Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro preparatie van actief rijpende rundergewrichtskraakbeenexplantaten voor beeldvorming met röntgenfasecontrast

943 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61607

⸱

31 januari 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), 2Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, 3ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, 4Novitom, R&D Grenoble, 5ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bereiding van in vitro runderkraakbeen voor beeldvorming in hoge resolutie met röntgenstralen. Deze explantaten ondergaan actief postnatale rijping. We beschrijven hier de noodzakelijke stappen van de biopsie tot data-analyse van 3D röntgenfasecontrastbeeldvorming, via explantatiecultuur, weefselfixatie en synchrotronpreparatie.

Samenvatting

Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan postnatale rijping van gewrichtskraakbeen is van cruciaal belang voor het ontwerpen van de volgende generatie weefselmanipulatiestrategieën en het mogelijk herstellen van ziek of beschadigd kraakbeen. Over het algemeen vindt postnatale rijping van het gewrichtskraakbeen, een grootschalige verandering in de collageenstructuur en -functie van het weefsel om de groei van het organisme op te vangen, plaats over een tijdschaal van maanden tot jaren. Omgekeerd is het oplossen van de structurele organisatie van het kraakbeen, dat ook over lange tijdschalen optreedt, het kenmerk van weefseldegeneratie. Ons vermogen om deze biologische processen in detail te bestuderen is verbeterd door de bevindingen dat groeifactoren vroegrijpe in vitro rijping van onrijp gewrichtskraakbeen kunnen induceren. De ontwikkelings- en ziektegerelateerde veranderingen die in het gewricht optreden, hebben betrekking op bot en kraakbeen en het vermogen om deze weefsels samen in beeld te brengen, zou ons begrip van hun met elkaar verweven rollen aanzienlijk vergroten.

De gelijktijdige visualisatie van veranderingen in zacht weefsel, kraakbeen en bot is tegenwoordig een uitdaging die moet worden overwonnen voor conventionele preklinische beeldvormingsmodaliteiten die worden gebruikt voor de follow-up van gewrichtsaandoeningen. Driedimensionale röntgenfasecontrastbeeldvormingsmethoden (PCI) zijn al 20 jaar voortdurend in ontwikkeling vanwege de hoge prestaties voor het afbeelden van objecten met een lage dichtheid en hun vermogen om aanvullende informatie te verstrekken in vergelijking met conventionele röntgenbeeldvorming.

In dit protocol beschrijven we de procedure die in onze experimenten wordt gebruikt, van biopsie van het kraakbeen, het genereren van in vitro gerijpt kraakbeen tot gegevensanalyse van beelden verzameld met behulp van röntgenfasecontrastbeeldvorming.

Inleiding

Onrijp gewrichtskraakbeen is een adequate ondersteuning om morfologische, structurele en biomoleculaire veranderingen te initiëren1 om een volwassen gewrichtsspecifieke functie te verkrijgen. De belangrijkste verandering is de reorganisatie van collageenfibrillen van een fibrillen die een parallelle oriëntatie vertonen ten opzichte van het oppervlak in onrijp kraakbeen naar een waarbij fibrillen dieper in het weefsel loodrecht staan in rijp kraakbeen. Pseudo-stratificatie van volwassen kraakbeen komt tot uiting door de reorganisatie van residente chondrocyten in de richting van de oriëntatie van de collageenfibril, waarbij cellen aan het oppervlak schijfachtig en evenwijdig aan het oppervlak zijn, en in de diepere zones cellen die steeds groter worden en in kolommen worden georganiseerd. Het is bekend dat postnatale rijping gedurende vele maanden plaatsvindt en in wezen voltooid is aan het einde van de puberteit, men dacht dat de lange tijdschaal het bestuderen van deze belangrijke ontwikkelingsovergang op zijn best moeilijk of technisch onmogelijk maakte om in detail te bestuderen2. Er is enige vooruitgang geboekt in de oplossing voor dit probleem door de bevinding dat fibroblastgroeifactor-2 en transformerende groeifactor-β1 samen in staat zijn om belangrijke fysiologische en morfologische veranderingen te induceren die de rijping van gewrichtskraakbeen repliceren 2,3 (Figuur 1). Door groeifactor geïnduceerde in-vitrorijping vindt plaats binnen drie weken en vereist geen biomechanische input. Na kweek is de expressie van collageen type II aanzienlijk verminderd en neemt de verhouding tussen rijpe driewaardige en onrijpe tweewaardige collageencrosslinks toe, zoals te zien is bij rijpend kraakbeen. Ook ligt de organisatie van de extracellulaire matrix en collageenfibrillen dichter bij die van volwassen kraakbeen, hoewel dit facet van de overgang niet volledig is. Biochemisch gezien bootst de samenstelling van met groeifactor behandeld kraakbeen een volwassen gewrichtskraakbeen na3.

Het model dat in het artikel wordt gebruikt, is gebaseerd op een in vitro cultuur van explantaten met een diameter van 4 of 6 mm die onder steriele omstandigheden werden weggesneden uit het laterale aspect van het metacarpofalangeale gewricht mediale condylus van onvolgroeide mannelijke (7 dagen oude) runderossen. Een dunne laag verkalkt kraakbeen en subchondraal bot werd op het basale aspect van elke explantatie gehouden. Het gewrichtskraakbeen werd gekweekt in een klassiek serumvrij medium, Dulbecco's gemodificeerde Eagles-medium (hoge glucose 4,5 g/L) waarin insuline-transferrine-selenium (ITS), 10 mM HEPES-buffer pH 7,4, ascorbinezuur en 50 μg/ml gentamicine werden toegevoegd. Dit kweekmedium wordt aangevuld met 100 ng/ml fibroblastgroeifactor 2 (FGF-2) en 10 ng/ml transformerende groeifactor β1 (TGF-β1) die elke derde dag worden aangevuld met mediawisselingen2. Sterk versnelde rijping van het kraakbeen wordt geïnduceerd door groeifactoren te combineren. Deze veranderingen treden binnen 21 dagen op. Stimulatie van de groeifactor induceert bovendien apoptose en resorptie vanuit het basale aspect en cellulaire proliferatie in chondrocyten aan het oppervlak3. De samenstelling van het kweekmedium wordt beschreven in Tabel 1. In navolging van het model ontwikkeld door Khan et al. 20112worden gewrichtskraakbeenexplantaten gekweekt met TGF-β1 in een concentratie van 10 ng/μL en FGF2 in een concentratie van 100 ng/μL (voorraadconcentraties 10 μg/ml en 100 μg/ml opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing/0,1% BSA). Per 1 ml van het medium wordt 1 μL van elke groeifactor gebruikt. DMEM-F12 met L-glutamine en hoge glucose is een kunstmatig medium dat, eenmaal aangevuld met insuline, transferrine en selenium (ITS), ascorbinezuur, gentamicine en HEPES, een complete mediumaanvulling biedt met alle fysiologische groeivereisten die specifiek zijn voor de verschillende cellijnen en explantatenculturen. DMEM-F12 is samengesteld uit verschillende verschillende anorganische zouten (d.w.z. NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, NaH2PO4), glucose, aminozuren (stikstofbronnen), vitaminen, co-factoren en water. Die zouten zorgen voor voldoende energetische input om de cellulaire overleving en normale groei in cultuur te ondersteunen. De minerale ionen dragen bij tot het behoud van de osmolariteit dicht bij de natuurlijke fysiologische omgeving. De hogere glucoseconcentratie (4,5 g/L) wordt gebruikt als chondrocyten voornamelijk ademen door glycolyse. F12 medium suppletie wordt gebruikt omdat het een aantal bronnen van sulfaat, CuSO biedt4, FeSO4, ZnSO4 en MgSO4 Vereist voor de synthese van gesulfateerde glycosaminoglycaan. Zoals gecontroleerd door gekleurde indicatoren (hier fenolrood) en CO2/HCO-3 buffer in combinatie met fosfaten, blijft de pH constant op een waarde in de buurt van 7,4. De belangrijkste ademhalingsweg die door chondrocyten wordt gebruikt, is glycolyse, waarbij melkzuur het eindproduct is dat een verhoging van de pH veroorzaakt, daarom werkt HEPES, bij afwezigheid van biomechanische krachten die zouden helpen om lokaal geproduceerd melkzuur te verwijderen, om een gebufferde omgeving voor fysiologische processen te behouden. Gentamicine is een aminoglycoside-antibioticum dat externe bacteriële besmetting controleert door de groei te remmen. Ascorbinezuur wordt gebruikt als medium aanvulling vanwege de antioxiderende werking4. Ascorbinezuur is een co-factor voor enzymen, prolylhydroxylasen, die functioneren om prolineresiduen in collageen te hydroxyleren en de drievoudige spiraalvormige structuur te stabiliseren. De transferrine dient meestal als extracellulaire antioxidant (toxiciteit en ROS-vermindering)5,6. Het wordt ook aan het kweekmedium toegevoegd vanwege zijn vermogen om extracellulaire ijzeropslag en -transport in celcultuur te bieden en te vergemakkelijken. Transferrine bindt ijzer zo stevig onder fysiologische omstandigheden dat er vrijwel geen vrij ijzer bestaat om de productie van vrije radicalen te katalyseren7. Het insulinehormoon dat door de gebonden receptor wordt gesignaleerd, verhoogt de opname van verschillende elementen, zoals glucose en aminozuren. Het is ook betrokken bij verschillende processen, zoals intracellulair transport, lipogenese, eiwit- en nucleïnezuursyntheses. Insuline heeft een groeibevorderende werking. Selenium is bovendien aanwezig in de samengestelde oplossing "insuline-transferrine-selenium", als natriumseleniet. Het wordt voornamelijk gebruikt als cofactor voor (seleno-)eiwitten zoals gluthationperoxidase (GPX), als aanvullend antioxidant in de cultuur. In in vitro articulaire chondrocyten, ITS lijkt de cellulaire proliferatie en het behoud van het fenotype te verbeteren door de genexpressie te remmen die verband houdt met cellulaire dedifferentiatie en hypertrofische differentiatie8. Groeifactoren zoals fibroblastgroeifactor-2 en transformerende groeifactor-β1 worden aan het kweekmedium toegevoegd. Ze worden gebruikt om celdifferentiatie, groei, genezing en ontwikkeling te induceren en te reguleren2,3. FGF-2 en TGF-β1 in combinatie bevorderen ook krachtig de cellulaire proliferatie in gekweekte cellen en weefsels9.

Dit in vitro rijpingsmodel van gewrichtskraakbeen is om drie belangrijke redenen nuttig. Ten eerste stelt de versnelde ontwikkelingsfaseovergang in dit model ons in staat om onmerkbare veranderingen te bestuderen die zich gedurende vele maanden voordoen in in vivo modellen, zoals de verhoogde expressie van lysloxidase-L1 tijdens de rijping10. Ten tweede lijdt weefselmanipulatie van gewrichtskraakbeen onder het feit dat kraakbeen met een isotrope morfologie en structuur wordt geproduceerd die functioneel gebrekkig is wanneer het in gewrichten wordt getransplanteerd om focale defecten te herstellen. Begrijpen hoe rijpingsveranderingen kunnen worden veroorzaakt, zal de ontwikkeling van volledig functionele implanteerbare apparaten versnellen. Ten derde en relevant voor deze studie, zijn er degeneratieve gewrichtsaandoeningen zoals de ziekte van Kashin-Beck die optreden tijdens de kindertijd en die leiden tot ernstige gewrichtsmisvormingen op volwassen leeftijd. Deze specifieke ziekte is sterk geassocieerd met geografische gebieden (China) met endemische tekorten aan selenium en jodium die mogelijk tientallen miljoenen inwoners treffen 11,12,13. Onderzoek van skeletdefecten bij de ziekte van Kashin-Beck toont aan dat het peri-pubertaal optreedt, wat verstoring van de skeletrijpingsprocessen impliceert. Om de rol van selenium in gewrichtskraakbeen (AC) beter te begrijpen, is daarom een robuust model voor de groei en ontwikkeling van kraakbeen nodig. Een in vitro groeifactor-geïnduceerd rijpingsmodel biedt een nuttig startpunt voor studies naar de groei en het metabolisme van gewrichtskraakbeen tijdens de rijping in aan- of afwezigheid van seleniumionen 14,15,16. Onze kennis van de effecten van selenium (Se) deficiëntie op complexe en onderling gerelateerde biologische processen blijft zeer slecht. Het grootste probleem is dat selenium een element blijft om te bestuderen vanwege het beperkende werkingsbereik (vereiste concentratie tussen 40 en 400 μg/kg17) en de zeer lage concentratie die ermee gemoeid is. Het versnelde rijpingsmodel met onrijp runderkraakbeen biedt een ongekend vermogen om te kijken naar biologische veranderingen die optreden tijdens een belangrijke ontwikkelingsfase. De Se-concentratie in organismen wordt streng gecontroleerd en dit model is een startpunt voor de ontwikkeling van beeldvormingstechnieken die het mogelijk maken om het nauwkeurig te volgen tijdens de rijping. Deze technieken zouden dan een krachtig hulpmiddel kunnen zijn om strategieën te bestuderen om AC-degradatie te voorkomen en mogelijk de basis te ontwikkelen van nieuwe op regeneratieve geneeskunde gebaseerde therapieën.

Gelijktijdige visualisatie van veranderingen in zacht weefsel, kraakbeen en bot is een grote uitdaging in conventionele preklinische beeldvormingsmodaliteiten. Dit zou inderdaad een belangrijke hulp zijn voor de follow-up van gewrichtsaandoeningen18,19 . Conventionele röntgenmicrocomputertomografie (μCT) levert bijvoorbeeld slechte prestaties voor zacht weefsel, waardoor het gebruik ervan wordt beperkt tot de weergave van botdefecten, osteofyten en indirecte visualisatie van kraakbeen. Magnetic Resonance Imaging (MRI), aan de andere kant, wordt conventioneel gebruikt voor beeldvorming van zacht weefsel, ondanks het slechte vermogen om veranderingen in het bot (bijv. microverkalkingen) tijdens de beginfase van ziekten nauwkeurig weer te geven. Het vermogen om gevoelig te zijn voor botten en kraakbeen en om de constitutieve cellen van kraakbeen, chondrocyten, te onderscheiden, is van enorm belang. Phase Contrast Imaging (PCI) is gebaseerd op de eigenschap dat de röntgenbrekingsindex van materialen duizend keer groter kan zijn dan de absorptie-index voor lichte elementen. Dit genereert een hoger contrast voor zachte weefsels in vergelijking met de conventionele methoden op basis van de enige absorptie. Daarom is PCI in staat om alle weefsels waaruit het gewricht bestaat in beeld te brengen met gelijktijdige vertegenwoordiging van zowel sterk absorberende (bijv. botten) als minder absorberende weefsels (bijv. fibreus kraakbeen, ligamenten, pezen, meniscus en bijbehorende zachte weefsels (synoviale membranen en spieren)))18,19,20,21.

Zoals aangetoond in ref.20, presteert röntgen-PCI beter dan de andere preklinische beeldvormingsmodaliteiten voor kraakbeen. Het doel van dit protocol is om de procedure in detail te beschrijven en enkele representatieve resultaten te laten zien. Het schema van het effect van groeifactoren op onrijp kraakbeenexplantaat wordt weergegeven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Ethical Research Committee van Swansea University en biopsiemateriaal is verkregen onder licentie van het Department for Environment, Food & Rural Affairs (DEFRA), VK. Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van onze instellingen.

1. Culturen uitplanten

  1. Bereiding van de explantaten van de benen van runderen, de hoofdhuid
    1. Bereid absorberende beschermer en een scalpel voor, standaard chirurgisch scalpel met #10 scalpelmesje.
    2. Spuit alle materialen in met 70% ethanoloplossing.
    3. Week de runderpoot (7 dagen oude mannelijke runderossen die met goedkeuring van een dierenarts in het slachthuis zijn verkregen) met water om al het bloed en de modder te verwijderen.
    4. Reinig het been met zeep en schrob met een borstel.
    5. Als het voldoende schoon is, spuit het been dan met 70% ethanol.
    6. Leg het op een absorberend papier.
    7. Snijd rond de voeten met een scalpel.
    8. Trek een delicate lijn langs de lengte van het been.
    9. Wees extra voorzichtig in de gewrichtszone.
    10. Verwijder de huid van het been voorzichtig langs de scalpellijn in de lengte.
    11. Doe het afval (huid, gebruikt tissue, papier en handschoenen) in een klinische afvalzak.
    12. Reinig/borstel het been met zeep en steriliseer opnieuw met ethanol als de huid is verwijderd.
    13. Beschadig het gebied dicht bij de gewrichtsholte niet. Als de holte geopend of beschadigd is door bloedinfiltratie, is deze niet meer steriel en kan het been niet worden gebruikt.
    14. Plaats de bout in een Al-folie die besproeid is met 70% ethanol.
    15. Plaats de latexhandschoenen van de juiste maat over de uiteinden van het been om te voorkomen dat er bloed uit het proximale uiteinde komt of mogelijke besmetting van de hoef.
    16. Gooi de afvalstoffen op de juiste manier weg volgens de institutionele regels.
  2. Extractie en cultuur van explantaten
    OPMERKING: De explantaten moeten worden verkregen uit het interne deel van het gewricht (Figuur 2, twee eerste fasen). Om aan vergelijkbare omstandigheden te voldoen, moeten vier (of zes) explantaten uit dezelfde zone worden geponst om de vier (of zes) verschillende behandelingen toe te passen op monsters met bijna dezelfde vorm en kenmerken.
    1. Open de laminar flow hood 25 minuten voor gebruik, reinig met alcohol 70%.
    2. Zet de voedingsbodem op in een waterbad.
    3. Bereid een plaat met 24 putjes voor met 1,5 ml basisch medium, alleen DMEM-F12 (wasmedium) in elk putje.
    4. Bereid nog een putplaat voor met 1,5 ml volledig kweekmedium. Tot gebruik bewaren in een kweekbroedmachine bij 37 °C
    5. Bereid het materiaal voor op een rooster: een universele tube met 70% ethanol en een andere universele tube met wasmedium.
    6. Bereid een scalpel en een biopsiepons van 4 of 6 mm voor (geplaatst in de universele alcoholbuis).
    7. Leg de buizen en de materialen onder de motorkap.
    8. Leg een absorberende beschermer bespoten met 70% ethanol onder de motorkap.
    9. Bereid wat tissues voor die besproeid zijn met 70% ethanol.
    10. Neem een snijplaat, bedek deze met Al-folie.
    11. Haal dezelfde, vooraf bereide, pootjes uit de koelkast (4 °C) en besproei ze met 70% ethanol.
    12. Gooi gevaarlijke en klinische zakken weg in de buurt van de motorkap om het afval later te autoclaveren.
    13. Spuit de voet in met 70% ethanol.
    14. Beweeg het gewricht om de middellijn van het gewricht te vinden waar de incisie moet worden gemaakt. Doe dit onder de motorkap.
    15. Neem het steriele scalpel.
    16. Snijd voorzichtig langs de middellijn en volg de contouren van de voegranden. Raak het metacarpofalangeale gewricht mediale condyluskraakbeen niet aan.
    17. Snijd het ligament voorzichtig door wanneer het gewricht wordt geopend.
    18. Gooi het onderste deel van de voeten weg in een autoclaafzak.
    19. Verwijder alle andere weefsels om al het kraakbeen van het gewricht bloot te leggen (Figuur 2).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u niets met de voeten aanraakt.
    20. Plaats het scalpel en de biopsiepons in alcohol en vervolgens in het wasmedium.
    21. Maak wat cirkels met deze pons (4-5 per gezicht) met wat kracht langs de interne vlakken van de botten.
    22. Plaats de bio-punch in alcohol als je klaar bent om hem schoon te maken.
    23. Neem een scalpel en knip (trek een lijn) tussen elke cirkel en langs de centrale lijn van het bot.
    24. Om het kraakbeenexplantaat te verwijderen, snijdt u verticaal op een van de randen van de cirkelbiopsie en snijdt u vervolgens horizontaal heel voorzichtig op het subchondrale bot.
    25. Om het kraakbeenexplantaat te verwijderen dat horizontaal onder de clou langs het subchondrale bot en het verkalkte kraakbeen is gesneden, zullen de explantaten eruit springen.
      OPMERKING: Explantaten moeten, indien mogelijk, een uniforme dikte hebben.
    26. Plaats het plantmateriaal in de putplaat gevuld met 1,5 ml wasmedium.
      OPMERKING: Voer altijd experimentele controle en behandeling uit van explantaten die van dezelfde plaats in het gewricht komen.
    27. Controleer of de explantatie goed correct is georiënteerd. Het oppervlak van het explantaat moet naar boven gericht zijn en het subchondrale botgedeelte van het explantaat moet naar de bodem van de putplaat wijzen.
    28. Houd de putplaat gesloten tussen elke biopsie.
    29. Verwijder het wasmedium.
    30. Was opnieuw met wasmedium. Laat 2-3 uur in de was medium staan. Botresten, bloed heeft de tijd om in het medium naar buiten te vloeien.
    31. Breng de explantaten over in een nieuwe putplaat met het volledige kweekmedium. Let op: raak niets aan met de pipet.
    32. Controleer of de explantaten zich nog in de juiste positie bevinden (bot naar het onderste deel van de putplaat).
    33. Maak alles schoon en gooi het klinisch afval op de juiste plaats weg.
    34. Zodra de explantaten in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 in cultuur zijn gebracht, moet het explantatiekweekmedium om de twee dagen worden vervangen door een warm, vers medium om aan de uiteenlopende behoeften van de cellen/weefsels te voldoen. Controleer of de explantaten zich nog in de juiste positie bevinden (bot naar het onderste deel van de putplaat).
  3. Sample fixatie (optioneel)
    OPMERKING: Voer deze stap pas na het einde van de celcultuur uit, dus na 3 weken kweek. De explantaten hebben dan het rijpingsstadium bereikt.
    1. Was de explantaten met DMEM-F12 met een pipet onder de weefselkweekkap.
    2. Was de explantaten twee keer met PBS met een pipet onder de weefselkweekkap.
    3. Fixeer ze een nacht bij 4 °C door ze te weken in 10% NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline).
    4. Plaats de vaste explantaten in PBS in een microcentrifugebuisje
    5. Bewaar de explantaten bij 4 °C. Vaste explantaten kunnen tot 6 maanden in deze omstandigheden blijven.

2. Monstervoorbereiding voor de beeldvormingssessie

  1. Gebruik conische plastic tips van de juiste grootte (meestal 1 ml tip) met betrekking tot het monster en het gezichtsveld van de camera.
  2. Sluit de kegelpunt af (door deze met een vlam te verhitten) om een waterdichte monstercontainer te hebben.
  3. Vul de punt met PBS. Houd het monster vast met een pincet en steek het in de buis. Verwijder de luchtbel door langzaam te schudden.
  4. Monteer de buis op de tomografietafel en lijn deze uit door eenvoudige röntgenfoto's te maken.

3. Röntgenstraal fasecontrastbeeldvormingssessie

  1. Plaats de detector op 2,5 m van het monster
  2. Stel de röntgenfotonenergie in op 17 keV met behulp van een dubbel siliciumkristalsysteem binnen een Bragg-Bragg-geometrie.
  3. De Mount Imaging-detector bestond uit een wetenschappelijke CMOS-camera22 op een optiek met een resulterende isotrope voxelgrootte van 3,5 μm in het 3D-beeld.
  4. Gebruik een 60 μm dik Gadolinium Oxysulfide scintillatorscherm om de röntgenstraal om te zetten in zichtbaar licht
  5. Gegevensverzameling: Verkrijg 2000 projecties tijdens een 360°-scan van het monster met een belichtingstijd van 2 s voor elke projectie.
  6. Gebruik een algoritme voor het ophalen van fasen om het fasesignaal te extraheren zoals beschreven in ref.23. Het algoritme maakt gebruik van een a priori kennis van de complexe brekingsindexverdeling binnen het monster. De belangrijkste hypothese, die hier niet wordt geverifieerd, is dat er één materiaal is om te reconstrueren. In dit specifieke geval werd de verhouding tussen de breking en de absorptie-index vastgesteld op 1.200, wat experimenteel werd waargenomen als het beste compromis voor visualisatie van botten en kraakbeen.
  7. Gebruik het standaard algoritme voor CT-reconstructie met gefilterde backprojectie met behulp van een opensource, op Graphics Processing Unit (GPU) gebaseerde implementatie van de PyHST2-code24.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd een eenvoudige beeldvormingsopstelling op basis van propagatie gebruikt25 zoals geschetst in figuur 3. Bij op synchrotronvoortplanting gebaseerde beeldvorming verlicht een coherente röntgenstraal het object, wat aanleiding geeft tot ruimtelijk variërende faseverschuivingen19. Terwijl de röntgenstraal zich na het monster voortplant, genereert het vervormde golffront een karakteristiekpatroon. Door deze k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteerden een volledige studie van de monstervoorbereiding tot de beeldvisualisatie, inclusief de data-acquisitieprotocollen, voor de studie van in vitro snel rijpend gewrichtskraakbeen. De resultaten van een synchrotronbeeldvormingssessie toonden de goedheid van het model aan.

In het hier gepresenteerde model moeten enkele observaties en limieten worden vermeld. Deze "versnelde rijping" vindt plaats binnen 21 dagen na de teelt. Gedurende lange...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Auteurs bedanken de ESRF voor het leveren van in-house beamtime. De auteurs willen Eric Ziegler bedanken voor de wetenschappelijke discussies. Het beschreven PCI-experiment werd uitgevoerd op de bundellijn BM05 van de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, Frankrijk. CB bedankt Explora'doc Auvergne, Rhone Alpes en beurzen van de Universiteit van Swansea en de Université Grenoble Alpes voor het financieren van een deel van deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal : Biologische producten
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mLGibco by life technologies31331-028
Gentamicin Reagent Solution, 50 mg/mLGibco by life technologies15750-060
HEPES, special preparation, 1M, pH 7.5 gefilterdSigmaH-3375
ITS, Insulin-Transferrin-SeleniumGibco by life technologies51500-057
L-Ascorbic Acid-2-Phosphate, sesquimagnesium salf hydraat, 95%SigmaA8960-5G
Neutral Buffer Formalin (NBF)Sigma AldrichHT501128
fosfaat buffer oplossing (PBS) pH 7.4Gibco by life technologies10010023
Kweekapparatuur:
Absordent Protector,BenchkoteWhatmanTMCat No. 2300731,Polystereen gecoat, 460cm*50m
Accurpette VWR
Autoclaveerbare afvalzakVoor het weggooien van besmette plastic laboratoriummaterialen moet de hals open gelaten worden om stoompenetratie mogelijk te maken, Gevaarlijk Afval, STERILIN (witte zak)
biopsie ponsenMILTEX by KAIref 33-364 & 6 mm diameter
Klinisch afval voor alternatieve behandeling Medium Duty(UN-goedgekeurd gewicht 5kg, UN-afsluitmethoden, UN- SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (oranje zak)
Eppendorf buisjes0,5mL en 1,5 mL
Falcon buisjes15mL en 50 mL
vrij van detecteerbare RNase, DNase, DNA&Pyrogens 1000ul Bevelled Graduated, filtertipStarlab, TipOne (steriele)S1122-1830
vrij van detecteerbare RNase, DNase, DNA&Pyrogens 20µl Bevelled Graduated, filtertipStarlab, TipOne (steriele)S1120-1810
vrij van detecteerbare RNase, DNase, DNA&Pyrogens 200ul Bevelled Graduated, filtertipStarlab, TipOne (steriele)S1110-1810
IncubatorIncubator bij 37°C, bevochtigde atmosfeer met 5% CO2
Opticale microscoop
Pipette-boy25mL-, 10mL-, en 5mL steriele kunststof pipetten
Pipetten (25-10-5 ml)CellStar, Greiner Bio-one
Kunststof pincettenOxford InstrumentAGT 5230
Scalpel
TipsP1000, P200 en P10 met P1000, P200 en P10 tips (steriele)
Weefsel kweek kap
Vacuümpomp
Waterbad 37°C
putjesplaten12 & 24 putjesplaten
Beschermingsuitrusting:
gezichtsschild
handschoenen
labjas
veiligheidsbril
Data acquisitieapparatuur:
Fiji softwareopen source Software
PyHST reconstructie toolkitopen source Software

Referenties

  1. Little, C. B., Ghosh, P. Variation in proteoglycan metabolism by articular chondrocytes in different joint regions is determined by post-natal mechanical loading. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (1), 49-62 (1997).
  2. Khan, I. M., et al. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor β1 induce precocious maturation of articular cartilage. Arthritis and Rheumatology. 63 (11), 3417-3427 (2011).
  3. Khan, I. M., et al. In vitro growth factor-induced bio engineering of mature articular cartilage. Biomaterials. 34 (5), 1478-1487 (2013).
  4. Ascorbate in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/ascorbate.html (2020).
  5. McNulty, A. L., Vail, T. P., Kraus, V. B. Chondrocyte transport and concentration of ascorbic acid is mediated by SVCT2. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembrane. 1712 (2), 212-221 (2005).
  6. Clark, A. G., Rohrbaugh, A. L., Otterness, I., Kraus, V. B. The effects of ascorbic acid on cartilage metabolism in guinea pig articular cartilage explants. Matrix Biology. 21 (2), 175-184 (2002).
  7. Transferrin in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/transferrin.html (2020).
  8. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in Vitro. International Journal of Molecular Sciences. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  9. French, M. M., Athanasiou, K. A. Differentiation Factors and Articular Cartilage Regeneration. Topics in Tissue Engineering. Ashammakhi, N., Ferretti, P. , (2003).
  10. Zhang, Y., et al. Platelet-rich plasma induces post-natal maturation of immature articular cartilage and correlates with LOXL1 activation. Science Reports. 7 (1), 3699(2017).
  11. Schepman, K., Engelbert, R. H. H., Visser, M. M., Yu, C., De Vos, R. Kashin Beck Disease: More than just osteoarthrosis - A cross-sectional study regarding the influence of body function-structures and activities on level of participation. International Orthopedics. 35 (5), 767-776 (2011).
  12. Sudre, P., Mathieu, F. Kashin-Beck disease: From etiology to prevention or from prevention to etiology. International Orthopedics. 25 (3), 175-179 (2001).
  13. Allander, E. Kashin-Beck Disease. An analysis of Research and public health activities based on a bibliography 1849-1992. Scandinavian Journal of Rheumatology. 23 (99), 1-36 (1994).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm level high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), (2019).
  15. Bissardon, C. Role of Selenium in Articular Cartilage Metabolism, Growth and Maturation. , University of Swansea. Swansea (GB). Available from: https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01942169 (2020).
  16. Bissardon, C., Charlet, L., Bohic, S., Khan, I. Role of the selenium in articular cartilage metabolism, growth, and maturation. Global Advances in Selenium Research from Theory to Application - Proceedings of the 4th International Conference on Selenium in the Environment and Human Health, 2015. , (2016).
  17. Winkel, L. H. E., et al. Environmental selenium research: From microscopic processes to global understanding. Environment Science Technology. 46 (2), 571-579 (2012).
  18. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: From pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 87 (1034), 20130606(2014).
  19. Horng, A., et al. Cartilage and soft tissue imaging using X-rays: Propagation-based phase-contrast computed tomography of the Human Knee in comparison with clinical imaging techniques and histology. Investigative Radiology. 49 (9), 627-634 (2014).
  20. Labriet, H., et al. High-Resolution X-Ray Phase Contrast Imaging of Maturating Cartilage. Microscopy and Microanalysis. 24, S2 382-383 (2018).
  21. Rougé-Labriet, H., et al. X-ray Phase Contrast osteo-articular imaging: a pilot study on cadaveric human hands. Science Reports. 10 (1911), 41598(2020).
  22. Mittone, A., et al. Characterization of a sCMOS-based high-resolution imaging system. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (6), 1226-1236 (2017).
  23. Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206 (1), 33-40 (2002).
  24. Mirone, A., Brun, E., Gouillart, E., Tafforeau, P., Kieffer, J. The PyHST2 hybrid distributed code for high speed tomographic reconstruction with iterative reconstruction and a priori knowledge capabilities. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 324, 41-48 (2014).
  25. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: from pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 58 (1), 1-35 (2013).
  26. Vo, N. T., Atwood, R. C., Drakopoulos, M. Superior techniques for eliminating ring artifacts in X-ray micro-tomography. Optic Express. 26 (22), 28396(2018).
  27. Moo, E. K., Osman, N. A. A., Pingguan-Murphy, B. The metabolic dynamics of cartilage explants over a long-term culture period. Clinics. 66 (8), 1431-1436 (2011).
  28. Stender, M. E., et al. Integrating qPLM and biomechanical test data with an anisotropic fiber distribution model and predictions of TGF-β1 and IGF-1 regulation of articular cartilage fiber modulus. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (6), 1073-1088 (2013).
  29. Labriet, H., et al. 3D histopathology speckle phase contrast imaging: from synchrotron to conventional sources. Medical Imaging 2019: Physics of Medical Imaging. Bosmans, H., Chen, G. H., Gilat Schmidt, T. , (2019).
  30. Zdora, M. C., et al. X-ray Phase-Contrast Imaging and Metrology through Unified Modulated Pattern Analysis. Physics Review Letters. 118 (20), 203903(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Rijping van gewrichtskraakbeenin vitro kraakbeenpreparatiebovien kraakbeenexplantatentissue engineering strategie nanalyse van de collageenstructuurbeeldvorming van kraakbeen en botveranderingen bij ontwikkelingsziektenpreklinische beeldvormingsmodaliteitendriedimensionale beeldvorming

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.