Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Niet-gelokaliseerde mechanische krachten, zoals trillingen en akoestische golven, beïnvloeden een breed scala aan biologische processen van ontwikkeling tot homeostase. Dieren gaan met deze prikkels om door hun gedrag aan te passen. Het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsmodificatie vereist kwantificering van neurale activiteit tijdens het gedrag van belang. Hier rapporteren we een methode voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met niet-gelokaliseerde trillingen van specifieke frequentie, verplaatsing en duur. Deze methode maakt de productie van goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen mogelijk met behulp van een akoestische transducer en kwantificering van opgeroepen calciumresponsen bij eencellige resolutie. Als bewijs van principe wordt de calciumrespons van een enkel interneuron, AVA, tijdens de ontsnappingsreactie van C. elegans op trillingen aangetoond. Dit systeem zal het begrip van neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan gedragsreacties op mechanische stimuli vergemakkelijken.
Inleiding
Dieren worden vaak blootgesteld aan niet-gelokaliseerde mechanische stimuli zoals trillingen of akoestische golven 1,2. Omdat deze stimuli de homeostase, ontwikkeling en voortplanting beïnvloeden, moeten dieren hun gedrag aanpassen om ermee om te gaan 3,4,5. De neurale circuits en mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gedragsverandering zijn echter slecht begrepen.
Mechanosensorisch gedrag in de nematode, Caenorhabditis elegans, is een eenvoudig gedragsparadigma, waarin wormen meestal gedrag veranderen van voorwaartse beweging naar een achterwaartse ontsnappingsreactie wanneer ze niet-gelokaliseerde trillingen tegenkomen6. Het neurale circuit dat aan dit gedrag ten grondslag ligt, bestaat voornamelijk uit vijf sensorische neuronen, vier paar interneuronen en verschillende soorten motorneuronen 7,8. Bovendien wennen wormen aan dergelijke mechanische stimuli na gespreide training met herhaalde stimulatie 9,10,11. Daarom vormt deze eenvoudige gedragsrespons een ideaal systeem om neurale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan zowel niet-gelokaliseerd trillingsgevoed gedrag als geheugen. Een protocol voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende wormen onder invloed van niet-gelokaliseerde trillingen wordt geïllustreerd. In vergelijking met eerder gerapporteerde systemen is dit systeem eenvoudig omdat het geen extra camera nodig heeft voor tracking; het stelt ons echter in staat om de frequentie, verplaatsing en duur van niet-gelokaliseerde trillingen te veranderen. Omdat activering van de AVA-interneuronen de achterwaartse ontsnappingsrespons induceert, werden wormen die GCaMP, een calciumindicator, co-expressie geven, en TagRFP, een calciumongevoelig fluorescerend eiwit, onder controle van een AVA-specifieke promotor als voorbeeld gebruikt (zie Tabel met materialen voor details). Het protocol demonstreert de activering van AVA-neuronen als een worm overschakelt van voorwaartse naar achterwaartse beweging. Dit protocol vergemakkelijkt het begrijpen van het neurale circuitmechanisme dat ten grondslag ligt aan mechanosensorisch gedrag.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Teelt van wormen tot calciumbeeldvorming
- Breng vier dagen voor een calciumbeeldvormingsexperiment twee volwassen ST12-wormen over naar een nieuwe nematodengroeimedium (NGM) -plaat (Table of Materials) waarop Escherichia coli OP50 in een vierkant patroon (ongeveer 4 mm x 4 mm) zijn gestreept met behulp van een celverspreider, zodat de worm het grootste deel van de tijd in de bacteriën doorbrengt tijdens calciumbeeldvorming12.
- Incubeer deze NGM-plaat gedurende 4 dagen bij 20 °C in een incubator (Table of Materials).
2. Hardware instellen
- Bereid een microscoop voor die is uitgerust met een piëzo-elektrisch apparaat voor stimulatie13, een 2x objectieflens, een snelle sCMOS-camera, beeldsplitsingsoptiek, een x-y gemotoriseerd podium, een LED-lichtbron voor excitatie en een computer (figuur 1). Essentiële specificaties van de sCMOS-camera omvatten 2560 x 2160 actieve pixels, 6,5 μm groot, met een 10-tap cameralink als interface-optie. Belangrijke specificaties van de X-Y gemotoriseerde trap zijn 110 mm x 75 mm rijbereik, 250 mm/s maximale snelheid, 2.000 mm/s2 maximale versnelling en 0,25 μm unidirectionele herhaalbaarheid.
- Schakel de computer en de x-y gemotoriseerde stage controller in.
- Zet de versterker aan en stel de volumeregelaar in op 10 en de bas- en treble-instellingen op 8.
- Om GCaMP en TagRFP te prikkelen, schakelt u de 488 nm- en 560 nm-lampjes van de LED-lichtbron in. Stel de meters van 470 nm en 550 nm van de regeleenheid in de lichtbron in op 5%, zodat de intensiteit van het LED-licht geschikt is voor beeldvorming.
OPMERKING: Bij deze LED-intensiteit treedt tijdens de opname geen fotobleaching van GCaMP- en TagRFP-fluorescentie op.
3. Software-installatie voor calciumbeeldvorming
- Download en installeer drie softwarepakketten in Windows: muismacrosoftware, software voor het regelen van trillingseigenschappen, software voor het uitvoeren van trackingsoftware en software voor gegevensanalyse (Tabel met materialen).
- Dubbelklik op het trackingsoftwarebestand.
- Druk op de knop Uitvoeren en wacht 5 minuten om de software te stabiliseren (afbeelding 2A).
- Geef de informatie over blootstellingstijd en binning. 0,033 s belichtingstijd met 2 x 2 binning zorgt voor een vloeiende beeldacquisitie (figuur 2B).
OPMERKING: Alleen elke10e verkregen afbeelding wordt weergegeven om de geheugenbelasting te verminderen. - Geef de informatie voor beeldacquisitie (figuur 2C). Wanneer bijvoorbeeld twee keer 500 afbeeldingen worden opgenomen met een interval van 10 s, voert u 1.000 in het vak Afbeeldingen totaal, 500 in het vak Afbeeldingen en 10 in het vak Interval (s).
- Schakel de acquisitieknop in (afbeelding 2D).
- Splits het fluorescentiebeeld met behulp van beeldsplitsingsoptiek en de twee afbeeldingen (GCaMP-kanaal, 500-525 nm (figuur 2E); TagRFP-kanaal, 584-676 nm (figuur 2F)) worden geprojecteerd op twee helften van de sCMOS-camera. Kalibreer de coördinaten van de GCaMP- en TagRFP-kanalen (figuur 2G). Sla de software-instellingen op.
- Stel de map in om het gegevensbestand uit te voeren (afbeelding 2H).
- Schakel de acquisitieknop uit (afbeelding 2D).
- Dubbelklik op de muis macrosysteemsoftware (figuur 3A) en stel de trillingseigenschappen in (figuur 3B). Lees het assay.txt bestand met het muismacrosysteem, zodat de muiscursor wordt bestuurd op basis van de coördinaten en het schema in dat bestand (figuur 3A). Stel de coördinaten van de muiscursor in (magenta-vierkanten in figuur 3A) en wacht tot de stimulatie na het starten van de opname (magenta in figuur 3A). Stel de frequentie en de amplitudewaarden in de software in voor trillingsregeling (figuur 3B).
4. Voorbereiding van wormen voor calciumbeeldvorming
- Breng een enkele worm die zowel GCaMP als TagRFP tot expressie brengt over van de geïncubeerde plaat naar een nieuwe verse NGM-plaat waarop E. coli OP50 is gestreept.
- Bevestig de NGM-plaat met transparant plakband aan de piëzo-elektrische akoestische transducer (figuur 4). Druk de plaat niet op de actuator omdat dit de trillingsfrequentie verandert.
5. Calciumbeeldvorming onder controle van specifieke trillingseigenschappen
- Schakel de acquisitieknop in (afbeelding 2D).
- Zoek de worm onder fel licht en excitatielicht (488 nm en 560 nm).
- Stel de zoomwaarde van microscopie in op 2,5x. Het gezichtsveld is 1,1 mm x 1,1 mm met een resolutie van 2,6 μm/pixel.
- Schakel het felle licht uit en schakel de Homing-knop in (figuur 2I) om de fluorescerende vlek van een worm te volgen. Deze homing-knop start de beweging van de X-Y-fase om het maximale intensiteitsgebied van de worm in het midden van het gezichtsveld in de TagRFP-afbeelding te houden.
OPMERKING: In termen van de flp-18 promotor is de fluorescerende intensiteit van de AVA-neuronen het sterkst en die van andere neuronen zijn zwak of niet gedetecteerd. Daarom is het lage vergrotingssysteem niet vereist voor het volgen en beweegt het podium gedurende de opname. - Zorg ervoor dat de waarden van de intensiteitsbalken in figuur 2E en 2F ongeveer 1.000 zijn. Als dat niet het geval is, verfijn dan de 470 nm en 550 nm meters van de bedieningseenheid in de lichtbron.
- Druk op de knop Uitvoeren in het muismacrosysteem om muiscursorbesturing mogelijk te maken volgens een schema dat wordt beschreven in Figuur 3A. Dit begint te registreren met behulp van de trackingsoftware en wordt gestimuleerd door golfgensoftware tijdens het volgen van de worm.
- Controleer of het BMP-uitvoerbestand op de juiste manier is gemaakt.
6. Data-analyse
- Maak een map op het bureaublad en noem deze CalciumImaging.
- Maak een map in de map CalciumImaging en noem deze CIResult voor de uitvoerresultaatbestanden.
- Dubbelklik op het bestand DualViewImaging.nb geschreven in data-analysesoftware voor Windows.
- Voeg het bestandspad in de map CIResult in (bijv. DirectoryNaam[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Afbeelding 5).
- Voeg het bestandspad naar de map in, inclusief het BMP-bestand (bijvoorbeeld SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Afbeelding 5), waarin XXX de mapnaam aangeeft, inclusief BMP-bestanden.
- Druk tegelijkertijd op de Shift - en Return-toetsen om een automatische analyse te starten. Deze analyse gebruikt de waarde van een maximale intensiteitsgebied van het gezichtsveld in de TagRFP-afbeelding (zie de legenda van figuur 6 voor een gedetailleerde berekeningsprocedure in het programma).
- Controleer of de volgende uitvoerbestanden op de juiste manier zijn gemaakt in de map CIResult.
XXX-GCaMP.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van GCaMP-intensiteiten voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-GCaMP.xls (spreadsheetbestand met GCaMP-intensiteiten in alle afbeeldingen)
XXX-TagRFP.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van intensiteiten van TagRFP voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-TagRFP.xls (spreadsheetbestand met TagRFP-intensiteiten in alle afbeeldingen)
XXX-Ratio.tif (afbeeldingsbestand dat sporen van de verhoudingswaarde voor alle afbeeldingen illustreert)
XXX-Ratio.xls (spreadsheetbestand met de verhoudingswaarde in alle afbeeldingen)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier wordt een worm die zowel GCaMP als TagRFP tot expressie brengt onder controle van de AVA interneuron-specifieke promotor gebruikt als een voorbeeld van calciumbeeldvorming bij vrij gedragende C. elegans. GCaMP- en TagRFP-kanaalgegevens werden verkregen als een reeks afbeeldingen, waarvan sommige worden weergegeven in figuur 6 en als een film (aanvullende film 1). De verplaatsing van de petriplaat geïnduceerd door ons niet-gelokaliseerde trillingssysteem (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Over het algemeen vereist de kwantificering van neurale activiteit de introductie van een sonde en / of beperkingen op de beweging van het lichaam van dieren. Voor studies van mechanosensorisch gedrag vormen de invasieve introductie van een sonde en beperkingen zelf echter mechanische stimuli. C. elegans biedt een systeem om deze problemen te omzeilen, omdat de kenmerken ervan transparant zijn en omdat het een eenvoudig, compact neuraal circuit heeft dat slechts 302 neuronen omvat. Door deze voordelen te combine...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken het Caenorhabditis Genetics Center voor het leveren van de stammen die in deze studie worden gebruikt. Deze publicatie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grantnr. JP18H02483), over innovatieve gebieden "Science of Soft Robot" project (Grant nr. JP18H05474), de PRIME van het Japan Agency for Medical Research and Development (subsidienummer 19gm6110022h001) en de Shimadzu foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gegevensanalysesoftware | |||
| DualViewImaging.nb | auteur | Voor analyse van verworven gegevens | |
| Mathematica12 | Wolfram | Voor het uitvoeren van gegevensanalysesoftware DualViewImaging | |
| Escherichia coli en C. elegans stammen | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Voedsel voor C. elegans. Uracil auxotroof. E. coli B. |
| lite-1(ce314) stam | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Lichtinsensitive mutant |
| lite-1(ce314) stam die NLS-GCaMP-NLS en TagRFP tot expressie brengt onder controle van de AVA-specifieke promotor | auteur | ST12 | lite-1(ce314) mutant met de genen die NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nucleair lokalisatie signaal) en TagRFP tot expressie brengen onder controle van de flp-18 promotor als een extrachromosomale arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | Voor het kwantificeren van frequentie en verplaatsing gegenereerd door de akoestische transducer |
| Muis macro systeem | |||
| Assay.txt | Auteur | Script voor tijdelijk en speciaal controleren van muiscursor in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Gratis downloadsoftware voor het besturen van de muiscursor op basis van een script |
| Nematodengroeimediaplaat | |||
| Gezuiverde agar, poeder | Nakarai tesque | 01162-15 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Calciumchloride | Wako | 036-00485 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| di-Fosforiumwaterstoffosfaat | Nakarai tesque | 28727-95 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| LB bouillon, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Voor de kweek van E. coli OP50 |
| Magnesiumsulfaat watervrij | TGI | M1890 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat | Nakarai tesque | 28720-65 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Natriumchloride | Nakarai tesque | 31320-05 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Petrischalen (60 mm) | Nunc | 150270 | Voor de bereiding van NGM-platen |
| Niet-gelokaliseerde vibratieapparaat | |||
| Versterker | LEPY | LP-A7USB | Voor stimulatie met beheersbare vibratie |
| Akoestische transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | Voor stimulatie met beheersbare vibratie |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Gratis downloadsoftware voor het beheersen van de vibratie-eigenschappen |
| Niet-invasieve calciumbeeldvorming | |||
| 2-kanaals tafelmodel 3-fase borstelloze DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatibele controller voor MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dubbelband bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | Voor het verkrijgen van beelden in twee kanalen (GCaMP en TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dubbel-edge standaard epi-fluorescentie dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Voor het verkrijgen van beelden in twee kanalen (GCaMP en TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine enkelband bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | Voor het verkrijgen van beelden in twee kanalen (GCaMP en TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine enkelband bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | Voor het verkrijgen van beelden in twee kanalen (GCaMP en TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows 7 met Intel Xeon CPU ES-2630 en 8 GB RAM |
| Snel bewegende x-y gemotoriseerde stage | Thorlabs | MLS203-1 | Snelle XY scannning stage |
| Beeldsplitsende optica | Hamamatsu photonics | A12801-01 | Voor het verkrijgen van beelden in twee kanalen (GCaMP en TagRFP) gegenereerd door W-VIEW GEMINI beeldsplitsende optica |
| LED-lichtbron | CoolLED | pE-4000 | Voor het genereren van 470 nm en 560 nm opwekkingslicht |
| Microscoop | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objectieflens | Olympus | MVPLAPO2XC | Werkafstand 20 mm en numerieke apertuur 0,5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | auteur | pKDK66 | Co-injectiemarkering |
| pTAK83 plasmid | auteur | pTAK83 | Plasmid voor expressie van TagRFP onder controle van de flp-18 promotor |
| pTAK144 plasmid | auteur | pTAK144 | Plasmid voor expressie van NLS-GCaMP5G-NLS onder controle van de flp-18 promotor |
| Volgsoftware |
Referenties
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88(2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
