In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bacteriële persistenten worden gedefinieerd als een kleine subpopulatie van fenotypische varianten met het vermogen om hoge concentraties antibiotica te tolereren. Ze zijn een belangrijk gezondheidsprobleem omdat ze zijn geassocieerd met terugkerende chronische infecties. Hoewel bekend is dat stochastische en deterministische dynamiek van stressgerelateerde mechanismen een belangrijke rol speelt bij persistentie, worden mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische switch van/naar de persistentietoestand niet volledig begrepen. Hoewel persistentiefactoren die worden veroorzaakt door omgevingssignalen (bijv. uitputting van koolstof-, stikstof- en zuurstofbronnen) uitgebreid zijn bestudeerd, moeten de effecten van osmolyten op persistentie nog worden bepaald. Met behulp van microarrays (d.w.z. 96 putplaten met verschillende chemicaliën) hebben we een aanpak ontworpen om de effecten van verschillende osmolyten op escherichia coli persistentie op een hoge doorvoer manier op te helderen. Deze aanpak is transformerend omdat het gemakkelijk kan worden aangepast voor andere screeningarrays, zoals medicijnpanels en gen knock-outbibliotheken.
Inleiding
Bacteriële culturen bevatten een kleine subpopulatie van persistente cellen die tijdelijk tolerant zijn voor ongewoon hoge niveaus van antibiotica. Persistentiecellen zijn genetisch identiek aan hun antibioticagevoelige verwanten en hun overleving is toegeschreven aan voorbijgaande groeiremming1. Persistercellen werden voor het eerst ontdekt door Gladys Hobby2, maar de term werd voor het eerst gebruikt door Joseph Bigger toen hij ze identificeerde in met penicilline behandelde Staphylococcus pyogenesculturen 3. Een baanbrekende studie gepubliceerd door Balaban et al.4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van groeimedium, ofloxacineoplossing en E. coli-celvoorraden
- Normaal Luria-Bertani (LB) medium: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L natriumchloride (NaCl) en 5 g/L gistextract toe in gedeïoniseerd (DI) water. Steriliseer het medium door autoclaaf.
- LB agar platen: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 15 g/L agar toe aan DI water en steriliseer het medium door autoclaaf. Giet bij de gewenste temperatuur (~55 °C) ~30 ml agar medium in vierkante platen (10 x 10 cm). Droog de platen en bewaar ze op 4 °C.
- Gemodificeerd LB-medium: Voeg 10 g/L trypton en 5 g/L gistextract toe in DI-water. Sterilise....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 beschrijft ons experimentele protocol. De verdunnings-/groeicyclusexperimenten (zie Protocol 2) werden aangepast aan een studie uitgevoerd door Keren et al.5 om de persistenten afkomstig van de nachtelijke culturen te elimineren. Figuur 2A is een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen. In deze experimenten werden cellen gekweekt in gemodificeerd.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven persistentietest met hoge doorvoer is ontwikkeld om de effecten van verschillende chemicaliën op de persistentie van E. coli te verduidelijken. Naast commerciële PM-platen kunnen microarrays handmatig worden geconstrueerd zoals beschreven in stap 4.2. Bovendien is het hier gepresenteerde protocol flexibel en kan het worden gebruikt om andere microarrays te screenen, zoals medicijnpanelen en celbibliotheken, die in 96 putplaatformaten zijn. De experimentele omstandigheden, waaronder de groeifas.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen de leden van Orman Lab bedanken voor hun waardevolle inbreng tijdens dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door de NIH/NIAID K22AI125468 career transition award en een University of Houston startup grant.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Verkregen van Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Gesteriliseerd door gammastraling en vrij van cytotoxines |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Moleculaire genetica kwaliteit |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97,5 |
| Phenotype microarray (PM-9 en PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 en PM-10 platen bevatten respectievelijk verschillende osmolyten en buffers |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Gecertificeerd ACS kwaliteit |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagenskwaliteit |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% zuiverheid |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Moleculaire genetica kwaliteit |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Gebruikt voor optische dichtheidsmeting bij 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Moleculaire genetica kwaliteit |
Referenties
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
