Methodenartikel

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

DOI:

10.3791/61655

⸱

29 augustus 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celfenotype kan worden omgekeerd of gewijzigd met verschillende methoden, met voordelen en beperkingen die specifiek zijn voor elke techniek. Hier beschrijven we een nieuwe strategie die het gebruik van chemische epigenetische uitwissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen, om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren. Er zijn twee belangrijke stappen vereist. In de eerste stap worden volwassen volwassen (terminaal gedifferentieerde) cellen blootgesteld aan de epigenetische gum 5-aza-cytidine om ze in een pluripotente toestand te drijven. Dit deel van het protocol is ontwikkeld, gebaseerd op het toenemende begrip van de epigenetische mechanismen die het lot en de differentiatie van cellen beheersen, en omvat het gebruik van de epigenetische modifier om de celgedifferentieerde toestand te wissen en vervolgens in een voorbijgaand venster met hoge plasticiteit te rijden.

In de tweede stap worden gewiste cellen ingekapseld in microbioreactoren van polytetrafluorethyleen (PTFE), ook bekend als Liquid Marbles, om de herschikking van 3D-cellen te bevorderen om de verworven hoge plasticiteit uit te breiden en stabiel te behouden. PTFE is een niet-reactieve hydrofobe synthetische verbinding en het gebruik ervan maakt het mogelijk een cellulaire micro-omgeving te creëren, die niet kan worden bereikt in traditionele 2D-kweeksystemen. Dit systeem stimuleert en verhoogt het behoud van pluripotentie door middel van bio-mechanosensing-gerelateerde signalen.

De hier beschreven technische procedures zijn eenvoudige strategieën om de inductie en het onderhoud van een hoge plasticiteitstoestand in volwassen somatische cellen mogelijk te maken. Het protocol maakte de afleiding van cellen met een hoge plasticiteit mogelijk in alle geteste zoogdiersoorten. Aangezien het geen gebruik van gentransfectie inhoudt en vrij is van virale vectoren, kan het een opmerkelijke technologische vooruitgang betekenen voor translationele geneeskundetoepassingen. Bovendien biedt het microbioreactorsysteem een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïdetechnologie door in vitro een specifieke micro-omgeving te creëren die de langetermijncultuur van cellen met een hoge plasticiteit mogelijk maakt, namelijk als SER's, iPSC's, epigenetisch gewiste cellen en MSC's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedurende de laatste decennia werd het algemeen aanvaarde concept van unidirectionele progressie naar celbetrokkenheid en differentiatie volledig herzien. Het is aangetoond dat celspecificatie kan worden omgekeerd en dat een terminaal gedifferentieerde cel met behulp van verschillende methoden naar een minder toegewijde en hogere permissieve toestand kan worden geduwd.

Van de verschillende voorgestelde methoden is een van de meest veelbelovende methoden het gebruik van chemische verbindingen om cellen te induceren in een zogenaamde chemisch geïnduceerde pluripotentie. De kleine moleculen die in deze benadering worden gebruikt, zijn in staat om te interageren en de epigenetische signatuur van een volwassen volwassen cel te wijzigen, waardoor de noodzaak van transgene en / of virale vector 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 wordt vermeden . Talrijke studies hebben onlangs aangetoond dat het mogelijk is om cellen van het ene fenotype naar het andere te schakelen door specifieke biochemische en biologische stimuli te bieden die de reactivering van gehypermethyleerde geneninduceren 11,12,13,14,15. Deze demethylerende gebeurtenissen maken de omzetting van terminaal gedifferentieerde cellen in een primitieve voorloper, een multipotent of een hoge plasticiteit/pluripotente cel 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 mogelijk.

Tegelijkertijd hebben veel studies zich onlangs gericht op het begrijpen van mechanosensing-gerelateerde signalen en, meer specifiek, op de mogelijkheid om mechanische krachten te gebruiken om celplasticiteit en / of differentiatie direct te beïnvloeden 16,17,18,19. Het is inderdaad duidelijk aangetoond dat de extracellulaire matrix (ECM) een sleutelrol speelt in de controle van het lot van cellen. In het bijzonder reguleren de biomechanische en biofysische signalen geproduceerd door ECM direct moleculaire mechanismen en signaalroutes, waardoor het gedrag en de functies van cellen worden beïnvloed20,21. Deze recente gegevens hebben de weg vrijgemaakt voor de ontwikkeling van nieuwe 3D-kweeksystemen die de in vivo celmicro-omgeving beter nabootsen en mechanische en fysieke stimuli repliceren die het celgedrag sturen.

We beschrijven hier een tweestapsprotocol dat het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen, om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren. In de eerste stap worden cellen geïncubeerd met het demethylerende molecuul 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Dit middel is in staat om een significante globale DNA-demethylering te induceren door een gecombineerd effect van de directe ten-eleven translocatie 2 (TET2)-gemedieerde actie 8,10 en de indirecte remming van de DNA-methyltransferasen (DNMT)22,23. Deze stap induceert de verwijdering van de epigenetische blokken met een daaropvolgende heractivering van pluripotentie-gerelateerde genexpressie en dus de generatie van cellen met een hoge plasticiteit 1,2,3,8,10, hierna "epigenetisch gewiste cellen" genoemd. In de tweede stap worden cellen ingekapseld in een 3D-kweeksysteem. Hiertoe wordt de niet-reactieve hydrofobe synthetische verbinding polytetrafluorethyleen (PTFE; met een deeltjesgrootte van 1 μm) gebruikt als microbioreactor, die het mogelijk maakt een cellulaire micro-omgeving te creëren die onhaalbaar is door het gebruik van traditionele 2D-kweeksystemen10. De PTFE-poederdeeltjes hechten zich aan het oppervlak van de vloeistofdruppel waarin cellen opnieuw worden gesuspendeerd en isoleren de vloeibare kern van het ondersteunende oppervlak, terwijl gasuitwisseling tussen de inwendige vloeistof en de omgevingmogelijk is 24. De aldus verkregen "PTFE-microbioreactor", ook bekend als "Liquid Marble", moedigt cellen aan om vrij met elkaar te communiceren, bevordert 3D-celherschikking 25,26,27, en verlengt en handhaaft stabiel de verworven hoge plasticiteitstoestand door middel van bio-mechanosensing-gerelateerde signalen 10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Milaan. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH). Menselijke celisolatie van gezonde volwassen personen werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Alle methoden in onze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.

1. Isolatie van fibroblasten van de huid

OPMERKING: Alle hieronder beschreven procedures kunnen worden toegepast op fibroblasten geïsoleerd van verschillende zoogdiersoorten, waaronder muizen, varkens en mensen. Muizencellen werden geïsoleerd uit 7 weken oude mannelijke muizen en huidweefsel van varkens werd verzameld in het plaatselijke slachthuis. Menselijke cellen werden geïsoleerd van volwassen patiënten, na schriftelijke geïnformeerde toestemming.

  1. Bereid 0,1% varkensgelatine-oplossing.
    1. Weeg 0,1 g varkensgelatine en los deze op in 100 ml water. Steriliseer gelatine-oplossing door autoclaveren voor gebruik.
    2. Bestrijk de petrischaal van 35 mm met 0,1% varkensgelatine door 1,5 ml van de bereide oplossing toe te voegen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  2. Snijd huidbiopten van ongeveer 2-5 cm van ongeveer 2-5 cm lang voor zoogdieren (muis, varkens en mensen) en plaats ze in Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) met 2% antibiotische antimycotische oplossing. Bewaren bij + 4 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Biopsiecollecties moeten worden uitgevoerd in overeenstemming en na goedkeuring van de Ethische Commissie, in overeenstemming met de vastgestelde richtlijnen.
  3. Was de verzamelde biopten driemaal uitgebreid in verse steriele PBS met 2% antibiotische antimycotische oplossing.
  4. Verzamel biopten van de laatste was en plaats ze in een steriele petrischaal van 100 mm. Gebruik een steriel scalpel om ze in stukken van ongeveer 2 mm3 grootte te snijden.
  5. Verwijder na 2 uur incubatie het teveel aan gelatine-oplossing uit de petrischaal van 35 mm (beschreven in stap 1.1.2) en plaats met een steriel chirurgisch pincet onmiddellijk 5-6 huidfragmenten in elke voorgecoate kweekschaal.
  6. Maak de fragmenten nat door over elk van hen 100 μL druppels fibroblastisolatiemedium (tabel 1) toe te voegen. Kweek bij 37 °C in 5% CO2 incubator.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat het medium verdampt, plaatst u de petrischaal van 35 mm in een petrischaaltje van 100 mm of groter met steriel water. Zorg ervoor dat u beide petrischalen afsluit.
  7. Controleer na 24 uur cultuur de hoeveelheid van het medium in de 35 mm kweek petrischaal. Voeg indien nodig 500 μL fibroblast isolatiemedium toe om de fragmenten nat te houden.
  8. Verwijder het medium voorzichtig en ververs het minstens om de 2 dagen met een pipet.
  9. Wanneer fibroblasten beginnen te groeien uit de huidfragmenten die in de 35 mm petrischaal (beschreven in stap 1.5.) worden geplaatst en een celmonolaag beginnen te vormen (meestal 6 dagen). Verwijder huidstukken met een steriel chirurgisch pincet en kweek in 2 ml fibroblastisolatiemedium.
  10. Blijf de celmonolaag bij 37 °C kweken in een 5% CO2-incubator tot 80% confluentie en ververs het medium om de andere dag.

2. Fibroblast primaire cellijn cultuur

  1. Wanneer fibroblasten 80% confluentie bereiken, verwijder dan zorgvuldig fibroblastisolatiemedium en was cellen drie keer met 3 ml PBS met 1% antibiotische antimycotische oplossing.
  2. Voeg voor het losmaken van cellen 600 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan de kweekschaal en incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 minuten.
  3. Voeg 5,4 ml fibroblastkweekmedium toe om trypsine te neutraliseren wanneer cellen beginnen los te komen van de kweekschaal (tabel 1).
  4. Losmaken cellen door herhaald en zacht pipetteren. Plaatcellen in nieuwe kweekschalen (zonder gelatine), waarbij de doorgangsverhouding tussen 1:2 en 1:4 blijft (afhankelijk van de groeisnelheid).
    OPMERKING: Centrifugeren is niet nodig.
  5. Houd cellen in cultuur en verander het medium om de 2 dagen, totdat ze 80% confluentie hebben bereikt en passeren ze.
    OPMERKING: Vermeerder fibroblasten twee keer per week om een krachtige groei te behouden.

3. Fibroblast blootstelling aan 5-aza-CR

  1. Bereid verse 1 mM 5-aza-CR stockoplossing.
    1. Weeg 2,44 mg 5-aza-CR af en los het op in 10 ml DMEM hoge glucose. Resuspend het poeder door vortexing. Steriliseer de oplossing met een filter van 0,22 μm.
      OPMERKING: 5-aza-CR stockoplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid.
    2. Bereid een 5-aza-CR-werkoplossing door 1 μL 5-aza-CR-stamoplossing (3.1.1.) te verdunnen in 1 ml fibroblastkweekmedium.
      OPMERKING: De concentratie van de 5-aza-CR werkoplossing is 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Trypsiniseren cellen zoals eerder beschreven (2.1.-2.3.) en verdrijven cellen door herhaaldelijk en voorzichtig te pipetteren.
  3. Verzamel de celsuspensie en breng deze over in een conische buis.
  4. Tel cellen met behulp van een telkamer onder een optische microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het volume medium dat nodig is om cellen opnieuw te suspenspensie om 4 x 104 cellen te verkrijgen in 30 μL fibroblastkweekmedium aangevuld met 1 μM 5-aza-CR (zie stap 3.1.2.).
    OPMERKING: De te gebruiken formule is afhankelijk van het specifieke type kamer.
    figure-protocol-1
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 150 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en resuspend pellet met het fibroblastcultuurmedium aangevuld met 1 μM 5-aza-CR (zie stap 3.1.2.). Voor het volume van het te gebruiken fibroblastenkweekmedium, zie stap 3.4.
    OPMERKING: Als negatieve controle, resuspend cellen met dezelfde concentratie in fibroblast cultuurmedium zonder 5-aza-CR en gaan verder met celinkapseling in PTFE poeder (stap 4.1.-4.13.).

4. Fibroblast inkapseling in PTFE micro-bioreactoren

  1. Vul een petrischaaltje van 35 mm met polytetrafluorethyleen (PTFE) poeder om een bed te produceren (figuur 1A).
    OPMERKING: Gebruik 35 mm bacteriologie petrischalen om de hechting van vloeibaar marmer te voorkomen. Om een dunne hydrofobe en poreuze schil te verkrijgen, gebruikt u een PTFE-poeder met een gemiddelde deeltjesgrootte van 1 μm en geproduceerd met een maximale maling van 2,0 NPIRI. Dit maakt het mogelijk om gasdoorlatende vloeibare knikkers te maken. Bovendien vergemakkelijkt de doorschijnende coating de observatie van celaggregatieprocessen in realtime Grotere deeltjesgrootte leidt tot hoge polydispersiteit die verhoogde verdamping, misvorming en verlies van de bolvorm kan veroorzaken, en de voortijdige oplossing van de micro-bioreactoren.
  2. Doseer 30 μL enkele druppel met 4 x 104 cellen (zie stappen 3.4.- 3.5.) op het poederbed (figuur 1B).
  3. Draai de petrischaal van 35 mm voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat PFTE-poeder het oppervlak van de vloeistofdruppel volledig bedekt om een vloeibare marmeren microbioreactor te vormen (figuur 1C).
  4. Pak de vloeibare marmeren micro-bioreactor op met behulp van een pipetpunt van 1.000 μL, gesneden aan de rand, om de diameter van het marmer te accommoderen (figuur 1D, E). Plaats de vloeibare marmeren micro-bioreactor op een schone bacteriologie petrischaal om deze te stabiliseren (figuur 1F).
    OPMERKING: Om een wrijving te creëren om het marmer in de punt vast te pakken, snijdt u de pipetpunten met een diameter die ongeveer iets kleiner is dan de diameter van het vloeibare marmer.
  5. Breng de vloeibare marmeren micro-bioreactor van de petrischaal over in een 96-putplaat (één marmer/put) (figuur 1G).
  6. Voeg langzaam 100 μL media toe vanuit de marge van de put. De micro-bioreactor begint bovenop de media te zweven (figuur 1H).
    OPMERKING: De micro-bioreactor breekt in direct vloeistofcontact, als gevolg van de verstoring van PTFE hydrofobiciteit. Als alternatief kunnen de vloeibare marmeren microbioreactoren individueel in een bacteriologische kweekschaal van 35 mm worden geplaatst. In dit geval moet, om verdamping van vloeibaar marmer te voorkomen, de 35 mm petrischaal met de microbioreactor worden ingebracht in een petrischaal van 100 mm, die eerder is gealiquoteerd met steriel water
  7. Incubeer vloeibare marmer micro-bioreactor gedurende 18 uur bij 37 °C in 5% CO2 incubator 1,2,3,8,9.
    OPMERKING: De PTFE-deeltjesgrootte van 1 μm kan zorgen voor een optimale gasuitwisseling tussen de inwendige vloeistof en de omgeving.
  8. Na 5-aza-CR incubatie gedurende 18 uur, verzamelt u de vloeibare marmeren micro-bioreactor met behulp van een 1.000 μL pipetpunt die aan de rand is gesneden (zie stap 4.5).
  9. Plaats de microbioreactor in een nieuwe 35 mm bacteriologie petrischaal (figuur 1D-F).
  10. Gebruik een naald om het vloeibare marmer te doorboren en te breken.
  11. Herstel gevormde sferoïden met een pipetpunt van 200 μL, gesneden aan de rand, onder een stereomicroscoop (figuur 1I,J).
    OPMERKING: Epigenetisch gewiste cellen ingekapseld in PTFE vormen een 3D-bolvormige structuur (één aggregaat in elke vloeibare knikker).
  12. Om de verwerving van pluripotente toestand in reactie op 5-aza-CR te beoordelen, controleert u het begin van de pluripotentie-gerelateerde genexpressie, OCT4, NANOG, REX1 en SOX2, door kwalitatieve PCR (tabel 2).
  13. Ga verder met de tweede stap van het protocol zoals hieronder beschreven.

5. Kweek in PTFE micro-bioreactoren van epigenetisch gewiste cellen

  1. Bereid vers ESC-kweekmedium (tabel 1).
  2. Breng organoïden over in een petrischaaltje met ESC-medium voor het wassen van 5-aza-CR-resten (zie stappen 5.1.-5.2.).
  3. Bereid een nieuwe 35 mm bacteriologie petrischaal met PTFE-poederbed (zie ook stap 4.1.).
  4. Doseer een enkele organoïde in een druppel van 30 μL ESC-kweekmedium op het poederbed met behulp van een pipetpunt van 200 μL, gesneden aan de rand (zie stap 4.9.; 5.3.).
  5. Draai de petrischaal van 35 mm voorzichtig in een cirkelvormige beweging om een nieuwe vloeibare marmeren microbioreactor te vormen, pak deze op met een pipetpunt van 1.000 μL, snijd aan de rand en plaats de nieuw gevormde microbioreactor in een put van 96-putplaat (één marmer / put) (zie stappen 4.3.-4.6.).
  6. Om de microbioreactoren te laten drijven, voegt u 100 μL media uit de rand van de put toe om het marmer langzaam te baden (zie noot 4.7.).
  7. Kweek vloeibare marmeren micro-bioreactoren bij 37 °C in een 5% CO2-incubator zo lang als nodig is. Wissel om de dag van medium volgens de procedure beschreven in 5.3.-5.7.
    OPMERKING: In dit manuscript worden resultaten verstrekt die zijn verkregen met organoïdencultuur gedurende 28 dagen. Indien nodig kan echter een langere kweekperiode worden uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft alle stappen die moeten worden uitgevoerd om pluripotente zoogdiercellen uit volwassen somatische cellen te genereren en stabiel te onderhouden. Deze methode is succesvol geweest met fibroblasten geïsoleerd van verschillende zoogdiersoorten, namelijk muis, varken en mens. De hier gerapporteerde representatieve resultaten zijn verkregen uit alle cellijnen, ongeacht de soort van herkomst.

Morfologische analyses tonen aan dat, na 18 h incubatie met het demethyleren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen decennia hebben verschillende studies zich gericht op de ontwikkeling van strategieën om een terminaal gedifferentieerde cel terug te brengen naar een minder toegewijde en hogere permissieve toestand. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om pluripotente cellen te genereren en op lange termijn te onderhouden, te beginnen met volwassen volwassen terminaal gedifferentieerde cellen. De methode combineert twee onafhankelijke stappen die de inductie van een hoge permissieve toestand omvatten die word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en MiND FoodS Hub ID: 1176436. Alle auteurs zijn lid van de COST Action CA16119 In vitro 3-D totale celgeleiding en fitness (CellFit).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522Component van ESC-medium
5-AzacytidineSigma-AldrichA23855-aza-CR, voor fibroblast epigenetische wissen
AdenosineSigma-AldrichA4036Component van nucleosidemix voor ESC-medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955Component van fibroblast- en ESC-media
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNAThermische cycler voor kwantitatieve PCR
CytidineSigma-AldrichC4654Component van nucleosidemix voor ESC-medium
DMEM, hoge glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966052Voor fibroblastisolatie en kweekmedium
DMEM, lage glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific31885023Voor ESC-medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD5652PBS; voor biopsie en celwassing en voor oplossingsvoorbereiding
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA-extractie
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinSigma-AldrichESG1106Component van ESC-medium
Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, hitte-geïnactiveerdThermo Fisher Scientific10500064Component van fibroblast- en ESC-media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Component van ESC-medium
Gelatine van varkenshuidSigma-AldrichG1890Voor het coaten van schalen
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAThermische cycler voor kwalitatieve PCR
Global DNA Methylation ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380Methylatiestudie
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7801Kwalitatieve PCR
GuanosineSigma-AldrichG6264Component van nucleosidemix voor ESC-medium
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31550031Voor ESC-medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Component van ESC-medium
KOVA glasstic slide 10 with gridsHycor Biomedical87144Voor celtelling
Leica MZ APO Stereo MicroscopeLeicaNAVoor organoïdobservatie
L-Glutamine oplossingSigma-AldrichG7513Component van fibroblast- en ESC-media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Component van ESC-medium
Millex-GS 0.22 µm poriefiltersMilliporeSLGS033SBVoor oplossingsterilisatie
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point MutantPromegaM3681mRNA omgekeerde transcriptie
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher Scientific51119000Voor ELISA-plaatlezing
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast MicroscopeNikonNAVoor celobservatie
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermische cycler voor omgekeerde transcriptie
Poly(tetrafluorethyleen) 1 μm deeltjesgrootteSigma-Aldrich430935Voor het genereren van microbioreactor
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genoom DNA extractie
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT KitThermo Fisher ScientificAM1728Kwantitatieve PCR
ThymidineSigma-AldrichT1895Component van nucleosidemix voor ESC-medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, StandardSarstedt833902Voor fibroblastisolatie
Tissue Culture Dish 35X10 mm, StandardSarstedt833900Voor fibroblastisolatie
Tissue Culture Dish 35X10 mm, SuspensionSarstedt833900500Bacteriologie petrischaal voor vloeibare marmercultuur
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,FSarstedt833924005Voor vloeibare marmercultuur
Trypsin-EDTA oplossingSigma-AldrichT3924Voor fibroblastdissociatie
Tube 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Voor centrifugatie van celsuspensie
UridineSigma-AldrichU3003Component van nucleosidemix voor ESC-medium

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Gerelateerde artikelen