml (voor de hele long) dissociatiemedia indruppelt.
2. Zodra alle media zijn ingedruppeld, verwijdert u de spuit en canule en plaatst u de conische buis van 50 ml in een schudwaterbad met 180 tpm voor de rest van de incubatie voor een betere opbrengst.
   OPMERKING: Als alternatief kunnen de buizen elke 5 minuten handmatig worden geschud.
3. Voeg 10 ml PBS toe en schud krachtig gedurende 1 minuut om de reactie te stoppen.
4. Leid de oplossing door een celzeef (70 μm) in een nieuwe conische buis van 50 ml. Gebruik een rubberen stop van een injectiespuit van 5 ml om eventuele klontjes weefsel door de zeef te leiden. Voeg PBS toe zodat het uiteindelijke volume 30 ml is.
5. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 1.200 x g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren. Pipetteer de resterende oplossing eruit.
6. Voeg 1 ml lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC) toe en meng met de celpellet door te pipetteren.
7. Incubeer 60-90 s bij kamertemperatuur. Voeg PBS toe zodat het uiteindelijke volume 30 ml is om de reactie te stoppen.
   OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de hoeveelheid bloed in de celpellet; Hoe roder de celpellet, hoe langer de incubatietijd.
8. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 1.200 x g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren. Pipetteer de resterende oplossing eruit.
9. Voeg 1 ml FAC-buffer toe aan de celpellet en meng door te pipetteren.

5. Kleuring van cellen voor flowcytometrie

1. Gebruik een cellenteller om het totale aantal cellen in de celsuspensie te bepalen.
2. Breng de celsuspensie over in elke gelabelde FACS-buis, zodat er in totaal 3 x 10^{6 cellen per} monster zijn.
3. Voeg Fc Block toe (verdund 1:100) en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
4. Centrifugeer de buisjes 5 minuten bij 1.200 x g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren.
5. Kleur de monsters met een gespecificeerd antilichaammengsel en incubeer gedurende 20 minuten op ijs dat beschermd is tegen licht (d.w.z. door af te dekken met aluminiumfolie). Meng door de buizen halverwege de incubatie tegen de buishouder te rekken.
6. Voeg 1 ml FACS-buffer toe om te wassen en meng door te pipetteren.
7. Breng de celsuspensie over in een andere FACS-buis door de suspensie langzaam door een zeef van 35 μm te pipetteren.
8. Centrifugeer de buisjes 5 minuten bij 1.200 x g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren.
9. Voeg 150 μL FACS-buffer toe en meng door te pipetteren.
10. Voeg 10 μL DAPI (1:100) toe aan elke buis onmiddellijk voordat de monsters worden uitgevoerd.
    OPMERKING: De monsters zijn nu klaar om op de flowcytometer te worden uitgevoerd.

Resultaten

Met behulp van deze techniek lag het totale celgetal van de naïeve gedissocieerde longen (alleen de linkerlobben werden gebruikt voor de representatieve gegevens) tussen 27,3 x 10⁶ tot 71,1 x 10⁶ cellen/ml. Na het afschermen van de grootte en het wegnemen van doubletten en dode cellen (poortschema in figuur 2), varieerde het aantal leukocyten van 6,9 x 10⁶ tot 13,5 x 10⁶ cellen/ml. Circulerende leukocyten die zelfs...

Discussie

Zorgvuldige studies van longontsteking en pulmonale immuunresponsen zijn cruciaal voor het begrijpen van veel ziekteaandoeningen. Flowcytometrie wordt routinematig gebruikt om pulmonale leukocyten op te sommen en functionele relevantie toe te schrijven. De functie van leukocyten hangt in ieder geval gedeeltelijk af van waar ze worden gevonden. Hoewel er steeds meer bewijs is dat zelfs na perfecte perfusieprotocollen veel intravasculaire leukocyten in de longen blijven bestaan, maken de m...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Boekel Scientific Medium Water Bath	Boekel Grant Scientific	290200
10 mL BD Spuiten met BD Luer-Lok Tip	BD Biosciences	309604
5 mL BD Spuiten met BD Luer-Lok Tip	BD Biosciences	309646
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Cel zeef 70 µm Nylon	Fisher	352350
Corning Conical-Bottom Centrifuge Tube 50 mL	Avantor	21008-714
Corning Falcon Testbuis met Cell Strainer Snap Cap	EMSCO	10004637
Dissectie Microscoop	Olympus	SZX-SDO2
DMEM, hoge glucose	Life Technologies	11965084
Dnase	Roche	10104159001
DPBS zonder Ca++ & Mg++		14190136
Fc Block	Biolegend	101320
HyClone Foetaal Rundserum	GE Healthcare	SH30071.03
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)	Life Technologies	15140-122
Precisie Schud Water Bath	Thermo Fisher	TSSWB15
Rode Bloedcel Lysing Buffer	Sigma	R7757
Sutuurzijde 4-0	Roboz	SUT-15-2

```