Onderzoek naar de functie van het doelgen in een CD40 agonistisch antilichaam-geïnduceerd colitismodel met behulp van op CRISPR/Cas9 gebaseerde technologieën

Samenvatting

Hier beschrijven we de methodologie om een gen dat van belang is in het immuunsysteem uit te schakelen met behulp van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/CRISPR-geassocieerde endonuclease (Cas9)-gebaseerde technologieën en de evaluatie van deze muizen in een cluster van differentiatie 40 (CD40) agonistisch antilichaam-geïnduceerd colitismodel.

Samenvatting

Het immuunsysteem functioneert om mensen te beschermen tegen vreemde indringers zoals bacteriën en virussen. Aandoeningen van het immuunsysteem kunnen echter leiden tot auto-immuniteit, ontstekingsziekten en kanker. De inflammatoire darmziekten (IBD) - de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (CU) - zijn chronische ziekten die worden gekenmerkt door recidiverende darmontsteking. Hoewel IBD het meest voorkomt in westerse landen (1 op de 1.000), nemen de incidentincidenten over de hele wereld toe. Door middel van associatiestudies hebben onderzoekers honderden genen gekoppeld aan de pathologie van IBD. De uitgebreide pathologie achter IBD en het grote aantal potentiële genen vormen echter aanzienlijke uitdagingen bij het vinden van de beste therapeutische doelen. Bovendien introduceren de tools die nodig zijn om elke genetische associatie functioneel te karakteriseren veel snelheidsbeperkende factoren, zoals het genereren van genetisch gemodificeerde muizen voor elk gen. Om het therapeutisch potentieel van doelwitgenen te onderzoeken, is een modelsysteem ontwikkeld met behulp van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/CRISPR-geassocieerde endonuclease (Cas9)-gebaseerde technologieën en een cluster van differentiatie 40 (CD40) agonistisch antilichaam. De huidige studie toont aan dat CRISPR/Cas9-gemedieerde editing in het immuunsysteem kan worden gebruikt om de impact van genen in vivo te onderzoeken. Deze benadering is beperkt tot het hematopoëtische compartiment en bewerkt op betrouwbare wijze het resulterende gereconstitueerde immuunsysteem. CRISPR/Cas9-bewerkte muizen worden sneller gegenereerd en zijn veel goedkoper dan traditionele genetisch gemodificeerde muizen. Bovendien heeft CRISPR/Cas9-bewerking van muizen aanzienlijke wetenschappelijke voordelen in vergelijking met het genereren en fokken van genetisch gemodificeerde muizen, zoals het vermogen om doelen te evalueren die embryonaal dodelijk zijn. Door CD40 als modeldoelwit te gebruiken in het CD40 agonistische antilichaam-geïnduceerde colitismodel, toont deze studie de haalbaarheid van deze aanpak aan.

Inleiding

Auto-immuunziekten verwijzen naar aandoeningen waarbij het immuunsysteem van een patiënt zijn eigen cellen en organen aanvalt, wat resulteert in chronische ontsteking en weefselbeschadiging. Tot nu toe zijn bijna 100 verschillende soorten auto-immuunziekten beschreven, die 3-5% van de menselijke bevolking treffen¹. Veel van de auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematosus en IBD, missen effectieve behandelingen en vertonen aanzienlijke onvervulde medische behoeften. IBD treft momenteel alleen al in de VS ongeveer 1,5 miljoen mensen en is een verwoestende ziekte die wordt gekenmerkt door progressieve, aanhoudende en recidiverende darmontsteking zonder beschikbare remedie. Het ontrafelen van de onderliggende pathogenese en pathofysiologie is nodig om de nieuwe behandelings- en preventiestrategieën te leveren die IBD-patiënten nodig hebben ^2,3.

Meer dan 230 verschillende IBD-loci zijn geïdentificeerd door middel van genoombrede associatieanalyses (GWAS)⁴. Hoewel deze associaties nieuwe genen hebben opgehelderd die potentieel belangrijke spelers zijn in de belangrijkste mechanismen en routes van IBD, zijn slechts enkele genen van deze loci bestudeerd. Sommige genen zijn betrokken bij specifieke routes. De microbe-detectieroute is bijvoorbeeld in verband gebracht met nucleotide-bindend oligomerisatiedomein-bevattend eiwit 2 (NOD2); de autofagieroute is in verband gebracht met autofagie-gerelateerde 16 like 1 (ATG16L1), immuniteitsgerelateerde GTPase-familie M (IRGM) en caspase-rekruteringsdomeinlid 9 (CARD9); en de pro-inflammatoire route is in verband gebracht met interleukine (IL)-23-gedreven T-celresponsen⁴. Er zijn verschillende in vivo muismodellen gebruikt om genen die zijn geïdentificeerd via GWAS ^5,6 functioneel te karakteriseren.

Een van de belangrijkste modellen die worden gebruikt om de pathogenese van IBD ^7,8 te bestuderen, is het CD40-model van colitis, dat aangeboren immuun-darmontsteking induceert na injectie van een CD40-agonistisch antilichaam in immunodeficiënte (T- en B-cel) muizen. Voornamelijk gebruikt om de bijdrage van aangeboren immuniteit aan de ontwikkeling van IBD te onderzoeken, meestal macrofagen en dendritische cellen⁹, is het onduidelijk of ziekte kan worden geïnduceerd bij volledig immuuncompetente wildtype (WT) muizen. Naast diermodellen zijn ook genspecifieke hulpmiddelen nodig voor de functionele karakterisering van een gen, inclusief chemische verbindingen en biologische geneesmiddelen. Wat nog belangrijker is, genetisch gemodificeerde dieren zijn essentieel om de functie van een specifiek gen te onthullen. De strategieën die doorgaans worden gebruikt om genetisch gemodificeerde muizen - embryo-injectie en fokken - te maken, duren echter vaak meer dan een jaar en brengen aanzienlijke financiële kosten met zich mee. Dit snelheidsbeperkende proces vormt een belangrijke uitdaging in de zoektocht naar opheldering van de functies van de IBD-gerelateerde genen die door GWAS zijn geïdentificeerd.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een levensvatbaar alternatief voor het fokken van genetisch gemodificeerde muizen. Ten eerste, zoals weergegeven in het schema van figuur 1 , worden afstammingsnegatieve, stamcelantigeen1-positieve, receptortyrosinekinase Kit-positieve (afstammings-Sca1+c-Kit+ of LSK) cellen geïsoleerd uit het beenmerg van Cas9-knockin (KI)-muizen met een specifiek allel (CD45.2) om het volgen van immuuncellen van donorcellen mogelijk te maken. Vervolgens worden deze cellen blootgesteld aan lentivirussen met verschillende gids-RNA's (gRNA's) en een fluorescerende marker, violet-geëxciteerd groen fluorescerend eiwit (VexGFP), om het volgen van getransduceerde cellen mogelijk te maken. Twee dagen later worden VexGFP+-cellen gesorteerd en geïnjecteerd in dodelijk bestraalde ontvangende Ly5.1 Pep Boy-muizen, dit zijn C57Bl/6-muizen met het CD45.1-allel om het volgen van immuuncellen van de ontvanger mogelijk te maken. Twaalf weken later is het immuunsysteem volledig hersteld en kunnen de muizen worden opgenomen in in vivo modellen.

Naast het voordeel van kostenbesparingen en een snellere time-to-generation in vergelijking met het genereren en fokken van genetisch gemodificeerde dieren, is deze methodologie ideaal voor doelen die embryonaal dodelijk zijn, omdat deze specifiek gericht is op het hematopoëtische compartiment. Bovendien biedt dit systeem een haalbare aanpak voor doelen waarvoor geen instrumenten beschikbaar zijn, zoals een antilichaam. Samenvattend, om de tot nu toe beschreven uitdagingen aan te pakken, werd een in vivo CRISPR/Cas9-gebaseerd genoombewerkingsplatform ontwikkeld om snel genetisch gemodificeerde diermodellen te genereren 10,11,12,13,14. Deze studie toont aan dat darmontsteking bij WT C57Bl/6-muizen kan worden geïnduceerd door een CD40-agonistisch antilichaam. CD40 is een belangrijke regulator van de ziekte in dit model en werd daarom gebruikt als modeldoelwit om de op CRISPR/Cas9 gebaseerde knock-out en het verlies van genfunctie te valideren.

Protocol

Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, moeten worden goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de AbbVie IACUC.

1. Genereren van de benodigde lentivirussen en verkrijgen van donor- en ontvangerdieren

OPMERKING: De materiaaltabel bevat bron- en bestelnummergegevens voor alle dieren, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Construeer de plasmiden met behulp van een lentiGuide-puro-vector die is gewijzigd in VexGFP of mCherry.
   1. Kloon het vervormde niet-gerichte gRNA (SgNone) of CD40-gericht gRNA in de gemodificeerde vector.
      OPMERKING: In deze studie waren de sequenties voor elk gRNA als volgt: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; en SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Produceer de lentivirale deeltjes zoals eerder beschreven¹⁵.
      1. Co-transfecteren van de gRNA-coderende plasmiden in 293T-cellen met VSV-G- en pLEX-verpakkingsplasmiden.
      2. Verander het kweekmedium na 18 uur transfectie en verzamel de supernatanten die het virus bevatten na 24-48 uur na de mediumverandering.
      3. Om de efficiëntie van CD40 gRNA te evalueren, genereert u een CD40 stabiele 293T-cellijn door transfectie van een pcDNA3.1-plasmide dat codeert voor CD40.
   3. Transfecteer de cellen met behulp van de beschreven lentivirussen en evalueer ze twee weken later door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
      OPMERKING: Cas9 KI-muizen werden gebruikt als donormuizen. Zorg ervoor dat de Cas9 KI-muizen een C57Bl/6-achtergrond hebben (en het CD45.2-allel tot expressie brengen) bij gebruik van C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy-muizen (die het CD45.1-allel tot expressie brengen) als ontvangers, zodat GvHD wordt vermeden en om donor- en ontvangercellen te volgen.
2. Ontwerp het experiment. Gebruik voor genknock-out (KO) 3-6 gRNA's per gen. Bereid voor elk gRNA 20% extra ontvangende muizen voor om rekening te houden met dierverlies tijdens en na transplantatie.
   OPMERKING: Het CD40 agonistische antilichaam-geïnduceerde colitismodel vereist een minimum van 8 muizen per groep voor statistische powering. Daarom werden in deze studie 10 muizen per gRNA bereid. Het aantal muizen dat nodig is voor andere in vivo-modellen is afhankelijk van het gebruikte model.
3. Gebruik donor- en ontvangende muizen van hetzelfde geslacht die 8-12 weken oud zijn.
   OPMERKING: Muizen werden geëuthanaseerd volgens door de IACUC goedgekeurde richtlijnen met minimaal 5% isofluraan en bevestigd met cervicale dislocatie als secundaire methode.

2. Beenmergoogst en voorbereiding voor celsortering

1. Oogst met een tang en een schaar botten van elke donormuis (dijbeen, scheenbeen, opperarmbeen en ellepijp) en verwijder zorgvuldig zoveel mogelijk spieren/weefsel.
2. Prik met een naald van 23 g in de bodem van een microcentrifugebuisje van 0,6 ml en plaats het buisje in een centrifugebuisje van 1,5 ml. Maak 2 setjes per dier.
3. Snijd het ene uiteinde van de botten open en plaats 4-8 botten in de microcentrifugebuis met de open uiteinden naar het naaldgat van 23 G gericht.
   OPMERKING: Het aantal botten per buis is afhankelijk van het bot, bijv. 8 scheenbeen, opperarmbeen en ellepijp of 4 dijbenen passen.
4. Centrifugeer de buisjes (met de microcentrifugebuis van 0,6 ml met de botten in de centrifugebuis van 1,5 ml) bij 300 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
5. Gooi de microcentrifugebuis van 0,6 ml, die nu botten zonder merg bevat, weg, zodat alleen de centrifugebuis van 1,5 ml nu vol merg zit. Voeg 1 ml lysisbuffer van rode bloedcellen (met ammoniumchloride) toe aan elke centrifugebuis en suspendeer de celpellet opnieuw door te pipetteren. Incubeer 1 minuut bij RT. Herhaal de lysisstap indien nodig.
6. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 ml en voeg Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium en magnesium toe (minstens het dubbele volume van de celsuspensie) om de lysisbuffer te neutraliseren. Pelletcellen op 300 × g gedurende 5 min. Zuig het bovenstaande volledig op.
7. Laad een filter van 70 μm op een conische buis van 50 ml en filtreer de cellen erdoorheen met DPBS om de buis en het filter te wassen. Gooi het filter weg en tel de cellen.
   OPMERKING: Het gebruik van 30 donormuizen (12 weken oud) levert gemiddeld 200-300 × 10⁶ cellen op.

3. Celsortering om LSK-cellen te isoleren voor transductie

1. Resuspendeer de cellen geteld in stap 2.7 in magnetische celsortering (MACS) buffer (DPBS, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur, 0,5% runderserumalbumine, 10 μg/ml penicilline-streptomycine) in het gewenste volume (90 μL per 10⁷ cellen).
2. Voeg 10 μL CD117+ kralen toe per 10⁷ cellen. Meng goed, bescherm tegen licht en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
3. Bereid de MACS LS-kolom voor door de kolom in het magnetische veld te plaatsen en deze af te spoelen met MACS-buffer.
4. Was de cellen uit stap 3.2 met een geschikt volume MACS-buffer (minstens het dubbele van uw volume) en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 × g .
5. Zuig het bovenstaande volledig op. Resuspendeer de pellet zodat de uiteindelijke concentratie 10^{8 cellen is} in 500 μL MACS-buffer.
6. Breng de celsuspensie aan op de LS-kolom. Was 3 keer met 3 ml MACS-buffer.
   OPMERKING: Eén LS-kolom kan maximaal 10⁸ gelabelde cellen en 2 × 10⁹ cellen in totaal bevatten.
7. Verwijder de kolom uit de magneetscheider en plaats deze in een geschikte opvangbuis. Voeg 5 ml MACS-buffer toe en spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk weg door de zuiger stevig in de kolom te duwen.
8. Pellet de cellen op 300 × g gedurende 10 minuten. Zuig het bovenstaande volledig op.
9. Breng de cellen opnieuw in suspensie in 100 μL MACS-buffer per 10⁷ cellen en voeg de kleuringsantilichamen voor afstamming (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) en Sca-1 toe.
   OPMERKING: Het gebruik van 30 donormuizen (12 weken oud) levert gemiddeld 100-180 × 10⁶ cellen op.
10. Meng goed, bescherm tegen licht en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
11. Was de cellen door 5-10 ml MACS-buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 × g . Zuig het bovenstaande volledig op.
12. Resuspendeer tot 10⁸ cellen in 500 μL MACS-buffer
13. Filter de cellen met een celzeef van 70 μm en voer FACS uit voor de afstammings-Sca1+-populatie.
    OPMERKING: Ongeveer 1,8-2,6% van de bevolking moet afstamming-Sca1+ zijn.
14. Verzamel de cellen in LSK-kweekmedium (100 μL per 10.000 cellen): serumvrij expansiemedium, 100 ng/ml trombopoëtine, muisstamcelfactor, Fms-gerelateerd tyrosinekinase 3-ligand en IL-7 met 100 μg/ml penicilline-streptomycine.
15. Pelletcellen op 300 × g gedurende 10 min. Zuig het bovenstaande volledig op.

4. LSK-transductie en -cultuur om controle- en knock-outcellen te genereren

1. Resuspendeer de cellen in LSK-kweekmedium.
2. Zaai 10.000 cellen per putje in weefselkweekplaten met 96 putjes met platte bodem (TC) in LSK-kweekmedium.
3. Incubeer een nacht bij 37 °C met 5% CO₂ en 95% vochtigheid onder aseptische omstandigheden.
4. Bereid 50 μg/ml retronectineoplossing in DPBS en voeg 300 μl toe aan elk putje van een niet-TC-behandelde polystyreenplaat met 24 putjes. Incubeer een nacht bij 4 °C.
5. Gooi de volgende dag de retronectine-oplossing weg, spoel de gecoate plaat af met 300 μL DPBS en herhaal.
6. Breng 50.000 LSK-cellen over in 500 μL medium (5 putjes van de plaat met 96 putjes in stap 4.2) naar elk met retronectine gecoat putje van de polystyreenplaat met 24 putjes uit stap 4.4.Gebruik een extra 100 μL LSK-medium per 5 putjes om te spoelen en eventuele extra cellen te verzamelen die nog in de plaat met 96 putjes zitten. Zorg ervoor dat 600 μL het volume per putje in de plaat met 24 putjes is na deze stap (5 × 100 μL putjes van de plaat met 96 putjes + 100 μL die is gebruikt om die 5 putjes te wassen).
   OPMERKING: Kijk na het overbrengen onder een microscoop naar de nu lege plaat met 24 putjes om te bevestigen dat alle cellen zijn verzameld. Gebruik LSK-medium om cellen te verzamelen die niet zijn overgedragen om celverlies van deze kleine populatie te minimaliseren.
7. Voeg 300 μL virussupernatans toe aan elk putje en schud de plaat gedurende 5 minuten op een instelwaarde van 500. Draai de plaat 20 minuten rond op 600 × g en 37 °C. Gebruik minimaal 5 × 10⁶ virale deeltjes per ml.
   OPMERKING: In deze studie werd een vector gemodificeerd van pLentiPuro gebruikt, waarbij het puromycine-resistentie-element werd verwisseld met VexGFP. Het virus werd toegevoegd met een infectieveelvoud van 50-100.
8. Incubeer gedurende 1 uur. Voeg 500 μL voorverwarmd LSK-medium toe.
9. Incubeer gedurende 2 dagen bij 37 °C met 5% CO₂ en 95% vochtigheid onder aseptische omstandigheden.

5. Bestraling met dieren ter voorbereiding op implantatie van donorstamcellen

1. Bestraal de ontvangende dieren na 2 dagen incubatie tweemaal met 475 cGy met een interval van 4 uur. Plaats de dieren na de tweede bestralingsronde in geautocleerde kooien en behandel ze gedurende 12 weken als immunodeficiënte dieren. Muizen kregen verrijking, hydrogel en monitoring aan de zijkant van de kooi om ondersteunende zorg en interventie te bieden als dat nodig was. Muizen kunnen antibiotisch voedsel of water krijgen naast ondersteunende zorg- en interventiemethoden.
   NOTITIE. De bestralingsdoseringen kunnen verschillen afhankelijk van de verschillende bestralingstoestellen. Voer een dosistitratie van de bestralingspatroon uit om de beste dosering te bepalen. Doses tussen 700 en 1300 cGy voor C57Bl/6-muizen blijken effectief te zijn in verschillende literatuurvoorbeelden:¹⁷. Selecteer 3-4 doses in dit bereik en evalueer 5 muizen per dosis voor overleving en implantatie. Als de implantatie niet succesvol is of de stralingsdosis te hoog is, zullen de muizen niet langer dan 3 weken na de implantatie leven. Laat 4 weken na de implantatie de overlevende muizen bloeden om de implantatie door FACS te evalueren. We voeren retro-orbitale (RO) bloedafnames uit van ~50-100 μL per muis om de implantatie te evalueren. Muizen waren onder narcose (2-3% isofluraan) tijdens de afname en kregen oogglijmiddel en 1,0 ml subcutane zoutoplossing als ondersteunende zorg na RO-bloedafnames.

6. Celbereiding en injectie in doorstraalde recipiënte dieren

1. pipetter de cellen uit elk putje vanaf stap 4.9, houd de groepen gescheiden nu de cellen zijn getransduceerd met verschillende gRNA's, en pellet ze gedurende 10 minuten op 300 × g .
2. Resuspendeer de cellen in de MACS-buffer, filtreer met een zeef van 70 μm en sorteer de VexGFP+-populatie.
   OPMERKING: Ongeveer 10-15% van de cellen moet VexGFP+ zijn.
3. Pellet de cellen op 300 × g gedurende 10 minuten. Resuspendeer ze in Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing: 5.000 of meer cellen per muis in 200 μL.
   OPMERKING: HBSS is van niet-farmaceutische kwaliteit. U kunt ook overwegen om een steriele zoutoplossing van farmaceutische kwaliteit te gebruiken voor injectie.
4. Injecteer de cellen intraveneus 3 uur na de laatste bestralingsdosis.
   OPMERKING: Twaalf weken later hebben de muizen een volledig getransplanteerd immuunsysteem en kunnen ze worden opgenomen in in vivo modellen.

7. CD40 agonistisch antilichaam-geïnduceerd colitismodel bij wildtype muizen

LET OP: Weeg en beoordeel de dieren dagelijks. Bied ondersteunende zorg indien nodig: 1,0 ml onderhuidse natriumchloride-oplossing bij 10% gewichtsverlies of als ze uitgedroogd zijn. De positieve controle voor dit model is anti-p40 intraperitoneaal gedoseerd in een dosis van 25 mg/kg tweemaal per week vanaf dag -1.

OPMERKING: In deze studie omvatten experimentele groepen naïeve controlegroepen, voertuig (negatieve) controle en anti-p40 (positieve) controlegroepen. Samen controleren deze groepen het normale gedrag van het CD40 agonistische antilichaam-geïnduceerde colitismodel. Vector-, SgNone- en SgRNA-groepen: De vectorcontroles voor de gemeenschappelijke lentivirale vector, SgNone is een vervormde niet-gerichte gidscontrole en de SgRNA-groepen zijn de "behandelingsgroepen" met verminderde expressie van het doelgRNA.

1. Dag 0: Injecteer CD40-agonistisch antilichaam in een dosis van 10 mg/kg intraperitoneaal in DPBS bij alle dieren, behalve voor naïeve controle.
2. Dag 3 en 6: Voer video-endoscopie uit om de ziekteprogressie te evalueren zoals eerder beschreven¹⁶.
   1. Verdoof de muizen met 2-3% isofluraan. Bied thermische ondersteuning via het mechanisme van de interne anesthesiemachine en/of het externe warmtekussen tijdens het herstel.
   2. Zodra de muizen onder narcose zijn, dient u een DPBS-klysma (zonder calcium en magnesium) toe om de dikke darm voor te bereiden op endoscopie.
      OPMERKING: Er is ongeveer 1-2 ml nodig om een klysma uit te voeren.
   3. Na een klysma en onder narcose de muis naar de neuskegel van het anesthesieapparaat bewegen.
   4. Steek de endoscoop voorzichtig in de dikke darm, ga langzaam naar de proximale dikke darm terwijl u de camera gecentreerd houdt en de dikke darm opgeblazen met lucht (met behulp van de meegeleverde luchtpomp of bevestig een slang/spuit om handmatig op te blazen), trek dan langzaam de endoscoop terug en verzamel een video en afbeeldingen op 3 cm, 2 cm en 1 cm van de anus.
      OPMERKING: Om irritatie van de dikke darm tot een minimum te beperken, kan steriel glijmiddel aan de punt van de endoscoop worden toegevoegd.
   5. Scoor elk beeld afzonderlijk op basis van het vasculaire patroon en de verdikking van het slijmvlies zoals beschreven in Tabel 1. Combineer de scores van de 3 afbeeldingen per muis om aan elk dier een somscore toe te kennen.
3. Dag 7: Euthanaseer alle muizen door middel van een overdosis isofluraan of CO₂ -kamer, en verzamel zoveel mogelijk bloed door middel van een hartpunctie voor serum. Weeg de milt om splenomegalie te meten en verzamel voor flowcytometrie en verzamel de dikke darm voor histopathologie.
   OPMERKING: Formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselsecties van de dikke darm van muizen werden bereid en gebruikt voor immunohistochemie (IHC) zoals eerder beschreven door Wang et al¹⁹.

Resultaten

Volgens de hierboven beschreven procedure werden muizen gegenereerd die CD40-gericht gRNA tot expressie brachten. In week 2 waren B-cellen, CD11b+ macrofagen en CD11c+ dendritische cellen (DC's) geënt (Figuur 2). T-cellen hadden echter, zoals verwacht op basis van eerdere literatuur¹⁸, meer tijd nodig om volledig te enten en hadden 12 weken na de implantatie nodig om ~90% te bereiken (

Discussie

De hier getoonde resultaten introduceren een nieuw CRISPR/Cas9-gebaseerd genoombewerkingsplatform dat in staat is om de genfunctie in dit CD40 agonistische antilichaam-geïnduceerde colitismodel te onderzoeken. Celsortering verrijkte de pool van genetisch gemodificeerde LSK-cellen, wat resulteerde in een vermindering van meer dan 90% van de CD40-expressie binnen de gereconstitueerde dieren - in slechts 4 maanden. Bovendien had de verminderde expressie van CD40 in het immuunsysteem een die...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320