Methodenartikel

Microchirurgische dissectie en weefselopruiming voor beeldvorming van intact heel, het hele netvlies en glasvocht met hoge resolutie

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 maart 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor intacte beeldvorming van het hele netvlies waarbij de buitenste ondoorzichtige/gepigmenteerde lagen van de oogbol operatief worden verwijderd en optische klaring wordt toegepast om het netvlies transparant te maken, waardoor de visualisatie van het perifere netvlies en hyaloïde vaatstelsel in intact netvlies mogelijk wordt met behulp van fluorescerende microscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronale en vasculaire structuren van het netvlies in fysiologische en pathologische omstandigheden kunnen beter worden gevisualiseerd en gekarakteriseerd door gebruik te maken van intacte beeldvormingstechnieken van het hele netvlies in vergelijking met conventionele preparaten en secties van het netvlies. Immunofluorescerende beeldvorming van het intacte hele netvlies wordt echter gehinderd door de ondoorzichtige coatings van de oogbol, d.w.z. sclera-, choroïd- en retinaal pigmentepitheel (RPE) en de lichtverstrooiende eigenschappen van retinale lagen die optische beeldvorming met hoge resolutie over de volledige dikte voorkomen. Chemisch bleken van de gepigmenteerde lagen en protocollen voor het opruimen van weefsel zijn beschreven om deze obstakels aan te pakken; de momenteel beschreven methoden zijn echter niet geschikt voor het afbeelden van endogene fluorescerende moleculen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) in intact heel netvlies. Andere benaderingen omzeilden deze beperking door chirurgische verwijdering van gepigmenteerde lagen en het voorste segment van de oogbol, waardoor intacte oogbeeldvorming mogelijk was, hoewel het perifere netvlies en de hyaloïde structuren werden verstoord. Hier wordt een intact protocol voor het hele netvlies en glasvocht immunofluorescerend beeldvormingsprotocol gepresenteerd dat chirurgische dissectie van de sclera/choroïde/retina-pigmentepitheel (RPE) -lagen combineert met een aangepaste weefselopruimingsmethode en fluorescerende microscopie (LSFM). De nieuwe benadering biedt een ongekend beeld van onverstoorbare vasculaire en neuronale elementen van het netvlies, evenals het glasvocht en hyaloïde vasculaire systeem in pathologische omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De interactie tussen de retinale, neuronale en vasculaire elementen in gezonde en ziektetoestanden wordt traditioneel onderzocht door immunofluorescentiestudies op fysieke secties van paraffine- of cryo-gefixeerd netvliesweefsel of op netvliespreparaten1. Weefseldoorsnede verstoort echter de neuronale en vasculaire continuïteit van het netvlies, en hoewel driedimensionale reconstructie van de aangrenzende netvliessecties wordt voorgesteld als een mogelijke oplossing, is het nog steeds onderhevig aan fouten en artefacten. Preparaten voor platte montage van het netvlies verstoren ook duidelijk de integriteit van retinale, vasculaire en neuronale elementen en de geografische verbinding tussen aangrenzende retinale gebieden2. Als alternatief is onlangs intacte beeldvorming van het hele netvlies geïntroduceerd om de driedimensionale projecties van retinale neuronale en vasculaire componenten in hun natuurlijke anatomische positiete visualiseren 2,3,4,5.

Bij intacte beeldvorming van het hele netvlies worden fluorescerende signalen van de vasculaire en neuronale elementen van aangrenzende netvliezen (tegels) van een intact heel netvlies opgevangen met behulp van een lichtbladmicroscoop; Deze tegels worden vervolgens aan elkaar "genaaid" om een driedimensionaal beeld van het hele netvlies te reconstrueren 2,3,4,5,6. Intacte beeldvorming van het hele netvlies biedt een ongekend beeld van het netvlies voor het bestuderen van de pathogenese van retinale, vasculaire, degeneratieve en ontstekingsziekten 2,3,4,5,6. Bijvoorbeeld, Prahst et al. onthulde een voorheen "niet-gewaardeerde" geknoopte morfologie van pathologische vasculaire plukjes, abnormale celmotiliteit en veranderde filopodia-dynamiek in een zuurstofgeïnduceerd retinopathie (OIR) -model met behulp van live beeldvorming van een intact heel netvlies2. Evenzo toonden Henning et al., Singh et al. en Chang et al. het complexe driedimensionale retinale vasculaire netwerk aan in intacte hele netvliezen 3,4,6. Vigouroux et al. gebruikten een intacte beeldvormingsmethode van het hele oog om de organisatie van het netvlies en visuele projecties in perinatale periode5 aan te tonen. Om zulke ongeëvenaarde driedimensionale beelden van het netvlies te kunnen creëren, hebben intacte beeldvormingsprotocollen voor het hele netvlies twee belangrijke beperkingen overwonnen: 1) de aanwezigheid van ondoorzichtige en gepigmenteerde coatings van de oogbol (sclera, choroid en RPE) en 2) de beperkte penetratie van het licht door de volledige netvliesdikte veroorzaakt door de lichtverstrooiingseigenschappen van de retinale nucleaire en plexiforme lagen. Henning et al. en Vigouroux et al. pasten H2O2 bleken van choroïde/RPE-pigmenten toe om een intact netvlies in beeld te kunnen brengen 3,5. Bleken is echter niet geschikt voor dierstammen met endogene fluoroforen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) of na in-vivo immunofluorescerende kleuringen 3,5,7. Bovendien werd de methode van Henning et al. voor H2O2-behandeling uitgevoerd in waterige omstandigheden die microbellen kunnen genereren die leiden tot netvliesloslating. Bovendien werd de H2O2-behandeling uitgevoerd bij 55 °C, een aandoening die de weefselantilichaamaffiniteit verder verslechtert. Bovendien kan bleken zware autofluorescentie veroorzaken die afkomstig is van geoxideerde melanine8. Andere depigmentatieprotocollen voor oogsecties met behulp van kaliumpermanganaat en oxaalzuur waren in staat om RPE-pigmenten in embryonale secties te verwijderen, maar van deze depigmentatiemethode is ook aangetoond dat deze de werkzaamheid van immunolabeling vermindert 9,10. Als alternatief voor bleken hebben Prahst et al., Singh et al. en Chang et al. sclera en choroideus en hoornvlies verwijderd om een heel netvlies bereikbaar te maken voor microscooplicht 2,4,6. Het verwijderen van het hoornvlies, de lens en het perifere netvlies kan echter het perifere netvlies en de hyaloïde vaten vervormen en verstoren, waardoor deze methoden ongeschikt zijn voor het bestuderen van het perifere netvlies en de hyaloïde vasculatuur.

Alle momenteel beschikbare intacte beeldvormingsprotocollen voor het hele oog omvatten het gebruik van een optische opruimingsstap van het weefsel om de lichtverstrooiingseigenschappen van retinale lagen 2,3,4,5 te overwinnen. Optische klaring van weefsel maakt het netvlies transparant voor microscooplicht door de brekingsindex van een bepaald weefsel, hier het netvlies, over al zijn cellulaire en intercellulaire elementen gelijk te maken om lichtverstrooiing en -absorptie te minimaliseren11. Choroïd en RPE moeten worden verwijderd of gebleekt voordat weefseloptische zuivering op het netvlies wordt aangebracht, aangezien de gepigmenteerde lagen van de oogbol (choroïd en RPE) niet voldoende kunnen worden geklaard 6,12,13,14,15,16,17,18.

De deelname en bijdragen van het glasvocht en het hyaloïde vaatstelsel bij pathologische aandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit (ROP), persistente foetale vasculatuur (PFV), de ziekte van Norrie en de ziekte van Stickler kan het beste worden bestudeerd wanneer het netvlies en de hyaloïde vaten niet worden verstoord bij weefselpreparatie 19,20,21,22,23 . Bestaande methoden voor intacte beeldvorming van het hele netvlies verwijderen ofwel het voorste segment van het oog, dat op natuurlijke wijze het glasvocht en zijn vaatstelsel verstoort, of passen bleekmiddelen toe, die endogene fluoroforen kunnen verwijderen. Gepubliceerde methoden voor het visualiseren van het glasvocht en het vaatstelsel in hun intacte, ongerepte toestand ontbreken. We beschrijven hier een beeldvormingsmethode voor het hele netvlies en glasvocht die bestaat uit chirurgische dissectie van gepigmenteerde en ondoorzichtige coatings van de oogbol, een optische opruiming van gemodificeerd weefsel geoptimaliseerd voor het netvlies en fluorescerende microscopie van lichte vellen. Monstervoorbereiding, optische klaring van weefsel, lichtbladmicroscopie en beeldverwerkingsstappen worden hieronder beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door de University of Texas Medical Branch Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het gebruik en de verzorging van dieren waren in overeenstemming met de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek. Alle materialen die nodig zijn om deze procedure uit te voeren, staan vermeld in de materiaaltabel. Draag poedervrije handschoenen tijdens het uitvoeren van elke stap. Raadpleeg voor stap 6 en 7 ook de officiële gebruiksaanwijzing van de microscoop.

1. Voorbereiding van de dieren

  1. Euthanaseer de experimentele muizen in overeenstemming met het toepasselijke door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocol (anesthesie met een combinatie van ketamine 60 mg/kg en dexmedetomidine 0,5 mg/kg gevolgd door cervicale dislocatie werd hier gebruikt). Ga onmiddellijk verder met het stabiliseren van het dier op een platform voor dissectie en hartperfusie.
    OPMERKING: Proefdieren worden gekozen op basis van de opzet van het individuele onderzoek.
  2. Ontleed de buik en thorax om het hart bloot te leggen. Voer hartperfusie uit door het hart te transfunderen via een naald van 27 G die in de linkerventrikel wordt geplaatst en maak een kleine (~1 mm) incisie in het rechteratrium om bloeduittreding mogelijk te maken24.
    1. Transfuseer eerst 30-50 ml ijskoude fosfaatgebalanceerde zoutoplossing (PBS) en vervolgens 30-50 ml vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA).
    2. Om te controleren op een succesvolle PFA-transfusie, controleert u op zichtbare spiertrekkingen door het hele lichaam en de staart. Ga verder met de enucleatiestap.

2. Oogbol-enucleatie en fixatie

  1. Gebruik een gebogen juwelierstang om voorzichtig over het boven- of onderooglid te duwen om de oogbol uit de oogkas te duwen. Gebruik een andere juweliers- of soortgelijke tang om het bindvlies vanaf de zijkant te doorboren en houd de bol vast vanaf de kant van de oogzenuw. Til de wereldbol langzaam uit de kom totdat deze van de oogzenuw is losgemaakt.
  2. Breng de bol over in een tube met vers bereide ijskoude 4% PFA. Label de tube dienovereenkomstig. Laat de bol 12 uur (nacht) in een koelkast van 4 °C in 4% PFA blijven.
    OPMERKING: Gebruik een plastic transferpipet met een afgesneden punt om de bol over te brengen. Verbreed de opening van de afgesneden punt met een tweede pipetpunt om beschadiging van het monster met scherpe randen te voorkomen.

3. Dissectie van het monster (figuur 1 en figuur 2)

  1. Zoek onder een stereomicroscoop de overgang tussen hoornvlies en sclera (Figuur 1A) en gebruik de scherpe snijpunt van een naald van 30 G om een zeer oppervlakkige snede te maken bij de sclera ongeveer 0,5-1 mm achter de overgang tussen hoornvlies en sclera (Figuur 1B).
  2. Schuif een van de bladen van een snijschaar met scherpe punt door de incisie die zojuist is gemaakt in de potentiële ruimte tussen de sclera/choroïd/RPE en het netvlies (Figuur 1C). Schuif de schaar vooruit en knip in de omtrek totdat de sclera/choroïde/RPE van het buitenoppervlak van het netvlies kan worden afgepeld (Figuur 1D,E).
    OPMERKING: Het is belangrijk om deze stap langzaam en voorzichtig uit te voeren om te voorkomen dat het netvlies wordt doorboord. De eerste paar sneden zijn vooral van cruciaal belang om te voorkomen dat het netvlies doorsnijdt.
  3. Maak indien nodig radiale ontspannende sneden op de sclera/choroïd/RPE om het proces van omtreksnijden en de daaropvolgende vervelling van de oogzenuw en sclera/choroïd/RPE te vergemakkelijken. Verwijder kleine stukjes RPE (Figuur 1F) met behulp van een schilderkwast van maat 1 gedrenkt in PBS.
  4. Breng de hele intacte oogbol over in een tube met PBS. Ga onmiddellijk verder met de volgende stap of bewaar bij 4 °C voor immunolabeling.
    OPMERKING: Markeringen kunnen op de oogbol worden geplaatst na enucleatie en vervolgens na dissectie om de oriëntatie van het oog indien nodig te behouden. Het protocol kan hier worden gepauzeerd en de monsters kunnen een nacht worden bewaard in een koelkast van 4 °C voordat u doorgaat naar de volgende stappen.

4. Vasculaire kleuring

  1. Permeabiliseer het weefsel door het gedurende 20 minuten onder te dompelen in PBS met 0,2% Tween-20 bij kamertemperatuur.
  2. Was het monster 3 keer met PBS op een shaker gedurende 10 minuten.
  3. Incubeer het monster met 5% normaal geitenserum (NGS) in PBS met 0,25% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  4. Incubeer met het primaire antilichaam een nacht bij 4 °C. Hier werd een anti-muis collageen IV-antilichaam gebruikt (de uiteindelijke concentratie werd bereid in PBS met 0,2% Tween-20).
  5. Was 3 keer met PBS, gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  6. Incubeer het monster met fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Hier werd een anti-konijn Alexa Fluor 568 gebruikt gedurende 12 uur bij 4 °C (1:200 verdunning in PBS met 0,2% Tween-20).
  7. Was met PBS 3 keer, elk gedurende 1 uur, en ga dan verder met de stappen voor het verwijderen van weefsel.

5. Optische klaring met 2,2′-thiodiethanol (TDE)

  1. Bereid werkende TDE-concentraties voor met behulp van standaard TDE-oplossing met PBS voor een eindconcentratie van 10%, 20%, 30%, 40%, 50% en 60% volume tot volume (v/v). Bereid ten minste 2 ml oplossing voor elk oogmonster om voldoende overtollig volume in het weefsel te laten doordringen.
  2. Incubeer de monsters in een plaatput met 6 of 12 putjes bij toenemende concentratie TDE. Begin met het onderdompelen van de intacte hele oogbollen in 10% TDE-oplossing gedurende 2-4 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Breng het monster achtereenvolgens gedurende 2-4 uur in elke TDE-concentratie over naar een hogere TDE-concentratie (figuur 2C).
    OPMERKING: Het netvlies begint te klaren bij concentraties van 40%-50%, maar maximale klaring vindt plaats na incubatie in een 60%-oplossing. Het netvlies wordt minder transparant bij concentraties van 70% en hoger (Figuur 2D).
  3. Stop het clearingproces 's nachts, indien nodig, bij een van de opeenvolgende clearing-uitwisselingsstappen.

6. Beeldvorming van het hele oog met behulp van een light sheet-microscopie

  1. Monteer de intacte hele oogmonsters, rekening houdend met de configuratie van het lichtbladmicroscoopplatform dat wordt gebruikt. Volg de instructies van de microscoop en de acquisitiesoftware om acquisitieparameters in te stellen, waaronder de uitlijning van het lichtblad en de verlichting en detectie van optische paden.
    OPMERKING: De monsters die in dit experiment zijn gebruikt, werden vanaf de kant van het hoornvlies tot de punt van een injectienaald op een insulinespuit gelijmd (Figuur 2E). Het monster werd vervolgens in de microscoopkamer opgehangen.
  2. Vul de microscoopkamer met 60% TDE als klaringsoplossing.
  3. Dompel het monster onder in de microscoopkamer van het lichtblad in 60% TDE-oplossing (de uiteindelijke klaringsconcentratie).
  4. Breng het heldere oog in beeld door middel van een verscheidenheid aan commerciële of op maat gemaakte confocale en lichtmicroscopen. In dit protocol wordt een dubbelzijdige verlichtingsmicroscoop gebruikt.
  5. Gebruik beeldvorming met een lage resolutie en lage vergroting (5x, NA 0,16) om cellulaire morfologie en cellulaire procestracering in beeld te brengen, vooral in combinatie met tegels. Gebruik beeldvorming met hoge resolutie en vergroting (20x, NA 1.0) om zowel cellulaire morfologie als grote subcellulaire organellen zoals kernen en mitochondriale clusters in beeld te brengen.

7. Beeldverwerking na acquisitie

OPMERKING: De verwerking na de acquisitie is afhankelijk van het type bestand en de software die compatibel is met de afbeeldingsbestanden.

  1. Pas onscherpte of deconvolutie toe om de onbewerkte afbeeldingen verder te vergroten voordat de tegels met afbeeldingen worden samengevoegd. Een Weiner-filter kan worden toegepast om de afbeeldingen onscherp te maken. Als alternatief kunnen afbeeldingen iteratief worden gedeconvoleerd na het deconiseren van ruis met de Richardson-Lucy-deconvolutie en een theoretisch of experimenteel gemeten PSF met behulp van modelleringstools zoals de ImageJ PSF-generatorplug-in25.
  2. Voer het samenvoegen uit van voorbewerkte z-stacks en een affiene en niet-rigide volumetransformaties, gevolgd door multi-view volumeregistratie en fusie met behulp van een verscheidenheid aan commerciële of publieke domein softwarepakketten (ImageJ – BigStitcher plugin)26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nulhoekprojectie van het peripapillaire vasculaire netwerk en de microglia wordt getoond in figuur 3A. Ook wordt de intacte verdeling van de microglia van het hele netvlies in een CX3CR1-GFP-muis weergegeven in figuur 3B. Een groot voordeel van de hier gepresenteerde methode is het vermogen om aangeboren fluoroforen in beeld te brengen. Figuur 3C,D toont microglia in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling en pathologieën van het netvlies en het glasvocht kunnen het best worden bestudeerd met intacte beeldvormingstechnieken van het hele netvlies waarbij het netvlies niet wordt doorgesneden voor secties of voor preparaten voor platte montage. Bestaande intacte beeldvormingsmethoden voor het hele oog omvatten ofwel pigmentbleking, waarbij aangeboren fluoroforen worden verwijderd, of omvatten fysieke verwijdering van de ondoorzichtige coatings van de oogbol (RPE, choroïd en sc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen relevant commercieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk is gedaan aan de medische afdeling van de Universiteit van Texas. De auteurs waarderen Harald
Junge, PhD, Debora Ferrington, PhD, en Heidi Roehrich, University of Minnesota voor hun hulp bij het voorbereiden van figuur 1 en film 2. LO werd ondersteund door NIEHS T32 Training Grant T32ES007254.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Experimenteel dier
CX3CR1-GFP MuisThe Jackson Laboratory5582
Verdoving
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
KetamineFresenius Kabi
Weefsel ophalen, fixeren en monster dissectie
Hart perfusie pompFisher scientificNC9069235
Cyanoacrylaat superlijmamazon.com
Fijne schaar-scherpFine Science Tools14160-10
Fijne pincettenFine Science Tools11412-11
Paraformaldehyde (PFA)Electrone microscopy sciences15710-S
Fosfaat buffer oplossing (PBS)Gibco10010049
Maat 1 schilderspensdickblick.com
Rechte veer schaarFine Science Tools15000-03
Spuit, naaldpunt, 27 gauge x 1,25"BD
Buizen 1,5 ml, 15 ml, 50 mlThermo scientific
Tween-20ThermoFisher85114
Immunoflurescente kleuring
Anti-muis collageen IV antilichaamAbcamab198081:200 verdunning
Anti-konijn Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 verdunning
Normaal geitenserumThermoFisher50062Z10% concentratie
Weefsel ophelderen
2,2'-thiodiethanol (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Slinger shakerFisher scientific02-217-765
Microscopie
Fluorescente microspherenTetraSpeckT14792
Lichtblad fluorescente microscoop (LSFM)ZeissZ1
Microglia enumeratie
ImageJNational Institute of Health

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Light Sheet MicroscopySclera Choroid RPE DissectionRetinal Vascular ImagingNeuronal Structure ImagingEndogenous Fluorescent ImagingGFP Retina ImagingHigh Resolution Retina
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen