Methodenartikel

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

DOI:

10.3791/61605

⸱

3 november 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten is een cruciaal probleem voor hun toepassing in regeneratieve therapie, drugstesten en ziektemodellering. Ondanks de ontwikkeling van meerdere differentiatieprotocollen blijft de generatie iPSC cardiomyocyten die lijken op een volwassen fenotype een uitdaging. Een belangrijk aspect van cardiomyocyten rijping omvat de vorming van een goed georganiseerd sarcomere netwerk om een hoge contractiecapaciteit te garanderen. Hier presenteren we een super resolutie-gebaseerde aanpak voor semi-kwantitatieve analyse van het α-actinin netwerk in cardiomyocyten. Met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie werd een vergelijking gemaakt van de sarcomerelengte en de z-discdikte van iPSC-afgeleide cardiomyocyten en hartcellen geïsoleerd van neonatale weefsel. Tegelijkertijd tonen we het belang aan van goede beeldvormingsvoorwaarden om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze resultaten tonen aan dat deze methode geschikt is om de structurele rijpheid van hartcellen met een hoge ruimtelijke resolutie kwantitatief te monitoren, waardoor zelfs subtiele veranderingen van de sarcomere organisatie kunnen worden gedetecteerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hart- en vaatziekten (CVD) zoals een hartinfarct of cardiomyopathie blijven de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1. Aangezien het menselijk hart slechts een slechte regeneratieve capaciteit bezit, is er behoefte aan strategieën om het herstel van CVD's te bevorderen. Dit omvat celvervangende therapieën om verloren cardiomyocyten (CM) aan te vullen, evenals de ontwikkeling van nieuwe antiritmische geneesmiddelen voor efficiënte en veilige farmaceutische interventie. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn aangetoond dat een veelbelovende celbron voor de onbeperkte generatie van menselijke CM in vitro, geschikt voor regeneratieve therapieën, ziekte modellering, en voor de ontwikkeling van screening testen van geneesmiddelen2,3,4.

Hoewel er veel verschillende cardiale differentiatieprotocollen bestaan, ontbreekt het iPSC-afgeleide CM nog steeds aan bepaalde fenotypische en functionele aspecten die de in vitro en in vivo toepassing5,6belemmeren . Naast elektrofysiologische, metabolische en moleculaire veranderingen, omvat het hartrijpingsproces de structurele organisatie van sarcomeres, die de fundamentele eenheden zijn die nodig zijn voor krachtgeneratie en celcontractie7. Terwijl volwassen CMs een goed georganiseerd contractielapparaat vertonen, tonen door iPSC afgeleide CMs vaak ongeregelde sarcomerefilamenten aan, geassocieerd met een verminderd contractievermogen en veranderde contractiedynamiek8,9. In tegenstelling tot volwassen CM die eenaxial contractiepatroon vertonen, resulteren de gedesoriënteerde structuren in onrijpe CM in een radiale samentrekking van de hele cel of bevorderen de verschijning van contractie focal points9,10.

Voor het verbeteren van de hartrijping zijn meerdere benaderingen toegepast, waaronder 3D-celkweekmethoden, elektrische en mechanische stimulatie, evenals het gebruik van extracellulaire matrices die in vivo omstandigheden11,12,13nabootsen . Om het succes en de efficiëntie van deze verschillende cultuuromstandigheden te evalueren, zijn technieken nodig om de mate van structurele rijping van iPSC CM te monitoren en te schatten, bijvoorbeeld door middel van microscopische technieken. In tegenstelling tot conventionele confocale beeldvorming is de resolutie in het geval van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) ongeveer 10x hoger. Deze techniek op zijn beurt zorgt voor een meer nauwkeurige analyse, het detecteren van zelfs subtiele veranderingen van cellulaire structuren14. Gezien de hoge resolutie van PALM-gebaseerde beeldvorming, het algemene doel van deze methode was de microscopische evaluatie van sarcomere rijpheid in iPSC-afgeleide CMs door nauwkeurige bepaling van z-Disc dikte en sarcomere lengte. In eerdere studies is aangetoond dat deze structurele kenmerken geschikte parameters zijn om cardiale rijpheid te beoordelen15. Bijvoorbeeld, zieke iPSC-CM ontbreekt volledige lengte dystrophin vertonen verminderde sarcomere lengte en z-band breedte in vergelijking met wilde type cellen16. Ook werd de lengte van individuele sarcomeres gemeten om de impact van topografische signalen op cardiale ontwikkeling16te onderzoeken. Daarom hebben we deze aanpak toegepast om de structurele rijping van het sarcomere-netwerk in iPSC-CM te evalueren door de sarcomerelengte en z-discdikte kwantitatief te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle stappen in dit protocol met neonatale en volwassen muizen werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor de dierverzorging van het Rostock Universitair Medisch Centrum.

1. Teelt en dissociatie van iPSC-afgeleide cardiomyocyten

  1. Onderscheid hiPSC-CMs gedurende 25 dagen met behulp van een 2D monolayer methode zoals eerder beschreven17.
  2. Prewarm dissociatiemedium tot 37 °C en steun middel tot kamertemperatuur.
  3. Was cellen twee keer met PBS.
  4. Voeg voorverwarmd dissociatiemedium toe aan cellen en broed gedurende 12 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Voeg ondersteuningsmedium toe aan de cellen.
    OPMERKING: Het volume van het toegevoegde ondersteuningsmedium moet twee keer zo groot zijn als het volume van het dissociatiemedium dat in stap 1.4 wordt gebruikt.
  6. Verjagen de cellen met behulp van een 5 mL serologische pipet.
  7. Centrifugecellen op 200 x g gedurende 5 min en resuspend de pellet in 3 mL van hiPSC-CM cultuurmedium17.
  8. Zaadcellen in 8 goed glazen bodemkamers bij een celdichtheid van 75.000 cellen /goed en cultuur gedurende 3 dagen.

2. Volwassen cardiomyocyte isolement

  1. Isolatie en teelt van volwassen cardiomyocyten van NMRI muizen werd uitgevoerd zoals eerder gemeld18.
  2. Zaadcellen in 8 goed glazen kamer dia en cultuur voor een dag.

3. Isolatie en teelt van neonatale cardiomyocyten

  1. Isolatieprocedure van neonatale cardiomyocyten, verkregen van NMRI-muizen, werd uitgevoerd zoals eerder beschreven19.
  2. Zaad geïsoleerde cel in 8 goed glazen kamer dia bij een celdichtheid van 75.000 cellen / goed en cultuur voor 3 dagen in neonatale CM cultuur medium19.

4. Immunofluorescentie-etikettering van het α-actininenetwerk

LET OP: Voor optimale resultaten worden cellen gekweekt in 8 goed glazen bodemkamers. Etikettering moet een dag voor de beeldvorming worden uitgevoerd.

  1. Verwarm 4% PFA bij 37 °C.
  2. Fix iPSC-CM by adding 4% paraformaldehyde directly in the culture media (1:1 dilution) and incubate at 37 °C for 15 min. De uiteindelijke concentratie van PFA voor fixatie is 2%.
  3. Incubeer vaste cellen in 0,2% Triton-X, verdund in PBS, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was cellen twee keer met PBS, 5 min per stuk.
  5. Voeg 1% BSA-oplossing (verdund in PBS) en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Bereid 150 μL primaire antilichaamoplossing voor door α-actinineantilichaam 1:100 in 1% BSA te verdunnen, met 0,05% Triton-X. Voeg toe aan cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
  7. Was cellen twee maal met 0,2% BSA-oplossing, 5 min per stuk.
  8. Bereid 150 μL secundaire antilichaamoplossing voor door het verdunnen van het Alexa647-antilichaam 1:100 van geit-antimuis, met 0,05% Triton-X. Voeg toe aan de cellen en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 40 min.
  9. Was cellen twee maal met 0,2% BSA-oplossing, 5 min per stuk.
  10. Was cellen twee keer met PBS, 5 min per stuk. Houd gelabelde cellen in het donker op 4 °C tot PALM beeldvorming.

5. Voorbereiding van de PALM-beeldvormingsbuffer

OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de PALM-beeldverdelende buffer voor elk experiment vers voor te bereiden.

  1. Bereid 50% glucoseoplossing voor door 25 g glucose op te lossen in 50 mL gedestilleerd water.
  2. Bereid de basisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl, 10% glucose en 10 mM natriumchloride.
    1. Pas het pH-niveau aan op ~8.0 met zoutzuur.
  3. Bereid pyranoseoxidaseoplossing voor door 0,6 mg pyranoseoxidase op te lossen in 316 μL basisbuffer.
  4. Bereid catalase-oplossing voor door 7 mg catalase op te lossen in 500 μL basisbuffer. Meng grondig en centrifuge op 10.000 x g gedurende 3 min. Houd de supernatant voor verder gebruik. Catalase oplossing kan meerdere dagen op 4 °C worden gehouden.
  5. Bereid 500 μL PALM imaging buffer voor door 316 μL pyranoseoxidaseoplossing, 25 μL catalase-oplossing, 100 μL van 50% glucoseoplossing, 50 μL cysteamine, 5 μL cyclooctatetraeen en 3,5 μL van β-Mercaptoethanol. De uiteindelijke katalytische activiteit van pyranose oxidase en catalase moet respectievelijk 7,5 U, 35,00U zijn.
    LET OP: De PALM imaging buffer biedt optimale beeldvormingsomstandigheden voor 3-5 uur. Als knipperend vermogen van de fluorescerende kleurstof afneemt, bereiden een nieuwe buffer aliquot.

6. PALM-beeldaanwinst

  1. Schakel de microscoop ten minste 3 uur voor gebruik in en breng het monster op kamertemperatuur voordat de beeldvorming thermische evenwicht mogelijk maakt. Als de microscoop is uitgerust met een incubatiekamer, past u de temperatuur aan op 30 °C.
  2. Reinig het doel en de onderkant van de schuif met behulp van een geschikt reinigingsmiddel.
  3. Voeg 300 μL PALM imaging buffer toe aan één put van gelabelde cellen en steek de kamerglijbaan in de stadiumhouder van de microscoop.
  4. Stel de parameters voor de aankoop van DE PALM-afbeelding in.
    1. Selecteer 1,57 N.A. 100x oliedoelstelling voor overname.
    2. Selecteer de PALM-modus en activeer de TIRF-instellingen.
    3. Pas het aantal frames aan dat moet worden aangeschaft. Meestal zijn 5.000-10.000 frames voldoende om optimale resultaten te behalen. Het aantal verworven frames hangt echter sterk af van de etiketteringsefficiëntie en de knippercapaciteit van de fluorescerende kleurstof en kan door de gebruiker worden aangepast.
    4. Stel UV-laservermogen in op 0,1% en 647 laser op 0,2%.
    5. Stel het versterkingsniveau in op 50-100.
    6. Schakel de laserverlichting in en selecteer een doelcel. Het versterkingsniveau kan worden verhoogd als de signaalintensiteit te laag is (afhankelijk van fluorescentielabeling).
    7. De laserverlichting uitschakelen
  5. PALM-beeldverwerving
    1. Verlaag de winst tot 0 en verhoog het laservermogen (ex 647) tot 100%.
    2. Bleek de doelcel voor ~ 5 s.
    3. Verhoog de winst tot 50 en start palm-beeldacquisitie.
      OPMERKING: Versterking moet worden aangepast om voldoende signaalintensiteit te krijgen, terwijl oververzadigde pixels moeten worden vermeden. Als de signaalintensiteit vermindert, verhoogt u het versterkingsniveau.
  6. Optioneel u de UV-laserkracht gestaag verbeteren (0,1%-10%) om de signaalintensiteit te verhogen en het knipperen van de fluorofofor te bevorderen.

7. Reconstructie van PALM-gegevens

  1. Open de Image J-software en importeer PALM-gegevens.
  2. Open Thunderstorm Plugin en "Run analyse"
    1. Voer in het menu' Camera-instelling" pixelgrootte en EM-versterking in.
      OPMERKING: Bij gebruik van 100x doelstellingen en 1,6x vergroting lens, 100 nm pixelgrootte is geschikt. Aangezien de pixelgrootte echter afhankelijk is van de hardwarekenmerken van de microscoop en de camera die worden gebruikt voor PALM-beeldvorming, moeten gebruikers deze parameter zorgvuldig controleren en aanpassen. EM gain waarden kunnen worden verkregen uit de metadata.
    2. In de "Run analysis menu" stel parameters als volgt: B-spline volgorde: 3, B-spline schaal: 2.0, piek intensiteit drempel: stf (Wave.F1), montage radius: 3, initial sigma: 1.6, vergroting: 5.0, update frequentie: 50, laterale verschuivingen: 2. Bevestigen door te klikken op de "Ok" knop.
  3. Nabewerking van gereconstrueerde PALM-afbeelding
    1. Selecteer in het menu" Plot histogram" de parameter "Sigma".
    2. Gebruik het gereedschapRechthoekom een ROI te selecteren, met uitzondering van mogelijke artefacten en roi toe te passen op het filter. ROI-waarden worden weergegeven in het opdrachtvak filter.
    3. Voeg "& onzekerheid <25" toe aan de ROI-waarden. Een mogelijke filteropdracht ziet er als volgt uit: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Geselecteerde sigmawaarden toepassen.
    4. Voer in het menu'Duplicaten verwijderen' een afstandsdrempelvan "10 nm" in en breng een aanvraag in.
    5. Stel in hetmenu " Samenvoegen" de maximale afstand in op "20", maximale frames per molecuul op "0" en maximaal uit frames op "1". Instellingen toepassen.
    6. Selecteer in hetmenu " Driftcorrectie" kruiscorrelatie en stel "Aantal bakken" in op "5" en "Vergroting" op "5.0". Plaats instellingen voor driftcorrectie.
    7. Sla de uiteindelijke PALM-afbeelding op en exporteer desverwerkte gegevens indien gewenst.

8. Analyse van sarcomere filamenten

  1. Analyse van sarcomere lengte
    1. Open Image J-software en importeer de gereconstrueerde PALM-afbeelding.
    2. Teken een lijn tussen geselecteerde sarcomerestructuren loodrecht op de z-disc om de kortste afstand tussen actininefilamenten te meten.
    3. Selecteer "Plot profiel" in het menu "Analyseren" en verkrijg de lengte tussen twee pieken. Aangezien de sarcomerelengte binnen één cel kan variëren, moeten minimaal 20 sarcomeren worden gemeten in verschillende gebieden van de doelcel.
  2. Analyse van de dikte van de Z-Disc
    1. Open Image J-software en importeer de gereconstrueerde PALM-afbeelding.
    2. Zet de gereconstrueerde PALM-afbeelding om in een afbeelding in de 8-bits modus.
    3. Open de nokdetectie-plugin en voer de volgende parameters in: lijnbreedte: 20, hoog contrast: 230, laag contrast: 10, sigma: 0,79, ondergrens: 25,84, minimale lijnlengte: 20.
    4. Stel "Schattingsbreedte", "Uitschuiflijn" en "Weergaveresultaten" in.
    5. Klik op' Ok'en gebruik 'Gemiddelde lijnbreedte'van de resultatentabel voor verdere analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het schatten van de mate van structurele rijping van CM, neonatale, volledig volwassen volwassen, en iPSC CM werden in eerste instantie gelabeld de CM met α-actinine antilichaam om het sarcomere netwerk te visualiseren. Na palm-acquisitie werden beelden gereconstrueerd en werd de dikte van de Z-disc gemeten met behulp van op plugin gebaseerde beeldverwerkingssoftware voor de automatische detectie van de breedte van individuele filamenten. Sarcomere lengte werd berekend door het meten van de afstand tussen twee aangr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De generatie van functionele iPSC-afgeleide CM in vitro is belangrijk voor regeneratieve therapieën, ziektemodellering en de ontwikkeling van drugscreeningplatforms. Echter, onvoldoende rijpheid van deze CM is een groot obstakel in cardiovasculair onderzoek20. In dit verband zijn beeldvormingstechnieken met hoge resolutie nodig die het mogelijk maken de structurele rijpingstoestand van iPSC-afgeleide CM te monitoren. Tegelijkertijd kan microscopie met superresolutie een waardevol hulpmiddel zijn o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Structuurfonds van de EU (ESF/14-BM-A55-0024/18). Daarnaast wordt H.L. ondersteund door het FORUN Programma van het Rostock Universitair Medisch Centrum (889001 en 889003) en de Josef and Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. wordt ondersteund door het Clinician Scientist Program van het Rostock University Medical Center. R.D wordt ondersteund door de DFG (DA1296/6-1), de DAMP foundation, de Duitse Hartstichting (F/01/12) en de BMBF (VIP+ 00240).

Wij danken Madeleine Bartsch voor haar technische ondersteuning in de iPSC celcultuur en hartdifferentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
human iPSC cell lineTakaraY00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottomibidi80827
0.5ml eppendorf tubeEppendorf30121023
Bovine serum albuminSigma AldrichA906
Cardiomyocyte Dissociation KitStem Cell Technologies05025
CatalaseSigma AldrichC40-1G
CyclooctatetraeneSigma Aldrich138924-1G
CysteamineSigma Aldrich30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Fiji image processing software (Image J)
GlucoseCarl RothX997.2
Hydrochloric acidSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1 systemZeiss
ParaformaldehydeMerck8187150100
Pyranose oxidaseSigma AldrichP4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]Abcamab9465
Sodium chlorideSigma AldrichS7653
sterile waterCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Trizma baseSigma AldrichT1503
β-MercaptoethanolSigma Aldrich63689

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331(2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275(2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Alpha actinine netwerkfoto geactiveerde lokalisatiemicroscopieanalyse van de sarcomeerlengtemeting van de Z schijfdiktebeoordeling van de rijping van cardiomyocytensuperresolutie imagingPALM beeldreconstructielokalisatie van fluorescerende moleculen

Gerelateerde artikelen