GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Samenvatting

We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.

Samenvatting

Veel menselijke neurologische aandoeningen worden veroorzaakt door degeneratie van neuronen en gliacellen in de hersenen. Vanwege beperkingen in farmacologische en andere therapeutische strategieën is er momenteel geen remedie beschikbaar voor de gewonde of zieke hersenen. Celvervanging verschijnt als een veelbelovende therapeutische strategie voor neurodegeneratieve aandoeningen. Tot op de dag van vandaag zijn neurale stamcellen (NSC's) met succes gegenereerd uit foetale weefsels, menselijke embryonale cellen (ES) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een proces van dedifferentiatie werd geïnitieerd door activering van het nieuwe menselijke GPI-gebonden glycoproteïne, wat leidt tot de generatie van pluripotente stamcellen. Deze van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) onderscheiden in vitro in cellen met een neuraal fenotype, zoals blijkt uit brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie. Ultrastructurele analyse van deze cellen door middel van elektronenmicroscopie bevestigt hun primitieve structuur, neuronale morfologie en subcellulaire kenmerken.

Inleiding

De ontwikkeling van basis- en preklinische stamcelonderzoeksmethoden stimuleert de klinische toepassing van stamcelgebaseerde therapieën voor neurologische ziekten. Een dergelijke potentiële therapie hangt kritisch af van de methode voor het genereren van menselijke neurale cellen die leidt tot functioneel herstel¹.

Neurale stamcellen (NSC's) vernieuwen zichzelf en differentiëren zich gedurende het hele leven in nieuwe neuronen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Alleen zeer beperkte hersengebieden herbergen NSC's die bevoegd zijn om pasgeboren neuronen op volwassen leeftijd te genereren. Dergelijke NSC's kunnen aanleiding geven tot volwassen neuronen, die betrokken zijn bij leren en geheugen, waardoor verloren of beschadigde neuronen worden vervangen. Helaas zijn deze NSC's in beperkte hoeveelheden aanwezig en neemt deze beperkte neurogenese snel af tijdens de ontwikkeling van de juveniele^{ontwikkeling 2}. Daarom moeten andere bronnen van neurale cellen worden overwogen in een celtherapiedoelstelling.

Degeneratieve neurologische ziekten zijn moeilijk te genezen met behulp van standaard farmacologische benaderingen. Nieuwe therapeutische strategieën voor het omarmen van veel immedicable neurologische aandoeningen zijn gebaseerd op celvervangende therapieën van ziek en gewond weefsel. NSC-transplantatie kan beschadigde cellen vervangen en gunstige effecten hebben. Andere bronnen voor neurale celvervanging zijn menselijke embryonale stamcellen (ESC), die zijn afgeleid van de binnencelmassa van zoogdierblastocysten³, evenals iPSC's⁴, die een uitgebreid zelfvernieuwingsvermogen hebben zoals ESC's en in staat zijn om zich te onderscheiden in verschillende cellijnen. NSC's kunnen ook worden gegenereerd door directe herprogrammering van menselijke fibroblasten die pluripotente toestand vermijden⁵.

Celvervangingstherapie is nog steeds een uitdagend probleem. Hoewel ESC, foetale of iPS een bron kan zijn voor het genereren van neuronale cellen voor de behandeling van veel ongeneeslijke neurologische ziekten, is autologe volwassen SCs-celvervanging van beschadigde weefsels een beter alternatief dat immunologische, ethische en veiligheidsproblemen omzeilt.

Activering van humaan GPI-gebonden eiwit door antilichaam-crosslinking via fosforylering van PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initieert een dedifferentiatie van bloedvoorlopercellen en degeneratie van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's)⁶. Deze cellen onderscheiden in vitro naar neuronale cellen zoals bevestigd door middel van brightfield, immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

In dit werk beschrijven we de GM-vrije generatie van BD-PSC's en hun succesvolle herdifferentiatie in cellen met neuronaal fenotype.

Protocol

Ethische goedkeuringen werden verkregen bij het uitvoeren van de experimenten.

1. Isolatie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNCs)

1. Zorg ervoor dat alle donoren geïnformeerde toestemming hebben ondertekend voordat het bloed zich terugtrok in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
2. Neem 30 ml bloed van gezonde donoren door opgeleid medisch personeel volgens het standaardprotocol.
3. Isoleer PBMNCs op dichtheidsgradiëntmedia. Gebruik 10 ml media met 25 ml 1:1 bloed verdund met fosfaatbufferoplossing (PBS) en centrifugeer gedurende 30 minuten op 300 x g.
4. Isoleer de interfaselaag tussen het plasma en de dichtheidsgradiëntmedia door pipetten. Was de geïsoleerde cellen met 5 ml steriel PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g. Herhaal dit tweemaal.
5. Tel het aantal cellen met standaardmethoden met behulp van een telkamer.

2. Activering van humaan GPI-verankerd glycoproteïne door kruiskoppeling van antilichamen op het oppervlak van PBMNCs

1. Plaats de 6 x 10⁶ mononucleaire cellen (MNC's) in buizen van 15 ml en voer kruiskoppeling van antilichamen uit door de cellen gedurende 30 minuten te incuberen met humaan GPI-gebonden membraaneiwitspecifiek antilichaam (30 μg/ml) in PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) bij 37 °C.
2. Vervang incubatiemedium door Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS).
3. Kweek cellen in polystyreenbuizen van 15 ml, plaats de buizen in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 8-10 dagen (zonder schudden). Voeg op D5 een extra 1-2 ml iscove's medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke buis van 15 ml.

3. Sorteren van nieuw gegenereerde gedifferentieerde cellen

1. Tel cellen met een geautomatiseerde celteller (18 μL celsuspensie + 2 μL fluorescentiekleurstof) of in een telkamer.
2. Centrifugeer gekweekte celsuspensie (5-7 x^{10 6}) bij 300 x g gedurende 10 minuten en aspireer het resulterende supernatant met een steriele Pasteur pipet.
3. Hang de celkorrel opnieuw op in 90 μL voorgekoelde PBS pH 7,2, 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
4. Voeg CD45 positieve nanogrote magnetische kralen (80 μL) toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
5. Was de cellen door 2 ml PBS-buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.
6. Sgroeper de cellen opnieuw in 500 μL PBS-buffer.
7. Was de kolom met 500 μL voorgekoelde PBS-buffer en plaats deze in het magnetisch veld.
8. Plaats de celsuspensie op de kolom en was deze met 500 μL PBS-buffer (twee keer) en de centrifugestroom met CD45-negatieve cellen. Verzamel ze in het medium van Iscove aangevuld met 1% BSA.
9. Tel de cellen in de telkamer.

4. Celkweekgerechten voorbereiden voor neuronale differentiatie van nieuw gegenereerde stamcellen

1. Bedek de kweekvaten met poly-L-ornithine en lag voor het kweken van neuronale cellen.
2. Plaats de glasafdekkingslips in 4-putplaten en bekleed deze met 1:5 verdunde poly-L-ornithine (0,1 mg/ml in ddH₂O) in ddH₂O. Plaats de afdeklips gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Was vervolgens met ddH₂O.
3. Ontdooi langzaam lag (0,5-2,0 mg/ml) en voeg toe aan de bovenkant van de afdeklips. Incubeer het bij 37 °C gedurende 2 uur.
4. Bereid neurale inductiemedium N2 voor bestaande uit 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-supplement, 400 μL niet-essentiële aminozuren (NEAA), basisch FGF-oplossing bij 20 ng/ml eindconcentratie (bereid uit 100 μg/ml stamoplossing) en heparine bij 2 ng/ml eindconcentratie.
5. Verwijder overtollige lag door pipetten en voeg neuronaal medium N2 toe aan kweekgerechten.

5. Cultivering van neuronale gedifferentieerde bloedcellen

1. Kweek BD-afgeleide CD45 negatieve cellen op laminine/ornithine-gecoate glasafdekkingslips gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ in N2-medium om een neuronale differentiatie van nieuw BD-gegenereerde cellen te initiëren.
2. Kweekcellen verder in neuronaal differentiatiemedium bestaande uit 48 ml neurobasaal medium, 500 μL L-glutamine, 1 ml B27-supplement, 500 μL NEAA, 50 μL recombinante menselijke glial-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) bij 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA, en 50 μL recombinante humane hersen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL van recombinante humane hersenafwisselingsfactor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniët (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinale neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtum neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtatie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 Plaats platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂.

6. Immunofluorescentiemicroscopieanalyse van bloedafname neurale cellen

1. Kweek de cellen zoals hierboven beschreven gedurende 16 dagen en verwijder de media.
   1. Incubeer met voorverwarmd fixatief bestaande uit 75 ml steriel water, 4 g paraformaldehyde. Voeg indien nodig 10 N NaOH toe en roer tot de oplossing op is. Voeg vervolgens 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl_2, 2 ml 0,5 m EGTA en 4 g sacharose toe. Titreer tot pH 7,4 met 6 N HCl en breng tot 100 ml steriel water gedurende 15 minuten, volgens Marchenko et al.⁷.
   2. Gooi het fixatief weg en was de cellen elke keer 3 keer gedurende 5 minuten. Voeg onmiddellijk een vers gemaakte 0,3% Triton X-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten. Was 3 keer met PBS en voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5% BSA toe.
   3. Blokkeer de cellen bij kamertemperatuur op een schommelplaat gedurende 1 uur.
   4. Bereid de juiste verdunning van antilichamen voor in 1% BSA/PBS en incubeer de cellen met antilichaamverdunningen op de tuimelplaat gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten, incubeer de cellen met DAPI en monteer de afdeklips met montagemedia voor visualisatie op een microscoop.
      OPMERKING: Direct gelabelde antilichamen die in dit experiment worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen.

7. Transmissie elektronenmicroscopie analyse van nieuw gegenereerde cellen

1. Zaai de cellen voor TEM in 8-well chamber slides.
2. Bevestig de cellen in 3,5% glutaraldehyde gedurende 1 uur bij 37 °C, postfixeer in 2% OsO₄ gedurende een extra uur bij kamertemperatuur en bevlek in 2% uranylacetaat in het donker bij 4 °C gedurende 2 uur en 30 min.
3. Spoel ten slotte de cellen af in gedestilleerd water, dehydrateer het in ethanol en sluit het 's nachts in epoxyhars in. Breng de volgende dag de monsters gedurende 72 uur over in een oven van 70 °C voor harsverharding.
4. Maak de ingebedde celculturen los van kamerschuif en lijm tot aralditeblokken.
5. Snijd seriële halfdunne secties (1,5 μm) met een machine, monteer op glasglijbanen en bevlek licht met 1% toluidineblauw.
6. Lijm geselecteerde halfdunne secties op araldite blokken en maak ze los van de glazen schuif door herhaaldelijk in te vriezen (in vloeibare stikstof) en te ontdooien.
7. Bereid ultraduinesecties (0,06-0,08 μm) voor met een machine en contrasteer verder met loodcitraat.
8. Verkrijg micrografen met behulp van elektronenscanmicroscoop met digitale camera.

Resultaten

De resultaten leveren bewijs dat deze nieuwe GM-vrije methode in staat is om bloed voorlopercellen terug te brengen naar hun meest primitieve toestand zonder direct in te werken op het menselijk genoom.

We hebben eerder aangetoond dat GPI-gebonden eiwitspecifieke antilichaam crosslinking initieert via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulatie van sterk geconserveerde ontwikkelingsrelevante genen zoals WNT, NOTCH en C-Kit, waardoor een proces van dedifferentiatie wordt gestart dat leidt tot ...

Discussie

De niet-GM-methode voor het herprogrammeren van menselijke cellen die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op membraan-naar-kernactivering van signaleringsmachines achter het GPI-gebonden menselijke membraanglycoproteïne dat het proces van dedifferentiatie initieert dat leidt tot de ex vivo generatie en uitbreiding van zelfvernieuwende PSC's verkregen uit niet-gemanipuleerd menselijk perifeer bloed. Deze cellen kunnen, wanneer ze in geschikte media worden gekweekt, opnieuw differentiëren in cellen die tot ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Albumine Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3-conjugaat	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI celviabiliteitskit	Biozym	872045	Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.
Ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serumvrij 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF oplossing	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	dichtheidsgradiëntmedia
BSA Frac V 7,5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-grootte magnetische kralen
Celtellings slides Luna	Biozym	872010	Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxyhars
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Niet meer leverbaar. Beschikbaar onder: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde graad	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparine natrium cel	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminine muis	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Geautomatiseerde Celteller	Biozym	872040	Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digitale camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterieel	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetaat C	EMS	22400