Klonale analyse van het neonatale muizenhart met behulp van naaste-buurmodellering

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van meerkleurige afstammingstracering en nearest-neighbor modellering om klonaal afgeleide cardiomyocyten te identificeren tijdens groei en regeneratie bij muizen. Deze aanpak is objectief, werkt onder verschillende labelomstandigheden en kan worden aangepast om een verscheidenheid aan pijplijnen voor beeldanalyse op te nemen.

Samenvatting

Door verloren of disfunctioneel myocardium te vervangen, is weefselregeneratie een veelbelovende benadering om hartfalen te behandelen. De uitdaging om bonafide hartregeneratie te detecteren, beperkt echter de validatie van potentiële regeneratieve factoren. Een methode om nieuwe cardiomyocyten te detecteren is het traceren van meerkleurige afstammingslijnen met klonale analyse. Experimenten met klonale analyse kunnen moeilijk uit te voeren zijn, omdat labelaandoeningen die te schaars zijn, niet gevoelig zijn voor zeldzame gebeurtenissen zoals proliferatie van cardiomyocyten, en diffuse labeling het vermogen om klonen op te lossen beperkt. Hier wordt een protocol gepresenteerd om klonale analyse van het neonatale muizenhart uit te voeren door statistische modellering van naaste buurverdelingen te gebruiken om cardiomyocytklonen op te lossen. Deze benadering maakt het mogelijk om klonen te corrigeren over een reeks labelingsomstandigheden en biedt een robuuste analytische benadering voor het kwantificeren van de proliferatie en regeneratie van cardiomyocyten. Dit protocol kan worden aangepast aan andere weefsels en kan op grote schaal worden gebruikt om weefselregeneratie te bestuderen.

Inleiding

Een histologisch kenmerk van hartfalen is het verlies van cardiomyocyten (CM's), hetzij na letsel, veroudering of apoptose¹. Het aanvullen van verloren of disfunctioneel myocardium door weefselregeneratie vertegenwoordigt een potentiële therapeutische strategie voor het genezen van patiënten met hartfalen. In de afgelopen decennia hebben baanbrekende ontwikkelingen in de ontwikkelings- en regeneratieve biologie een beperkt vermogen van het hart van zoogdieren aan het licht gebracht om verloren CM's 2,3,4,5 aan te vullen. Dit opwindende werk heeft de mogelijkheid doen ontstaan dat aangeboren groeimechanismen kunnen worden ingezet voor regeneratie. Omdat aangeboren regeneratieve reacties functioneel afwezig zijn in het hart van volwassen zoogdieren, zijn methoden om de robuustheid van endogeen herstel te verbeteren nodig om therapeutische hartregeneratie te realiseren.

De mechanismen voor aangeboren hartregeneratie lijken bij verschillende soorten geconserveerd te zijn. Na verwonding vermenigvuldigen reeds bestaande CM's zich om nieuwe CM's te genereren in zebravissen ^6,7, salamanders ^8,9, muizen ^4,10, ratten¹¹ en varkens^12,13. Dienovereenkomstig proberen veel groepen mitogenen te identificeren die cardiomyogenese kunnen bevorderen. Dergelijk werk is echter een uitdaging. Niet alleen is de taak om CM's van volwassen zoogdieren te laten prolifereren ontmoedigend, maar het is ook moeilijk om zeldzame proliferatieve gebeurtenissen te kunnen identificeren ^1,14. De uitdaging om zeldzame cyclische CM's te identificeren, wordt nog verergerd door de neiging van volwassen CM's van zoogdieren om bij voorkeur endomitose te ondergaan. Bijvoorbeeld, na verwonding aan het muizenhart komt bijna 25% van de CM's in de grenszone opnieuw in de celcyclus, maar slechts 3,2% van de CM's deelt⁴. Omdat de meeste cyclische CM's hun genoom dupliceren, maar geen cytokinese ondergaan, is het simpelweg testen van een toename van het aantal cyclische CM's dubbelzinnig voor bonafide cardiomyogenese. Het is dus mogelijk dat testen voor nucleoside-incorporatie door CM's of voor de aanwezigheid van proliferatieve markers op CM's niet volledig op regeneratie duiden. Naarmate er meer kandidaat-factoren voor hartregeneratie naar voren komen, zijn tests nodig om CM-hyperplasie beter te identificeren.

Klonale analyse door middel van afstammingstracering is een waardevolle benadering van assay voor cardiomyogenese, omdat het de directe visualisatie van cellen en hun nageslacht mogelijk maakt. Traditionele benaderingen voor klonale analyse omvatten zeldzame labeling van afzonderlijke cellen met een reportergen. Het traceren van zeldzame cellen in één kleur kan echter van beperkte waarde zijn voor zeldzame gebeurtenissen zoals CM-proliferatie, omdat de kans op het labelen van een prolifererende CM laag is¹⁵. Als alternatief kan meerkleurige afstammingstracering de gevoeligheid voor klonale analyse verhogen¹⁶. Kortom, individuele cellen worden willekeurig genetisch gelabeld met een van de verschillende fluorescerende eiwitten, zodat prolifererende cellen homogeen gekleurde clusters van cellen genereren die kunnen worden opgelost uit naburige fluorescerende cellen. Deze methode is gebruikt om de groei in verschillende organen te traceren en is meer recentelijk toegepast op onderzoeken naar hartregeneratie bij zoogdieren^17,18. Hoewel het traceren van meerkleurige afstammingslijnen klonale expansie van CM's in embryonale en neonatale stadia kan detecteren, worden aangeboren regeneratieve reacties niet gemakkelijk gedetecteerd in het hart van volwassen muizen na hartletsel^17,19. Een benadering om de gevoeligheid van het traceren van meerkleurige afstammingslijnen te vergroten, zou zijn om het labelniveau te verhogen en de kans op het visualiseren van zeldzame gebeurtenissen te vergroten. Bredere etikettering gaat echter ten koste van het niet kunnen onderscheiden van op dezelfde manier gelabelde cellen die afkomstig zijn van een gemeenschappelijke voorouder versus cellen die onafhankelijk van elkaar zijn gelabeld met dezelfde fluorofoor. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat gebruikmaakt van nearest-neighbor modellering om klonaal verwante CM's in het neonatale muizenhart te identificeren. Deze methode is onbevooroordeeld, kwantitatief en werkt over een reeks etiketteringsomstandigheden.

Protocol

Alle procedures voor het omgaan met muizen, het uitvoeren van overlevingsoperaties en voor het oogsten van harten vereisen goedkeuring door een lokale institutionele commissie voor diergebruik.

1. Muizen voor klonale analyse van CM's

1. Kruis Myh6-MerCreMer-muizen²⁰ met Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw-muizen 21} om Myh6-MerCreMer te genereren; R26R-Rainbow bitransgene muizen.
   1. Houd voorraden muizen aan die homozygoot zijn voor het R26R-Rainbow-allel en kruis met muizen die heterozygoot zijn voor het Myh6-MerCreMer-allel, zodat alle experimenten worden uitgevoerd bij muizen die heterozygoot zijn voor het R26R-Rainbow-allel. Als alternatief kunnen muizen worden gebruikt die homozygoot zijn voor het R26R-Rainbow-allel om de kleurdiversiteit te vergroten, maar hiervoor is een beeldvormingssysteem nodig dat EGFP-, mCerulean-, mOrange- en mCherry-fluoroforen getrouw kan onderscheiden.
2. Voer genotypering uit op het moment van hartverzameling.
   OPMERKING: Myh6-MerCreMer-muizen brengen een tamoxifen-induceerbare Cre-recombinase tot expressie in CM's en kunnen worden gegenotypeerd met behulp van de PCR-primers CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) en GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) om een product van 200 basenpaar (bp) te genereren. R26R-Rainbow-muizen brengen EGFP constitutief tot expressie, maar zullen stochastisch mCerulean, mOrange of mCherry tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. R26R-Rainbow kan worden gegenotypeerd met de PCR-primers CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCAAGCAATA (R26-R) en TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). Het wildtype allel geeft een product van 350 bp en het Rainbow-allel geeft een product van 250 bp.

2. Cryoletsel en labeling van cardiomyocyten

1. Voer cryoletsels uit zoals eerder beschreven met kleine aanpassingen^22,23. Plaats muizen van een dag oud (P1) voorzichtig gedurende 3 minuten op een bed van gemalen ijs om een hartstilstand op te wekken. Bevestig voldoende anesthesie door een teenknijp uit te voeren zonder reflexieve terugtrekking.
   OPMERKING: De timing van de anesthesie is van cruciaal belang. De overleving kan in het gedrang komen als muizen te lang worden afgekoeld. Bovendien is de leeftijd van muizen van cruciaal belang. Het regeneratievermogen neemt sterk af in de eerste levensweek¹⁰.
2. Plaats de verdoofde pup op een coldpack en onder het doel van een chirurgische ontleedmicroscoop. Gebruik een microschaar van 6 mm om een thoracotomie uit te voeren tussen de 4e en 5e rib om het voorste oppervlak van het hart bloot te leggen.
3. Gebruik een cryosonde die is gekoeld met vloeibare stikstof en plaats de sonde gedurende 1-2 s op de linkerventrikel. Voer voor schijnverwondingen een thoracotomie uit zonder cryoletsel.
   OPMERKING: De duur van cryoletsel bepaalt de omvang van de verwonding. Langdurige blessures zullen de overlevingskansen verlagen.
4. Sluit de incisie met 6-0 polypropyleen hechtdraad bevestigd aan een naald met een diameter van 0,15 mm.
5. Verwarm de pup snel en stimuleer handmatig om de bloedstroom te hervatten. Zodra de pup spontaan beweegt, plaatst u deze op een verwarmingskussen.
6. Injecteer herstelde jongen met 20 μg tamoxifen intraperitoneaal. Injecteer nu indien nodig pijnstillers, zoals 0,25% bupivacaïne langs de hechtlijn. Breng de pups terug naar de dam.
   LET OP: Pups uit een enkel nest worden samen teruggevonden en samen teruggebracht naar de moeder. Deze workflow verbetert de overleving en heracceptatie van het strooisel door de moeder.

3. Oogsten van harten en verwerking voor histologische analyse

1. Oogst harten 20 dagen na de verwonding (dpi) of postnatale dag (P21), aangezien regeneratieve reacties op dit tijdstip¹⁰ kunnen worden waargenomen. Euthanaseer eerst muizen in een CO₂ -inhalatiekamer en breng ze vervolgens over naar een chirurgische microscoop.
   OPMERKING: Euthanasie moet worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor gebruik door dieren.
2. Zodra voldoende anesthesie is bevestigd, voert u een dubbele thoracotomie uit met behulp van een chirurgische microschaar om het hart bloot te leggen. Doordrenk vervolgens het hart met 1 ml 1 M KCl, 1 ml 4% paraformaldehyde en 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   OPMERKING: Adequaat wassen is nodig om intraventriculaire bloedstolsels te beperken die autofluorescentie kunnen veroorzaken tijdens het verkrijgen van beelden.
3. Ontleed na perfusie het hart en plaats het in een buisje met ten minste 1 ml PBS.
4. Gebruik een ontleedmicroscoop om de harten bij te snijden om de inbedding te optimaliseren. Een horizontale snede onder het atrium biedt een goede ondergrond voor het inbedden van de harten voor korte assecties.
   OPMERKING: Als alternatief kan men het hart dwars doorsnijden als lange assecties gewenst zijn.
5. Plaats de bijgesneden harten in 1 ml 30% (wt/vol) sucrose bij 4 °C gedurende 12-18 uur. Verwijder de monsters uit de sucroseoplossing. Plaats bijgesneden weefsel in blokken in met behulp van tissuebevriezingsmedia.
6. Vries het ingebedde weefsel snel in op droogijs en bewaar de blokken bij -80 °C.
7. Snijd bevroren hartblokken in secties van 10 μm met een cryostaat, monteer ze op geladen objectglaasjes en bewaar objectglaasjes bij -20 °C. Snijd harten serieel over 10 dia's. Dit wordt gedaan door een sectie op elk van de 10 dia's te monteren voordat u terugkeert naar de eerste dia om een andere sectie toe te voegen. Een dergelijke strategie beperkt de kans dat dezelfde CM's op meerdere secties op een bepaalde dia worden vastgelegd.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de blootstelling aan licht beperkt om verlies van fluorescentie te voorkomen.
8. Wanneer u klaar bent voor beeldvorming, ontdooit u dia's en rehydrateert u in PBS. Voeg een anti-fade montagemedium toe voordat u een #1.5 glazen dekglaasje aanbrengt. Bewaar afgedekte glaasjes in een afgedekte container bij 4 °C.
   OPMERKING: Voor de verwachte resultaten voor cryoletsel wordt de lezer verwezen naar eerder werk over dit onderwerp²³. Hartsecties hebben een hoge mate van autofluorescentie. Het gebruik van blusmiddelen, zoals Sudan Black, voorafgaand aan het aanbrengen van een dekglaasje kan helpen om autofluorescentie te verminderen. Voorzichtigheid is echter geboden om te voorkomen dat interessante fluoroforen worden gedoofd.

4. Beeldvorming

OPMERKING: De onderstaande stappen zijn van toepassing op het gebruik van een commerciële microscoop (zie Materiaaltabel) met een rechtopstaand breedveldfluorescentiesysteem met filterkubussen die zijn uitgerust om mCerulean-, EGFP-, mOrange- en mCherry-fluoroforen te onderscheiden, en software die bij deze opstelling is gekoppeld (zie Materiaaltabel). Aanvullende stappen zijn afhankelijk van het exacte beeldvormingssysteem dat wordt gebruikt.

1. Afbeelding van de hele dia met een vergroting van 5x met alleen het GFP-filter om een diakaart te maken.
2. Selecteer afzonderlijke secties op de diakaart die intact zijn en met beperkte autofluorescentie voor beeldvorming. Door de seriële doorsnede in sets van 10 objectglaasjes zullen aangrenzende secties ten minste 100 μm uit elkaar liggen, waardoor beeldvorming van dezelfde CM's wordt voorkomen.
3. Voer tegelscanbeeldvorming uit voor de afzonderlijke secties met behulp van een 20x-objectief met de mCerulean-, mOrange-, mCherry- en EGFP-filters. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven in figuur 1.
4. Sla afbeeldingen op in een formaat waarmee de individuele kanaalinformatie kan worden opgehaald. Zorg ervoor dat u de bestanden een naam geeft in een formaat dat het mogelijk maakt om het hart, de fluorofoor en de positie van de sectie in het hart te identificeren. Een systematische naamgevingsbenadering is vereist voor de onderstaande rekenstappen.

5. Analyse van afbeeldingen om gelabelde CM's te identificeren

1. Selecteer de afgebeelde secties die intact zijn uit elke set en verdeel ze willekeurig over alle screeners. Zorg ervoor dat screeners zich houden aan de volgende stappen voor elke afbeelding.
2. Gebruik voor elk kanaal (mCerulean, mOrange en mCherry) de tool 'Kleurbalans' op ImageJ²⁴ om de helderheid en het contrast van de afbeelding aan te passen zodat de gebruiker gelabelde cellen kan identificeren.
   OPMERKING: ImageJ is een gratis tool voor beeldanalyse die kan worden gedownload van https://imagej.net. Dit protocol gebruikte versie 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. Selecteer in ImageJ 'Metingen instellen' in het vervolgkeuzemenu 'Analyseren '. Selecteer in het venster dat wordt geopend 'Gebied | Zwaartepunt | Begrenzende rechthoek | Limiet tot drempel'.
   OPMERKING: De beeldaftrekmodule kan soms worden gebruikt om het fluorofoorsignaal te verbeteren ten opzichte van de autofluorescentie op de achtergrond. Als dit echter wordt uitgevoerd, moet het aftrekken systematisch worden gedaan voor alle afbeeldingen in een gegevensset.
4. Selecteer met de afbeelding van interesse geopend 'Tools' en selecteer vervolgens 'ROI-manager' in het vervolgkeuzemenu 'Analyseren'. Dit opent het venster 'ROI Manager'.
5. Selecteer het gereedschap 'Selecties uit de vrije hand' op de werkbalk ImageJ en traceer de cel van interesse (Afbeelding 2A). Eenmaal getraceerd, drukt u op 't' of gebruikt u de knop 'Toevoegen [t]' in het venster 'ROI-manager' (Afbeelding 2B). Herhaal dit voor alle cellen van een enkel kanaal.
   OPMERKING: Segmentatie en ROI's moeten voor elk kanaal afzonderlijk worden uitgevoerd.
6. Zodra alle cellen voor een bepaald kanaal zijn geselecteerd, slaat u de ROI's op als een .zip bestand. Doe dit door eerst 'Deselecteren' te selecteren in het venster 'ROI Manager' om er zeker van te zijn dat er geen enkele ROI wordt gemarkeerd. Klik vervolgens op het tabblad 'Meer' in het venster 'ROI-manager' en selecteer de optie 'Opslaan'. Dit opent de desktopnavigator, waar de ROI's worden opgeslagen als een .zip bestand.
7. Exporteer de metingen voor elk van de ROI's als een .csv bestand. Om dit te doen, moet u ervoor zorgen dat er geen enkele ROI wordt gemarkeerd, opnieuw door 'Deselecteren' te selecteren en vervolgens 'Meten' te selecteren in het venster 'ROI-manager'. Dit opent een nieuw venster 'Resultaten' met alle eerder geselecteerde metingen.
8. Selecteer in het venster 'Resultaten' 'Bestand' en selecteer vervolgens 'Opslaan als' in het vervolgkeuzemenu (Afbeelding 2C). Hierdoor wordt de desktopnavigator opnieuw geopend, zodat het bestand in het .csv formaat kan worden opgeslagen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de ROI's en metingen opslaat voordat u verder gaat met het segmenteren van het volgende kanaal.
9. Zorg ervoor dat u de bestanden een naam geeft in een formaat dat het mogelijk maakt om het hart, het kanaal en de positie van de sectie in het hart te identificeren. Bijvoorbeeld 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (bijvoorbeeld 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' voor de ROI's en 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' voor de bijbehorende metingen).
   OPMERKING: De onderstaande code gaat uit van de naamgevingsconventie hierboven. Voor een andere naamgevingsconventie moet de code worden gewijzigd.

6. Statistische analyse

OPMERKING: Cellen die dezelfde fluorofoor dragen, zijn een mix van klonaal afgeleide cellen (verwanten) en niet-verwante cellen die een willekeurige recombinatiegebeurtenis hebben ondergaan om dezelfde fluorofoor (niet-verwanten) tot expressie te brengen. Op basis van eerdere gegevens¹⁷ wordt aangenomen dat verwante cellen een nauwere fysieke nabijheid hebben dan niet-verwante cellen die dezelfde fluorofoor tot expressie brengen. Verwante en niet-verwante cellen kunnen dus worden onderscheiden op basis van een afstandsdrempel. Om de drempel te bepalen, moeten echter de naaste buurverdelingen voor verwante en niet-verwante cellen worden gedeconsolideerd. Gelukkig kunnen de verdelingen van de dichtstbijzijnde buur voor niet-verwante cellen worden geschat door de waarden van de dichtstbijzijnde buur te evalueren van elke cel naar de dichtstbijzijnde cel die een andere fluorofoor draagt. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het statistisch bepalen van een drempelafstand om klonaliteit te definiëren en voor het toekennen van een waarschijnlijkheid van verwantschap tussen cellen.

1. Bereken met behulp van de .csv bestanden uit sectie 5 de afstanden tot de dichtstbijzijnde buren voor elke cel in een hartschijf. Compileer deze resultaten in binnen-kanaal (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange en mCherry-mCherry) en tussen-kanaal (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry en mCherry-mCerulean) afstanden. Sla de resultaten op in twee .csv bestanden: één voor afstanden binnen het kanaal en één voor afstanden tussen kanalen.
   1. Installeer de Python^25-code die de numpy- en pandas-bibliotheken vereist.
      > pip install numpy; pip install panda's
   2. Bereken afstanden en exporteer .csv bestanden voor afstanden binnen en tussen kanalen met behulp van python snippet_6_1.py.
2. Lees de afstanden binnen en tussen kanalen in een R^{26-gegevensframe} en zet de hart-ID's om in een categorische variabele. Pas een ad-hoc gekozen drempel toe door te kijken naar histogrammen van de dichtstbijzijnde buur (Figuur 3A,C) om uitschieters te minimaliseren. Zorg ervoor dat u een drempel kiest die meer dan 90% van de afstanden tussen en binnen het kanaal dekt, met uitsluiting van de lange staart om te voorkomen dat u te veel past bij het geluid op grote afstanden van de dichtstbijzijnde buren. Dit protocol gebruikt een drempel van 400 μm (Figuur 3). Gebruik Rscript snippet_6_2.R om deze stap uit te voeren.
   OPMERKING: Als alternatief kan men meerdere segmenten modelleren als individuele variabelen. Dit protocol beperkt de complexiteit van het model tot het hartniveau voor eenvoudige modellering en schatting.
3. Verkrijg de natuurlijke logaritmen voor de afstanden binnen en tussen kanalen. Omdat cellen ruimte-innemende, niet-puntvormige entiteiten zijn, is de minimale afstandsverdeling van de dichtstbijzijnde buur gecentreerd rond een niet-nulwaarde en heeft deze asymmetrische staarten, aangezien de maximale afstand tussen celparen aanzienlijk groter kan zijn dan de mediaanwaarden (Figuur 3A,C). Gebruik de log-normale verdeling om dergelijke verdelingen te modelleren (Figuur 3B,D). Doe dit met behulp van Rscript snippet_6_3.R.
4. Gebruik het volgende Bayesiaanse model om de gemiddelden en varianties van de verwanten (α₂, σ_{2 2}) en niet-verwanten (α₁, σ²₁) te schatten, en de waarschijnlijkheid van afstanden binnen het kanaal die voortvloeien uit de verwantschapsverdeling (π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   waarin Unif(a,b) de uniforme verdeling op het interval [a,b] is, N(μ,σ²|l2 beperkt tot het interval (l,u), T₁(0,1|x>0) is de standaard Cauchy-verdeling (T met 1 vrijheidsgraad) beperkt tot de positieve halve lijn, bw.verd_i is de i^de gelogde afstand tussen het kanaalpaar en wi.dist_i is de i^{de i de} gelogde afstand van het kanaalpaar. Merk op dat de gelogde afstanden binnen het kanaal een tweecomponentenmengselverdeling hebben die de vermenging van verwante en niet-verwante celparen weerspiegelt.
   1. Voorzie het model indien mogelijk van informatieve priors. Dit protocol verwacht bijvoorbeeld dat de verwante cellen dichter bij elkaar staan dan niet-verwante cellen, dus dit wordt gegeven als een prior voor het gemiddelde van de verdeling van de afstanden. Gebruik vervolgens de runjags²⁷ - en coda²⁸ R-pakketten en het JAGS^29-programma voor parameterschatting (Rscript snippet_6_4.R).
5. Voer het JAGS-model uit met het aantal ketens dat overeenkomt met het aantal beschikbare CPU's. Gebruik Rscript snippet_6_5.R om deze stap uit te voeren. Laat de software draaien tot convergentie.
6. Gebruik metrische gegevens om te testen op convergentie van het algoritme, zoals de effectieve steekproefomvang (beschikbaar met runjags), de Gelman-Rubin-convergentiediagnose (beschikbaar met runjags) en de autocorrelatie (autocorr/autocorr.diag beschikbaar in coda). Controleer of het geschatte model goed past voor de afstanden tussen de dichtstbijzijnde buren door een Q-Q-plot te inspecteren, die een vergelijking op kwantielniveau uitzet van werkelijke en geschatte waarden voor afstanden tussen de dichtstbijzijnde buren met behulp van Rscript snippet_6_6.R (Figuur 4C,F). Dit script vereist dat de gebruiker de waarden in de regels 25-29 van snippet_6_6.R bewerkt op basis van de uitvoer van Command 6.
   OPMERKING: Idealiter zou een effectieve steekproefomvang (SSeff) van meer dan 10.000 moeten worden verkregen voor elk van de parameters³⁰. Een SSeff groter dan 2.500 kan echter geschikt zijn voor sommige complexe modellen. De diagnose van Gelman Rubin is 1,00 voor perfecte convergentie en moet lager zijn dan 1,05 voor bevredigende convergentie. Een hoge autocorrelatie duidt op een langzame menging binnen ketens en is een indicator van langzame convergentie. De autocorrelatiegrafiek moet in het geval van een goed model een exponentieel verval volgen. De Q-Q-plot van werkelijke en gemodelleerde naaste-buurverdelingen (Figuur 4C,F) moet de diagonaal zo nauwkeurig mogelijk volgen.
7. Nadat u de nauwkeurigheid van de modellen hebt geverifieerd, verkrijgt u de waarschijnlijkheid dat een paar cellen verwant is als functie van hun afstand. Om een drempelafstand te bepalen om te bepalen of cellen in het kanaal waarschijnlijk verwant zijn, identificeert u de afstand waarop de kans om verwant te zijn onder 0,5 daalt. Dit kan worden gedaan met behulp van Rscript snippet_6_7.R.
   OPMERKING: Alternatieve drempels kunnen worden gekozen op basis van experimentele doelen. Voor sommige toepassingen zijn drempels mogelijk niet relevant en kan de waarschijnlijkheid om een verwantenpaar te zijn direct worden gebruikt om celparen te wegen.

Resultaten

Het volgen van het protocol voor neonatale cryoletsel zou P21-harten moeten opleveren met en zonder letsel. Cryobeschadigde harten hebben een goed omschreven verwonding, terwijl het oppervlak van schijnharten glad en homogeen is. Bij cryogewonde harten moet het gebied van de verwonding consistent zijn van hart tot hart. Na microscopie moeten beelden worden verkregen die lijken op figuur 1. Merk op dat de beeldresolutie het mogelijk maakt om individuele CM's ...

Discussie

Veelkleurige afstammingstracering is een krachtige benadering om patronen van orgaangroei te identificeren met een resolutie van één cel. Een belangrijke beperking van het traceren van veelkleurige afstammingslijnen is echter de noodzaak van schaarse labeling van cellen, wat de gevoeligheid voor het identificeren van zeldzame gebeurtenissen kan verminderen. Voor organen zoals het hart met notoir lage niveaus van parenchymale celvernieuwing kan dit leiden tot onderschattingen van groeirea...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#1.5 glass coverslip	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Anti-fade mounting medium	FisherScientific	00-4958-02
CO2 inhalatiekamer
Koude pak
Cryomolds	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Filter cubes
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw muizen
ImageJ software			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 cryostat
Vloeibare Stikstof
Microschaar, 6 mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2 muizen	The Jackson Laboratory	005657
Naaldhouder	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyde 4%	FisherScientific	AC416785000
Fosfaat gebufferd zoutoplossing
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Roterende schudder
Stereoscoop
Sucrose 30% (wt/vol)	FisherScientific	BP220
Chirurgische dissectieschaart	World Precision Instruments	14393
Spuit voor tamoxifen	VWR	BD328438
Tamoxifen, 20 μg	Sigma	T5648
Weefselvriesmiddel	VWR	15148-031
White Frosted/Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 rechtopstaand breedveldfluorescentiesysteem
Zen 2.5 Blue software