Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het doel van de huidige studie is het beschrijven van een protocol voor het differentiëren tussen intravasculaire en intraparenchymale immuuncellen in onderzoeken naar longontsteking. We gebruiken een intrajugulaire injectie van een fluorescerend gelabeld antilichaam voorafgaand aan de longoogst. Verder gebruiken we een op inflatie gebaseerd longverteringsproces om de opbrengst van leukocyten uit de longen te verbeteren.
Circadiane ritmes verwijzen naar oscillaties in verschillende biologische processen die optreden met een periode van 24 uur. Op moleculair niveau bestaan dergelijke ritmes uit een web van transcriptionele-translationele feedbacklussen (TTFL) van kernklokgenen. Individuele weefsels en orgaansystemen, waaronder het immuunsysteem, hebben hun eigen klok. In de systemische circulatie oscilleren verschillende leden van de CD45+ -populatie gedurende de dag; veel van deze ritmes zijn echter niet identiek of zelfs maar vergelijkbaar in de weefselresidente CD45+ -leukocytenpopulatie. Bij het bestuderen van de rol van circadiane regulatie van longontsteking, kan CD45+ in de long nodig zijn om te worden onderzocht. Ondanks geoptimaliseerde perfusiemethoden blijven leukocyten die uit de bloedsomloop zijn opgesloten echter in de longen. Het doel bij het ontwerpen van dit protocol was om onderscheid te maken tussen intravasculaire en intraparenchymale leukocyten. Hiertoe worden muizen kort voor de longoogst intrajugulair geïnjecteerd met een fluorescerend gelabeld CD45-antilichaam. Daarna wordt de long verteerd met behulp van een op maat gemaakte longverteringstechniek om een eencellige suspensie te verkrijgen. Het monster wordt gekleurd voor het reguliere panel van antilichamen voor intraparenchymale immuuncellen (inclusief een ander CD45-antilichaam). Flowcytometrische analyses laten een duidelijke opheldering van de populaties zien. De methode voor het labelen en definiëren van intrapulmonale CD45+ -cellen zal dus bijzonder belangrijk zijn wanneer het gedrag van intrapulmonale en circulerende immuuncellen numeriek en functioneel verschillend is.
We beschrijven hier efficiënte en betrouwbare methoden om intravasculaire leukocyten te onderscheiden van pulmonale leukocyten. Zelfs met de beste perfusietechnieken hebben onderzoeken aangetoond dat restanten CD45+ uit de bloedsomloop in de longen aanwezig zijn. Dit schaadt het vermogen om onderscheid te maken tussen de ritmes in de bloedsomloop en de longen. Dit effect wordt verder versterkt in gevallen van longontsteking. Dit is met name relevant voor de studie van circadiane regulatie van ontstekingen.
Circadiane ritmes verwijzen naar de dagelijkse oscillaties in verschillende biologische pro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierstudies werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pennsylvania en voldeden aan de bepalingen van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
OPMERKING: Het algehele proces kan worden onderverdeeld in 1) intraveneuze CD45-etikettering, 2) oogst, 3) spijsvertering en 4) kleuring en flowcytometrie. Deze stappen zijn samengevat in figuur 1.
1. Bereiding van oplossingen/reagens
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Met behulp van deze techniek lag het totale celgetal van de naïeve gedissocieerde longen (alleen de linkerlobben werden gebruikt voor de representatieve gegevens) tussen 27,3 x 106 tot 71,1 x 106 cellen/ml. Na het afschermen van de grootte en het wegnemen van doubletten en dode cellen (poortschema in figuur 2), varieerde het aantal leukocyten van 6,9 x 106 tot 13,5 x 106 cellen/ml. Circulerende leukocyten die zelfs.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Zorgvuldige studies van longontsteking en pulmonale immuunresponsen zijn cruciaal voor het begrijpen van veel ziekteaandoeningen. Flowcytometrie wordt routinematig gebruikt om pulmonale leukocyten op te sommen en functionele relevantie toe te schrijven. De functie van leukocyten hangt in ieder geval gedeeltelijk af van waar ze worden gevonden. Hoewel er steeds meer bewijs is dat zelfs na perfecte perfusieprotocollen veel intravasculaire leukocyten in de longen blijven bestaan, maken de m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dit werk werd ondersteund door de NHLBI-K08HL132053 (SS). De auteurs danken Dr. G. A. FitzGerald voor de toegang tot een ontleedmicroscoop en een schudwaterbad.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Boekel Scientific Medium Water Bath | Boekel Grant Scientific | 290200 | |
| 10 mL BD Spuiten met BD Luer-Lok Tip | BD Biosciences | 309604 | |
| 5 mL BD Spuiten met BD Luer-Lok Tip | BD Biosciences | 309646 | |
| Anti-CD45- Pac Blue | Biolegend | 103114 | |
| Anti-CD45- Pe/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Cel zeef 70 µm Nylon | Fisher | 352350 | |
| Corning Conical-Bottom Centrifuge Tube 50 mL | Avantor | 21008-714 | |
| Corning Falcon Testbuis met Cell Strainer Snap Cap | EMSCO | 10004637 | |
| Dissectie Microscoop | Olympus | SZX-SDO2 | |
| DMEM, hoge glucose | Life Technologies | 11965084 | |
| Dnase | Roche | 10104159001 | |
| DPBS zonder Ca++ & Mg++ | 14190136 | ||
| Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| HyClone Foetaal Rundserum | GE Healthcare | SH30071.03 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Liberase Research Grade | Sigma | 5401127001 | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Precisie Schud Water Bath | Thermo Fisher | TSSWB15 | |
| Rode Bloedcel Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| Sutuurzijde 4-0 | Roboz | SUT-15-2 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar