Methodenartikel

Detectie van genetische varianten in het CALR-gen met behulp van smeltanalyse met hoge resolutie

DOI:

10.3791/61642

⸱

26 augustus 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een gevoelige en snelle oplossing voor detectie van genetische varianten. Het hangt af van sequentieverschillen die ertoe leiden dat heteroduplexen de vorm van de smeltcurve veranderen. Door hrm en agarose gel elektroforese te kammen, kunnen verschillende soorten genetische varianten zoals indels worden geïdentificeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een krachtige methode voor genotypering en genetische variatiescanning. De meeste HRM-toepassingen zijn afhankelijk van verzadigde DNA-kleurstoffen die sequentieverschillen detecteren en heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Uitstekende instrumentresolutie en speciale data-analysesoftware zijn nodig om de kleine smeltcurveverschillen te identificeren die een variant of genotype identificeren. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor patiënten met een specifieke ziekte, met name kanker en in het CALR-gen bij patiënten met Philadelphia-chromosoomnegatieve myeloproliferatieve neoplasmata. Enkelvoudige nucleotideveranderingen, inserties en/of deleties (indels) in het betreffende gen kunnen worden gedetecteerd door de HRM-analyse. De identificatie van verschillende soorten genetische varianten is meestal gebaseerd op de controles die worden gebruikt in de qPCR HRM-test. Naarmate de productlengte toeneemt, wordt het verschil tussen wildtype- en heterozygote curven echter kleiner en is het type genetische variant moeilijker te bepalen. Daarom, waar indels de heersende genetische variant zijn die wordt verwacht in het gen van belang, kan een aanvullende methode zoals agarose gel elektroforese worden gebruikt voor de verduidelijking van het HRM-resultaat. In sommige gevallen moet een niet-overtuigend resultaat opnieuw worden gecontroleerd / opnieuw worden gediagnosticeerd door standaard Sanger-sequencing. In deze retrospectieve studie pasten we de methode toe op JAK2 V617F-negatieve patiënten met MPN.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somatische genetische varianten in het calreticuline-gen(CALR)werden in 2013 herkend bij patiënten met myeloproliferatieve neoplasmata (MPN) zoals essentiële trombocytemie en primaire myelofibrose1,2. Sindsdien zijn meer dan 50 genetische varianten in het CALR-gen ontdekt, die een +1 (−1+2) frameshift3induceren. De twee meest voorkomende CALR genetische varianten zijn een 52 bp deletie (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), ook wel type 1 mutatie genoemd, en een 5 bp insertie (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), ook wel type 2 mutatie genoemd. Deze twee genetische varianten vertegenwoordigen 80% van alle CALR genetische varianten. De andere zijn geclassificeerd als type 1-achtig of type 2-achtig met behulp van algoritmen op basis van het behoud van een α helix dicht bij wild type CALR4. Hier presenteren we een van de zeer gevoelige en snelle methoden voor CALR genetische variantdetectie, de hoge resolutie smeltanalysemethode (HRM). Deze methode maakt de snelle detectie van type 1 en type 2 genetische varianten mogelijk, die de meerderheid van de CALR-mutaties vertegenwoordigen5. HRM werd in 1997 geïntroduceerd in combinatie met real time »polymerasekettingreactie« (qPCR) als hulpmiddel om de mutatie in factor V Leiden6te detecteren. In vergelijking met Sanger sequencing die de gouden standaard techniek vertegenwoordigt, is HRM een meer gevoelige en minder specifieke methode5. De HRM-methode is een goede screeningsmethode die een snelle analyse van een groot aantal monsters mogelijk maakt met een grote kosten-batenverhouding5. Het is een eenvoudige PCR-methode die wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van een fluorescerende kleurstof en vereist geen specifieke vaardigheden. Een ander voordeel is dat de procedure zelf het geanalyseerde monster niet beschadigt of vernietigt, waardoor we het monster opnieuw kunnen gebruiken voor elektroforese of Sanger-sequencing na de HRM-procedure7. Het enige nadeel is dat het soms moeilijk is om de resultaten te interpreteren. Bovendien detecteert HRM de exacte mutatie niet bij patiënten met niet-type 1- of type 2-mutaties8. Bij deze patiënten moet Sanger-sequencing worden uitgevoerd(figuur 1).

HRM is gebaseerd op de amplificatie van het specifieke DNA-gebied in aanwezigheid van verzadigende DNA-fluorescerende kleurstof, die is opgenomen in dubbelstrengs DNA (dsDNA). De fluorescerende kleurstof straalt licht uit wanneer deze in het dsDNA wordt opgenomen. Na een progressieve temperatuurstijging breekt dsDNA af in enkelstrengs DNA, dat op de smeltcurve kan worden gedetecteerd als een plotselinge afname van de fluorescentie-intensiteit. De vorm van de smeltcurve is afhankelijk van de DNA-sequentie die wordt gebruikt om de mutatie te detecteren. Smeltcurven van monsters worden vergeleken met smeltcurven van bekende mutaties of wildtype CALR. Verschillende smeltcurven vertegenwoordigen een andere mutatie die niet type 1 of type 29is.

Het algoritme voor de detectie van somatische genetische varianten in het CALR-gen door HRM, agarosegel-elektroforese en sequencingmethode (figuur 1) werd gebruikt en gevalideerd in de retrospectieve studie gepubliceerd vóór10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd door de Commissie medische ethiek van de Republiek Slovenië. Alle procedures waren in overeenstemming met de verklaring van Helsinki.

1. Fluorescentie-gebaseerde kwantitatieve real-time PCR (qPCR) en post-qPCR analyse door HRM

  1. Resuspend primers vermeld in de tabel van materialen tot 100 μM met steriele, RNase en DNase vrije H2O (zie tabel van materialen). Maak een 10 μM werkconcentratie primer. Primers die in het protocol worden gebruikt, zijn gepubliceerd vóór2.
  2. Kwantificeer granulocyten DNA door de fluorescentiekleuringsmethode volgens de instructies van de fabrikant11 (zie Tabel met materialen). Bereid een DNA-oplossing van 20 ng/μL met behulp van 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (zie Materialentabel).
    1. Bereid naast DNA-monsters ten minste drie DNA-controles voor: twee positieve controles met de NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp deletie of type 1 mutatie), en NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp insertie of type 2 mutatie) genetische variant, evenals wild-type DNA en negatieve controle als een niet-template (NTC) controle.
      OPMERKING: Controleer voordat u de HRM-installatie uitvoert of het qPCR-instrument is gekalibreerd voor HRM-experimenten.
  3. Bereid qPCR HRM Master Mix volgens het protocol van de fabrikant (zie Tabel met materialen)als volgt: 10 μL van 2x qPCR Master Mix met Kleurstof, 0,2 μL van 10 μM Forward Primer, 0,2 μL van 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL steriel, RNase en DNase vrij H2O. Gebruik de primers uit de Tabel van Materialen. Voer drie replicaties uit voor elk DNA-monster en elke controle.
    1. Bereid de qPCR HRM Master Mix voor op basis van het aantal monsters dat wordt verwerkt. Neem overtollig volume van ten minste 10% op in de berekeningen om overtollig volume te bieden voor het verlies dat optreedt tijdens reagensoverdrachten.
  4. Meng de reactie-inhoud door zachtjes op de buis te tikken en om te keren en vortexing gedurende 2-3 s. Verzamel alle verspreide druppels van de wand van de buis naar de bodem door een korte draai.
  5. Bereid een reactieplaat voor die geschikt is voor het instrument en het HRM-experiment (zie Tabel met materialen). Breng 19 μL van de qPCR HRM Master Mix over naar de juiste putten van de optische reactieplaat met 96 putten.
  6. Pipetteer 1 μL van de negatieve controles, positieve controles en monsters in de juiste putten van de optische reactieplaat. Breng voor de NTC 1 μL steriele, RNase- en DNase-vrije H2O over die wordt gebruikt voor het bereiden van de qPCR HRM Master Mix in plaats van DNA.
  7. Sluit de reactieplaat af met de optische zelfklevende film. Doe het stevig om verdamping tijdens het hardlopen te voorkomen. Controleer of de optische zelfklevende film vlak is over alle putten in de reactieplaat om een correcte fluorescentiedetectie te garanderen.
  8. Draai de reactieplaat gedurende 1 minuut op 780 x g bij kamertemperatuur (RT). Controleer of de vloeistof zich op de bodem van de putjes in de reactieplaat bevindt. Ga verder met het uitvoeren van de test.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de plaat niet langer dan 24 uur bij 4 °C. Laat de plaat die bij 4 °C is bewaard opwarmen tot RT en draai de plaat kort voordat u hem laat draaien.
  9. Volgens de instructies van de fabrikant bereidt u de run voor en start u de run om het DNA te versterken en te smelten en om HRM-fluorescentiegegevens in het qPCR-instrument te genereren. Wijs in de software van het instrumentsysteem de bedieningselementen en monsters toe aan de juiste putten.
  10. Wijzig voor de detectie van genetische varianten van CALR het standaard systeemversterkingsprotocol en versterk het DNA met behulp van het volgende thermische cyclusprotocol: 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 50 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 62,5 °C gedurende 60 s.
  11. Voer de smeltcurve/dissociatiefase (HRM) onmiddellijk na qPCR uit volgens de instructies van de fabrikant12 als volgt: 95 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 1 minuut en vervolgens een hellingsnelheid van 0,025 °C/s tot 95 °C. Houd de temperatuur gedurende 15 s op 95 °C en gedurende 15 s op 60 °C.
  12. De run eindigt automatisch. Bekijk en verifieer eerst de versterkingsplot(figuur 2).
  13. Selecteer in het experimentmenu van de instrumentsysteemsoftware de optie versterkingsplot. Als er geen gegevens worden weergegeven, klikt u op de groene knop Analyseren.
    1. Selecteer op het tabblad versterkingsplot in het vervolgkeuzemenu plottype de plot die de versterkingsgegevens weergeeft terwijl de ruwe fluorescentiewaarden zijn genormaliseerd naar de fluorescentie van de passieve referentie (ΔRn) als functie van het cyclusgetal (ΔRn versus cyclus). Selecteer in het vervolgkeuzemenu Plotkleur de optie Voorbeeld.
  14. Selecteer in het vervolgkeuzemenu grafiektype het type lineaire versterkingsgrafiek. Toon de begin- en eindcyclus van de basislijn in de lineaire versterkingsgrafiek door de startoptie basislijn te selecteren. Controleer of de basislijn correct is ingesteld. De eindcyclus moet een paar cycli vóór het cyclusnummer worden ingesteld waar een significant fluorescerend signaal wordt gedetecteerd. De uitgangswaarde wordt meestal ingesteld van 3 tot 15 cycli(figuur 2).
  15. Selecteer in het vervolgkeuzemenu grafiektype het type log10-versterkingsgrafiek. Toon de drempellijn in de grafiek door de drempeloptie te selecteren. Pas de drempel dienovereenkomstig aan als deze niet correct is ingesteld. De correct ingestelde drempel betekent dat de drempellijn de exponentiële fase van de qPCR-curven kruist(figuur 2).
  16. Controleer of normale versterkingscurven zich in alle monster- en positieve controleputten bevinden. Controleer of er geen versterking in de NTC-putten is vóór cyclus 40. Een normale versterkingsplot toont een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt (figuur 2). Sluit de monsterputten uit van de analyse als er geen versterking in de putpositie is.
    OPMERKING: Als de versterkingsplot er abnormaal uitziet of als de NTC de versterking goed aangeeft, identificeert en lost u het probleem op volgens de handleiding voor probleemoplossing van de fabrikant.
  17. Sluit de uitschieter uit met de kwantificeringscyclus (Cq) waarde die verschilt van replicaties met meer dan 2 in de instrumentsysteemsoftware12. De uitschieters kunnen foutieve HRM-resultaten opleveren.
  18. Bekijk in de afgeleide smeltcurven de voor- en nasmeltgebieden / temperatuurlijnen. De pre- en post-smeltgebieden moeten zich binnen een vlak gebied bevinden waar zich geen grote pieken of hellingen in de fluorescerende niveaus bevinden(figuur 3). Pas het indien nodig dienovereenkomstig aan. Stel de start en stop in van de temperatuurlijnen voor en na het smelten op ongeveer 0,5 °C van elkaar(figuur 3). Start de analyse opnieuw als de parameters zijn aangepast door op de knop Analyseren te klikken.
  19. Kies op het tabblad verschilplot op het tabblad plotinstellingen een van de wild-type controle (homozygoot) repliceert als het referentie-DNA en start de analyse opnieuw door op de knop Analyseren te klikken.
  20. Controleer in het tabblad uitgelijnde smeltcurven of alle positieve controles het juiste genotype hebben en dat NTC niet kan worden versterkt(figuur 4). Selecteer in de puttabel de putten met een positieve controle om de overeenkomstige smeltcurve in de analyseplots te markeren. Controleer of de kleur van de lijn overeenkomt met het juiste genotype. Herhaal de stappen voor de putten met de andere positieve controles en NTC.
  21. Bekijk op het tabblad uitgelijnde smeltcurven zorgvuldig de plotweergaven voor de onbekende monsters en vergelijk ze met de plotweergaven voor besturingselementen(figuur 4). Selecteer in de puttabel de putten met de onbekende monsterreplicaties, controleer de kleur van de smeltcurve en lijn ze uit met de besturingselementen in een geordende volgorde door de putten met positieve controles één voor één te selecteren. Herhaal het proces voor alle onbekende monsters.
    OPMERKING: Het onbekende monster bevat de variant van een van de besturingselementen als de smeltkromme er strak op is uitgelijnd. Er kunnen verschillende variantgroepen (verschillende kleuren) worden weergegeven, wat aangeeft dat het onbekende monster uit een onbekende variant bestaat, die niet overeenkomt met de besturingselementen(figuur 8). Een laag niveau van de somatische genetische variant kan aanwezig zijn in het monster van de patiënt. Dit kan van invloed zijn op de interpretatie van het HRM-resultaat, met name bij de detectiegrens van de test(figuur 9). In deze gevallen kan de kleur of zelfs de vorm van de lijn sterk lijken op die van het wildtype genotype.
    1. Wanneer het resultaat niet overtuigend is, combineert u de HRM-resultaten met de resultaten van de agarosegel-elektroforese en sequencingmethoden. Test het monster opnieuw of vraag het aan en test indien nodig een nieuw monster opnieuw.
    2. Controleer de gegevensset zorgvuldig op replicatiecurven en controleer of de uitlijning van elke replicatie binnen de groep strak is. Sluit de replicatie uit als deze niet goed is uitgelijnd met de andere steekproeven in de groep (uitschieter). Test de steekproef opnieuw als er meer uitschieters aanwezig zijn en de resultaten niet overtuigend zijn. Houd er rekening mee dat de kwantiteit en kwaliteit van het DNA-monster van invloed zijn op de HRM-resultaten.
  22. Analyseer het resultaat voor het onbekende voorbeeld op het tabblad Verschilplot. Herhaal de procedure beschreven in stap 1.21 en controleer of de resultaten voor het onbekende monster dezelfde zijn.
  23. Voer vervolgens de qPCR HRM-producten uit op de agarose-gel.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de plaat niet langer dan 24 uur bij 4 °C of gedurende langere tijd, maar niet langer dan 7 dagen bij -20 °C. Laat de plaat die bij 4 °C is bewaard opwarmen tot RT en draai de plaat kort voordat u hem laat draaien. Laat de plaat die is bewaard bij - 20 °C ontdooien en opwarmen tot RT en draai de plaat vervolgens kort voordat u deze laat draaien.

2. Agarose gel elektroforese

  1. Voer qPCR HRM-producten uit op een 4% agarose pre-cast gel met een fluorescerende nucleïnezuurvlek met behulp van het juiste gel-elektroforesesysteem (zie Tabel met materialen, figuur 5). Voer slechts één positieve, negatieve, NTC- en voorbeeld qPCR HRM-replicatie uit.
    OPMERKING: Handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het hanteren van gels. Elk ander gel-elektroforesesysteem kan dit doel vervullen als het equivalente agarosepercentage, fluorescerende nucleïnezuurkleuring en putformaat worden gekozen.
  2. Voer het gel-elektroforesesysteem uit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Verwijder de voorgegoten gel in de cassette uit de verpakking, verwijder de kam en plaats deze in het apparaat volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Laad de gel binnen 15 minuten na het openen van de verpakking.
  3. Verdun een monster van 10 μL tot 20 μL met steriel, RNase- en DNase-vrij H2O. Laad elke put met 20 μL verdund monster.
  4. Verdun 3 μL DNA-grootte standaardoplossing tot 20 μL met steriel, RNase en DNase vrij H2O (zie Tabel met materialen). Laad de M-put met 20 μL verdunde DNA-grootte standaardoplossing(figuur 6).
  5. Vul lege putten met 20 μL steriel, RNase- en DNase-vrij H2O.
  6. Selecteer onmiddellijk het programma op basis van het percentage van de gel dat wordt uitgevoerd en stel de looptijd op het apparaat in op 10 minuten.
  7. Start de elektroforese binnen 1 minuut na het laden van het monster door op de GO-knop te drukken. De elektroforesetijd kan worden verlengd als er onvoldoende resolutie wordt verkregen.
    OPMERKING: Overschrijd de maximale aanbevolen agarose-elektroforese-looptijd volgens de instructies van de fabrikant niet.
  8. Wanneer de elektroforese is voltooid, visualiseer dan DNA in de gel met behulp van een blauw licht of UV-transilluminatie. Het visualiseren, analyseren en opslaan van de elektroforesebeelden gebeurt meestal door een gel imager met fotodocumentatiesysteem(figuur 5).
  9. Analyseer en interpreteer het gevisualiseerde qPCR HRM-productgelpatroon door de resultaten van het onbekende monster te vergelijken met positieve controles(figuur 7 en figuur 8).
  10. Als de resultaten van de hrm- en gelelektroforese van het onbekende monster aangeven dat er een onbekende genetische variant aanwezig is, sequentieer dan het qPCR HRM-product met behulp van primers beschreven in de tabel met materialen volgens het beschreven protocol13.
    LET OP: De agarosegels met een fluorescerende nucleïnezuurvlek moeten volgens de instellingsvoorschriften op de juiste manier worden weggegooid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het met succes versterkte DNA-gebied van belang met een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt en zeer smalle waarden van de cyclus van kwantificering (Cq) in alle gerepliceerde monsters en controles (figuur 2) is een voorwaarde voor de betrouwbare identificatie van genetische varianten door HRM-analyse. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nauwkeurige bepaling van DNA met fluorescentiekleuring en een gelijke hoeveelheid DNA in het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge resolutie smelten van DNA is een eenvoudige oplossing voor genotypering en genetische variant scanning14. Het hangt af van sequentieverschillen die resulteren in heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor een bepaalde groep patiënten met kanker1,2,15,<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag alle academische experts en medewerkers van het gespecialiseerde hematologielaboratorium, afdeling hematologie, afdeling interne geneeskunde, universitair medisch centrum Ljubljana bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
E-Gel EX 4% AgaroseInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG401004
Fuorometer 3.0 QUBITInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo KitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2XApplied Biosystem, Thermo Fischer Scientific4415440Componenten: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP-mix inclusief dUTP, magnesiumzouten en andere buffercomponenten, precies geformuleerd om optimale HRM-resultaten te verkrijgen
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0,1 mL)Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4346907
MicroAmp Optical adhesive filmApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4311971
NuGeniusSyngeneNG-1045Geldocumentatiesystemen
Primer CALRex9 ForwardEurofins GenomicsSequentie: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 ReverseEurofins GenomicsSequentie: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51306DNA-isolatiekit met de buffer voor DNA-verdunning.
Qubit Assay TubesInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32856
QUBIT dsDNA HS assayInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32854
Trackit 100bp DNA LadderInvitrogen, Thermo Fischer Scientific10488058Ladder bestaat uit 13 individuele fragmenten met de referentiebanden op 2000, 1500 en 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4453534
Water nuclease freeVWR, Life Science436912CRNase, DNase en Protease vrij water

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
  3. Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
  4. Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
  5. Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
  6. Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
  7. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
  8. Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
  9. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
  10. Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838(2019).
  11. Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
  12. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
  13. Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
  14. Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
  15. Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522(2011).
  16. Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
  17. Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
  18. Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
  19. Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511(2014).
  20. Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316(2017).
  21. Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
  22. Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
  23. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923(2012).
  24. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Myeloproliferatieve neoplasie nJAK2 V617FagarosegelelektroforeseqPCR HRM assaysmeltcurveanalysegenetische screeningsomatische mutaties

Gerelateerde artikelen