Methodenartikel

Lipidico Injection Protocol voor seriële kristallografie metingen bij de Australische Synchrotron

DOI:

10.3791/61650

⸱

23 september 2020

 ,  ,  ,  , 
1Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging, Department of Chemistry and Physics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086, 2Kusel Design, Niddrie, Melbourne, Australia, 3042

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe seriële kristallografiemonsters kunnen worden voorbereid voor het verzamelen van gegevens op een hoge stroperige injector, Lipidico, onlangs in opdracht van de Australische synchrotron.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het Australische synchrotron is een faciliteit ontwikkeld voor het uitvoeren van seriële kristallografiemetingen. Deze faciliteit bevat een speciaal gebouwde hoge viskeuze injector, Lipidico, als onderdeel van de macromoleculaire kristallografie (MX2) beamline om grote aantallen kleine kristallen bij kamertemperatuur te meten. Het doel van deze techniek is om kristallen te laten groeien/overbrengen naar glazen spuiten om direct in de injector te worden gebruikt voor het verzamelen van seriële kristallografiegegevens. De voordelen van deze injector zijn onder andere het vermogen om snel te reageren op veranderingen in het debiet zonder onderbreking van de stroom. Er bestaan verschillende beperkingen voor deze hoge viscositeitsinjector (HVI), waaronder een beperking van de toegestane monsterviscositeiten tot >10 Pa.s. Streamstabiliteit kan ook een probleem zijn, afhankelijk van de specifieke eigenschappen van het monster. Een gedetailleerd protocol voor het instellen van monsters en het bedienen van de injector voor seriële kristallografiemetingen bij de Australische synchrotron wordt hier gepresenteerd. De methode toont de bereiding van het monster aan, met inbegrip van de overdracht van lysozymekristallen in een hoog viskeuze medium (siliconenvet) en de werking van de injector voor het verzamelen van gegevens bij MX2.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seriële kristallografie (SX) is een techniek die oorspronkelijk werd ontwikkeld in de context van röntgenvrije elektronenlasers (XFELs)1,2,3,4. Hoewel vaste doelbenaderingen kunnen worden gebruikt voor SX5,6,7, worden injectorsystemen meestal gebruikt om kristallen in een continue stroom naar de röntgenstraal te leveren. Omdat het gegevens van een groot aantal kristallen combineert, vermijdt SX de noodzaak van kristaluitlijning tijdens het experiment en maakt het mogelijk gegevens te verzamelen bij kamertemperatuur8,9. Met behulp van een geschikte injector worden de kristallen één voor één in het röntgeninteractiegebied gestreamd en worden de resulterende diffractiegegevens verzameld op een gebiedsdetector9,10. Tot op heden is SX succesvol geweest in het oplossen van een aantal eiwitstructuren1,11,12,13, waaronder kristallen die te klein zijn om te meten met behulp van conventionele kristallografie. Het heeft ook nieuwe inzichten gegeven in de tijd-opgeloste moleculaire dynamiek door gebruik te maken van de femtoseconde pulsduur van de XFEL. Door pompsondereacties met optische laserbronnen te initiëren, zijn diepgaande studies uitgevoerd naar fotosysteem II14,15, fotoactief geel eiwit16,17, cytochroom C oxidase18, evenals bacteriorhodopsin19,20,21. Deze studies hebben de elektronenoverdrachtsdynamiek onderzocht die optreedt na lichtactivering die het significante potentieel van seriële kristallografie aantoont voor het begrijpen van tijdgeopgeleerde biologische processen.

De ontwikkeling van seriële kristallografie komt ook steeds vaker voor bij synchrotronbronnen9,12,20,22,23,24. Synchrotron gebaseerde SX maakt het mogelijk om grote aantallen individuele kristallen efficiënt te meten bij kamertemperatuur met behulp van een geschikt injectorsysteem. Deze aanpak is geschikt voor kleinere kristallen, dus naast het vereisen van een snelle framesnelheidsdetector om de gegevens te verzamelen, is ook een micro-gerichte straal vereist. In vergelijking met conventionele kristallografie omvat SX niet de montage en uitlijning van individuele kristallen in de röntgenstraal. Omdat gegevens van een groot aantal individuele kristallen worden samengevoegd, kan de stralingsdosis die elk kristal ontvangt aanzienlijk worden verlaagd in vergelijking met conventionele kristallografie. Synchrotron SX kan ook worden toegepast op de studie van tijdgeopgeleerde reacties, zelfs tot aan het milliseconderegime, op voorwaarde dat er een detector met een voldoende hoge framesnelheid beschikbaar is (bijv. 100 Hz of meer). In het synchrotron zijn verschillende seriële kristallografie-experimenten uitgevoerd met behulp van injectoren die aanvankelijk werden ontwikkeld bij XFEL-bronnen20,22,23. De twee meest voorkomende typen injectoren zijn de Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 en High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. De GDVN is ideaal voor het injecteren van lage viscositeit, vloeibare monsters, maar vereist hoge debieten om stabiele stromen te bereiken, wat op zijn beurt leidt tot hoge monsterverbruikspercentages. HVI's zijn daarentegen geschikt voor monsters met een hoge viscositeit, waardoor een stabiele stroom met veel lagere stroomsnelheden kan worden genereren, wat leidt tot een veel lager monsterverbruik. De HVI-injector geeft daarom de voorkeur aan de levering van monsters waarbij een viskeuze drager de voorkeur heeft (bijv. lipide op basis van membraaneiwitten) en/of grote hoeveelheden monster niet beschikbaar zijn. SX-injectoren zijn over het algemeen uitdagend in gebruik en vereisen uitgebreide training om te werken. Ze omvatten ook lange protocollen voor monsteroverdracht, omdat het monster in een gespecialiseerd reservoir moet worden geladen, dit heeft over het algemeen een hoog risico dat het monster verloren gaat in het 'dode volume' of via lekkages in de verbindingen. Daarom is het wenselijk om het ontwerp van de injector te optimaliseren om eventuele verliezen te beperken voordat het monster de röntgenstraal bereikt.

Onlangs werden de eerste SX-resultaten gepubliceerd met Lipidico23 met een lysozyme-doel, met behulp van een Eiger 16M-detector. Dit injectorontwerp beperkt de verspilling van monsters door het aantal stappen te minimaliseren dat nodig is om van de eerste kristallisatie naar de overdracht van kristallen naar de injector te gaan, gevolgd door de levering van monster aan de röntgenstraal. Dit manuscript beschrijft en demonstreert de procedure voor monsteroverdracht vanaf de monstervoorbereiding, de overgang naar het injectieproces en ten slotte het verzamelen van gegevens met behulp van hetzelfde kristallisatievat. De werking van de injector wordt ook beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van kristallen in een hoog viskeuze medium met behulp van glazen spuiten

  1. Centrifugeer de kristaloplossing voorzichtig (~ 1.000 x g,~ 10 minuten bij 22 °C) om een zachte kristalkorrel te vormen en de overtollige buffer te verwijderen. Dit zal resulteren in een hoge concentratie kristallen in de pellet die kan worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens.
    OPMERKING: Om verdunning van de viskeuze media te voorkomen, verhoogt u de kristalconcentratie bij deze stap. Optimaliseer de verhouding tussen viskeuze media en kristalvolume voor elk monster om een hoge concentratie kristallen te verkrijgen met behoud van een hoge viscositeit voor de media. Centrifugeer de kristaloplossing om een pellet te vormen en overtollige buffer te verwijderen om de kristalconcentratie in de oplossing te verhogen, zoals beschreven in Darmanin et. al.29.
  2. Stel twee spuiten van 100 μL in met een koppeling.
  3. Bevestig de koppeling aan het einde van de eerste spuit en voeg 28 μL kristaloplossing toe aan de bovenkant van de spuit. Steek de zuiger langzaam in de bovenkant van de spuit en duw de oplossing voorzichtig naar het einde van de koppelingstip en verwijder eventuele luchtbellen die zich vormen. Doe dit door een van de twee onderstaande methoden te volgen.
    OPMERKING: Het volume kristallen dat aan de hoge viskeuze media moet worden toegevoegd, kan worden gevarieerd als het de viscositeit van het totale monster niet significant verandert.
    1. Eerste methode: Gebruik snelle drukveranderingen om de luchtbellen te laten barsten.
      1. Plaats voorzichtig een gehandschoende vinger op de bovenkant van het stompe koppelingsnaaldpunt en oefen (heel voorzichtig) druk uit om een afdichting te maken. Oefen niet te veel druk uit, omdat dit kan leiden tot een naaldsteekletsel.
      2. Trek nu de zuiger terug om de oplossing weg te trekken van het naaldpunt, dit zal een ophoping van druk in de spuit genereren.
      3. Laat de druk aan de bovenkant van de spuit snel los door de gehandschoende vinger uit de stompe naaldpunt te verwijderen. Wees voorzichtig, als het monster te dicht bij de punt is wanneer de vinger wordt verwijderd, kan het uitspuiten, wat resulteert in verlies van monster. De snelle drukverandering in de spuit zal de luchtbellen doen barsten. Herhaal dit totdat alle bellen zijn verwijderd.
    2. Tweede methode: Het gebruik van de 'menselijke centrifuge' om luchtbellen te verwijderen.
      1. Plaats de spuit in één hand met de naald naar boven gericht en de zuiger tussen twee vingers geklemd, zodat deze niet kan bewegen.
      2. Draai de arm die de spuit 2-3 keer snel in één richting houdt, de resulterende centrifugaalkracht op het monster zal eventuele luchtbellen uit de spuit dwingen. Wees voorzichtig, als het te langzaam wordt gedaan, kan het monster verloren gaan.
      3. Inspecteer de spuit op luchtbellen, als er bellen achterblijven, herhaal de stappen 1.3.2.1 – 1.3.2.2 totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
  4. Voeg met behulp van een fijne spatel ~ 42 μL hoogvacuüm siliconenvet direct toe aan de bovenkant van de tweede spuit. Duw de zuiger helemaal naar beneden tot het einde, verwijder alle luchtbellen en zorg ervoor dat er geen luchtspleet in het uiteinde van de spuit is.
    OPMERKING: De precieze samenstelling van het siliconenvet is niet van cruciaal belang omdat het fungeert als een inerte drager. Een viscositeitswaarde van >10 Pa.s of een verhouding van ongeveer 60:40 siliconenvet tot kristaloplossing is optimaal voor injectie, maar het is mogelijk dat dit varieert afhankelijk van de exacte kenmerken van het monster. Pas het volume kristaloplossing aan dat aan het siliconenvet is toegevoegd aan om de kristalconcentratie in het mengsel te optimaliseren, zoals beschreven in de discussie. Andere high-viscous media dan siliconenvet kunnen worden gebruikt zolang ze compatibel zijn met het monster30,31,32,33.
  5. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in een van de twee spuiten zitten en bevestig de spuiten aan elkaar met behulp van de koppeling. Houd de spuiten verticaal door alleen het uiteinde van de spuit vast te pakken, omdat het opwarmen van de spuit vanwege de warmte die door vingers wordt gegenereerd, het monster kan beïnvloeden.
  6. Meng het monster door de zuiger aan de kant van de kristaloplossing voorzichtig in te drukken, zodat deze zich mengt in het siliconenvet en duw vervolgens de zuiger aan de kant van het siliconenvet, zodat het monster terug naar de kant van de kristaloplossing wordt geduwd. Herhaal dit proces voorzichtig 50 tot 100 keer, zodat het monster grondig wordt gemengd en er homogeenuitziet.
    OPMERKING: Als de kristallen direct in zeer stroperige media worden gekweekt (bijv. lipide kubieke fase, LCP), zijn stappen 1.1–1.6 niet vereist. Protocollen voor het kweken van kristallen in de spuiten zijn te vinden in Liu et.al. 34van35. Volg dit protocol tot monsterconsolidatie, stap 10, waarbij al het monster nu in één spuit zit en de kristallisatiebuffer wordt verwijderd. De toevoeging van 7.9MAG is niet vereist voor dit protocol. Verwijder in plaats daarvan alle overtollige vloeistof uit de spuit door de zuiger voorzichtig in het monster naar beneden te duwen totdat er geen vloeistof meer in de spuit achterblijft.
  7. Visualiseer de kristallen onder een optische microscoop door de spuit of haal voor het beste resultaat een kleine hoeveelheid (~ 1 μL) op een glazen glijbaan en plaats een afdekslip aan de bovenkant.
  8. Controleer de kristalconcentratie.
    1. Bepaal de kristalconcentratie in het siliconenvet door het aantal kristallen in een specifiek gebied te tellen met behulp van de optische microscoopbeelden. Voor het beste resultaat is een hoge dichtheid van kristallen gelijkmatig verspreid over de media ideaal (>106 kristallen/ml) om een hoge kristalslagsnelheid te verkrijgen.
    2. Pas de kristalconcentratie in de spuit aan door de verhouding van kristallen te veranderen in viskeuze media in stap 1.3 en 1.4.
      1. Om de kristalconcentratie te verlagen, verdunt u de kristallen in de spuit door de hoeveelheid siliconenvet/HV-media in stap 1.4 te verhogen of door de kristalkorrel in oplossing te verdunnen met de kristallisatiebuffer voordat u de spuiten in stap 1.1 instelt.
      2. Om de kristalconcentratie te verhogen, verlaagt u de hoeveelheid siliconenvet in stap 1.4, maar let op dat u de viscositeit niet onder de 10 Pa.s. verlaagt.
        OPMERKING: De hier gerapporteerde kristalconcentratie is geoptimaliseerd voor dit specifieke monster en de kristalgrootte. De ideale kristalconcentratie hangt echter af van de kristalgrootte, straalgrootte, de naald interne diameter (I.D.) en de invallende röntgenflux. Dit kan worden bepaald aan de hand van de hit rate met een optimale hit rate van ~30% die als 'goed' wordt beschouwd. In de praktijk moet de kristalconcentratie worden geoptimaliseerd voor verschillende monsters tijdens de straaltijd om de gewenste slagsnelheid te verkrijgen. Begin met een hoge concentratie kristallen, 109 kristallen/ml. De procedure voor het aanpassen van de kristalconcentratie wordt gegeven in Liu et.al. Op 35.
    3. Het protocol kan hier worden gepauzeerd totdat de injector klaar is voor het verzamelen van gegevens.
      1. Als de kristallen in LCP worden gekweekt, sluit ze dan af en laat ze tot een paar dagen in spuiten op kamertemperatuur blijven.
      2. Als de kristallen zijn overgebracht naar een ander hoog viskeuze medium (bijv. siliconenvet), moet voorafgaand aan de meting een stabiliteitstest van de kristallen worden uitgevoerd. Dit bepaalt hoe lang de kristallen stabiel zijn in de inerte media (idealiter > 8 uur) en de tijdslimiet voor het verzamelen van gegevens. Hier waren lysozymkristallen dagenlang stabiel in siliconenvet en vertonen ze geen tekenen van oplossen bij inspectie met behulp van een optische microscoop.
  9. Verplaats al het monster in één spuit voordat u de koppeling loskoppelt. Koppel de koppeling los van de spuit en bevestig de injectienaald. Schroef de naald stevig in de basis van de spuit en zorg ervoor dat deze goed vastzit om lekkages te voorkomen. Voor dit experiment werd een 108 μm I.D. naald (naaldlengte 13 mm, puntstijl 3) gebruikt. Afhankelijk van de kristalgrootte en de bundelgrootte bevestigt u een naald van 51 μm of 108 μm I.D.
    OPMERKING: Het vooraf testen van de monsterstroom voorafgaand aan de straaltijd is vereist om de juiste grootte van de injectornaald te kunnen selecteren. Afhankelijk van de monstereigenschappen (d.w.z. viscositeit, opladen, buffersamenstelling) en de naald-I.D. zullen de monsters anders stromen. Daarom wordt aanbevolen om een verscheidenheid aan naaldmaten te testen om de meest stabiele stroom met de kleinst mogelijke ID-naald te produceren om de signaal-ruisverhouding tijdens het verzamelen van gegevens te maximaliseren.
  10. Als de injector al op de straalleiding is gemonteerd en uitgelijnd, gaat u naar sectie 3 en monteert u de monsterspuit rechtstreeks op de injector.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. Montage en bediening van de injector

  1. Monteer de injector op de balklijn. Verwijder het cryogene mondstuk op de MX2-straallijn en vervangt het door de injector. Draai de klemschroef los die het cryogene mondstuk vasthoudt en bevestig deze aan de beugel naast de gemotoriseerde trap.
  2. Til de injector op uit de trolley door de zwarte handgreep vast te houden en op het gemotoriseerde podium te plaatsen.
    1. Om de injector aan het gemotoriseerde stadium te bevestigen; draai de zwarte klemschroefknop vast.
  3. Monteer een lege spuit op de injector
    1. Selecteer in de injectorcomputerbesturingsinterface (d.w.z. EPOS-positiebesturingssoftware) de homingmodus onder Extra in het softwaremenu. Selecteer vervolgens Negatieve eindschakelaar en Start Homing,laat de software draaien totdat de schroef voldoende is ingetrokken om de spuit onder de schroef te laten passen. Als de eindschakelaar zonder toezicht blijft werken, stopt de schroef automatisch.
    2. Monteer een lege ('dummy') spuit op de injector door de naald door de spleet in de spuithouder te steken. Zet de spuit tegen de beugel.
    3. Bevestig de spuit met twee O-ringen.
      1. Wikkel de eerste O-ring over het middengedeelte van de spuit en bevestig deze aan de haken aan weerszijden van de spuit.
      2. Draai de tweede O-ring om de haken op het bovenste gedeelte van de spuit en plaats vervolgens een deel van de O-ring op de bovenkant van de glazen spuit zoals weergegeven in de demonstratie en figuur 1B.
  4. Lijn de injector uit op röntgenstraal
    1. Beweeg de gemotoriseerde fase met de injector naar het röntgeninteractiepunt via de beamlinebesturingssoftware. Dit kan worden gevisualiseerd met behulp van de inline camera. De grootte en positie van de straal wordt aangeduid met een rood kruis op het scherm en de gemotoriseerde fase kan worden verplaatst om de naald uit te lijnen met het röntgeninteractiegebied.
    2. Stel de x- en y-positie van het podium in om de naald uit te lijnen met het rode kruis.
    3. Pas de z-stand aan totdat de naaldpunt scherp komt te staan.
    4. Controleer de uitlijning van de naaldpunt en röntgenstraal visueel door te controleren of de spuitpunt voldoet aan de draden die zichtbaar zijn in het optische microscoopbeeld dat door de beamlinecamera wordt gegenereerd.
    5. Zodra de naaldpunt is uitgelijnd, beweegt u de punt boven de kruisharen ~ 100 μm. Dit elimineert röntgenverstrooiing van de naaldpunt.
      OPMERKING: Het monteren en uitlijnen van de injector op de MX2-straallijn op de synchrotron moet door de beamlinewetenschappers worden uitgevoerd en kan in minder dan 30 minuten worden voltooid.

3. Montage van de monsterspuit

  1. Vervang de lege spuit door de monsterspuit door stap 2.3 te volgen.
  2. Plaats de injectordop op de zuigerkop van de monsterspuit.
  3. Verplaats de aandrijfschroef naar de bovenkant van de dop.
  4. Selecteer in de injectorbesturingssoftware Velocity Mode.
  5. Voer 3000 rpm (~115 nL/s) in als instellingswaarde en druk op Instellingswaarde toepassen.
  6. Wanneer de aandrijfschroef de dop op de zuigerkop van de spuit aanraakt, stopt u de motor.
    1. Stel de toerentalwaarde in op nul in de injectorbesturingssoftware door de instellingswaarde te wijzigen in '0' wanneer de schroef de dop nadert.
    2. Zodra contact is gemaakt, activeert u de vooraf ingestelde waarde door op Instellingswaarde toepassen te drukken om de schroef onmiddellijk te stoppen.
  7. Beweeg de dop voorzichtig om er zeker van te zijn dat deze stevig op zijn plaats zit.
    OPMERKING: Wanneer een nieuwe ingestelde waarde wordt ingevoerd in het vak Waarde instellen in de besturingssoftware, wordt deze alleen geactiveerd nadat u op Instellingswaarde toepassenhebt gedrukt.

4. De injector laten lopen

  1. Nadat de schroef van de dopaandrijving stevig contact heeft gemaakt met de bovenkant van de zuiger, wijzigt u de instellingswaarde voor het toerental naar 100. Dit komt overeen met ~ 4 nL/s.
  2. Inspecteer de naaldtip visueel wanneer het monster voor het eerst naar buiten komt of kijk naar het beeld van de beamlinecamera van de naald om te observeren wanneer het monster uit de naaldpunt begint te extruderen.
  3. Voer een doorzoeking van het hok uit, sluit de hutchdeur en schakel de röntgenstraal in. Vanaf dit punt moet de injector op afstand van buiten het hok worden bediend.
  4. Stem het toerental af totdat er een stabiele stroom wordt gegenereerd.
    1. Verlaag de instellingswaarde voor het toerental tot 90.
    2. Herhaal stap 4.4.1, waarbij de instellingswaarde voor het toerental in stappen van 10 wordt verlaagd, om de stroom te vertragen, maar toch een stabiele stroom te behouden. Voor siliconenvet werd een waarde van 30 tpm gebruikt.
      OPMERKING: Het typische toerentalbereik varieert tussen 30 – 100 tpm (1 – 4 nL/s), afhankelijk van de monsterkenmerken en de belichtingstijd van röntgenfoto's. Over het algemeen moet het toerental worden afgestemd om het langzaamste debiet te produceren (om het monsterverbruik te minimaliseren) met behoud van een stabiele stroom.
  5. Een voorbeeldstroom beheren die niet goed stroomt.
    1. Blijf de instellingswaarde voor het toerental verhogen in stappen van 10 totdat de stroom rechter wordt. Als de stroom niet stabiliseert, zelfs na het verhogen van de rpm-instellingswaarde tot de maximale waarde van 100 tpm, probeer dan de stabiliteit te verbeteren door een van de twee onderstaande methoden te implementeren.
      1. Eerste methode: Plaats een polystyreenmonstervanger onder de monsterstroom om het monster te helpen begeleiden. Deze methode werkt goed voor zeer geladen voorbeeldstromen.
      2. Tweede methode: Plaats een venturi zuigtrechter in de monstervanger. Om lucht aan de trechter te leveren, sluit u deze aan op de luchtuitlaatbuis in het hok. Deze methode kan helpen bij het sturen en stabiliseren van de monsterstroom onafhankelijk van de lading van de stroom.
  6. Zodra een constante en constante stroom is bereikt, start u de gegevensverzameling en optimaliseert u de detectorafstand volgens een normaal röntgenkristallografie-experiment.
    OPMERKING: Het toerental wordt omgerekend naar het debiet met behulp van de meegeleverde conversietabel in de aanvullende informatie 'Lipidico Device Calculator'. Voer de toerentalwaarde, naalddiameters en spuitvolumes in om het debiet te berekenen met behulp van deze rekenmachine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidico is een HVI gebouwd als alternatief leveringssysteem voor gebruik op MX2 (Figuur 1). Het is bij uitstek geschikt voor SX waar kristallen worden gekweekt in lipide kubieke fase of overgebracht naar een hoge stroperige inerte media.

Om de injectortoepassing aan te tonen werd siliconenvet gemengd met lysozymekristallen gebruikt om SX-gegevens te verzamelen bij de MX2-straallijn bij de Australische synchrotron. Om de injector op de MX2 beamline te monteren wor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een alternatieve HVI ontwikkeld, ideaal voor het uitvoeren van SX-experimenten bij synchrotronbronnen. Het heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande HCI's. Ten eerste is het eenvoudig te installeren op de straallijn waardoor snel kan worden geschakeld tussen conventionele kristallografie en SX, slechts ~ 30 minuten is vereist voor installatie en uitlijning op MX2. Ten tweede kunnen de monsterspuiten die worden gebruikt om kristallen te kweken, rechtstreeks worden gebruikt als reservoirs voor injec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MK werkt voor Kusel designs. Kusel Design, een ontwikkelaar van aangepaste laboratoriumapparaten, werd ingeschakeld door dr. Peter Bentsen van de La Trobe University en dr. Tom Caradoc-Davies van ANSTO en om een goedkoop apparaat te ontwikkelen om hoge stroperige studies in de MX2-straallijn bij het Australische Synchrotron mogelijk te maken. Het apparaat is ontwikkeld in nauw overleg met Dr. Caradoc-Davies. De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Dit onderzoek werd deels uitgevoerd met behulp van de MX2 beamline bij het Australische Synchrotron, onderdeel van ANSTO, en maakte gebruik van de Australian Cancer Research Foundation (ACRF) detector.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hen eggwhite lysozymeSigma-AldrichL6876Gebazig voor het kweken van kristallen voor het testen van de injector en de kristallen worden overgebracht naar siliconenvet. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon greaseDow CorningZ273554-1EAGebazig voor het testen van de injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector naald (108 µm ID)Hamiltononderdeel nr: 7803-05www.hamiltoncompany.com
Glazen gasdichte spuiten, 100 µlHamiltononderdeel nr: 7656-01Spuiten gebruikt voor monsterinjectie. www.hamiltoncompany.com
LCP-spuitenkoppelingFormulatrix209526Spuitkoppeling om de monsters te mengen
Lipidico-injectorLa Trobe University/ANSTODit is een specifiek stuk apparatuur dat toegankelijk is via La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
  2. Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601(2012).
  3. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).
  5. Lee, D., et al. Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 9, 6971(2019).
  6. Martin, A. V., et al. Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases. Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).
  7. Roedig, P., et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography. Nature Methods. 14 (8), 805(2017).
  8. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).
  9. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5, 3309(2014).
  10. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).
  11. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  12. Nam, K. H. Sample delivery media for serial crystallography. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094(2019).
  13. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), 1600292(2016).
  14. Kern, J., et al. Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock. Nature. 563 (7731), 421(2018).
  15. Suga, M., et al. An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser. Science. 366 (6463), 334-338 (2019).
  16. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  17. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  18. Ishigami, I., et al. Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).
  19. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  20. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).
  21. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 361 (6398), (2018).
  22. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).
  23. Berntsen, P., et al. The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector. Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110(2019).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).
  25. DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078(2011).
  26. Park, S. Y., Nam, K. H. Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).
  27. Shimazu, Y., et al. High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure. Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).
  28. Kovacsova, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).
  29. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345(2016).
  30. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).
  31. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).
  32. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6, 24484(2016).
  33. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).
  34. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).
  35. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  36. Hadian-Jazi, M., et al. A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography. Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).
  37. Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art. Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipidico injectorhoogviskeuze mediaopstelling glazen spuitkristalkoncentratiedebietregelingmonstervoorbereidingviscositeitsmetingelektronendichtheidskaart

Gerelateerde artikelen