Methodenartikel

Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology

DOI:

10.3791/61657

⸱

26 september 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een ultrasnelle westerse blotting-techniek wordt ontwikkeld door de kinetiek van antigeen-antilichaambinding te verbeteren door middel van cyclische draining- en replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een immunoreactieverhogend middel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een westerse vlek (ook wel immunoblot) is een canonieke methode voor biomedisch onderzoek. Het wordt vaak gebruikt om de relatieve grootte en overvloed van specifieke eiwitten te bepalen, evenals post-translationele eiwitaanpassingen. Deze techniek heeft een rijke geschiedenis en wordt nog steeds op grote schaal gebruikt vanwege de eenvoud. De westelijke vlekprocedure duurt echter uren, zelfs dagen, om te voltooien, met een kritiek knelpunt zijn de lange incubatietijden die de doorvoer beperken. Deze incubatiestappen zijn nodig vanwege de langzame diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar de geïmmobiliseerde antigenen op het membraan: de antilichaamconcentratie in de buurt van het membraan is veel lager dan de bulkconcentratie. Hier presenteren we een innovatie die deze incubatie-intervallen drastisch vermindert door de antigeenbinding te verbeteren via cyclische afvoer en aanvulling (CDR) van de antilichaamoplossing. We gebruikten ook een immunoreactieverhogende technologie om de gevoeligheid van de test te behouden. Een combinatie van de CDR-methode met een commercieel immunoreactieverhogend middel verhoogde het uitgangssignaal en verminderde de incubatietijd van antilichamen aanzienlijk. De resulterende ultrasnelle westerse vlek kan in 20 minuten worden bereikt zonder verlies van gevoeligheid. Deze methode kan worden toegepast op westerse vlekken met behulp van zowel chemiluminescente als fluorescerende detectie. Dit eenvoudige protocol stelt onderzoekers in staat om de analyse van eiwitexpressie in veel monsters beter te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een westerse vlek (ook bekend als een immunoblot) is een krachtige en fundamentele techniek in een breed scala aan wetenschappelijke en klinische disciplines. Deze techniek wordt gebruikt om de aanwezigheid, relatieve overvloed, relatieve moleculaire massa en post-translationele modificaties van eiwitten te onderzoeken1. In combinatie met digitale beeldanalyse kan deze methode op betrouwbare wijze de overvloed aan eiwitten en eiwitmodificaties analyseren2. Hoewel western blot routinematig wordt uitgevoerd, is het een tijdrovende en arbeidsintensieve methode. Lange incubaties van het antilichaam met membranen zijn vereist. Hier beschrijven we een wijziging van de incubatiemethode die deze beperking overwint zonder de gevoeligheid op te offeren.

Tijdens incubatie van het membraan zweven antilichamen in oplossing terwijl antigenen op het membraan worden geïmmobiliseerd. Vanwege hun hoge affiniteit is de snelheid van antilichaambinding aan het antigeen sneller dan de diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar het membraan. Hierdoor ontstaat een lage concentratie "uitputtingslaag" (figuur 1). Het kan uren duren voordat meer verre antilichamen het membraan bereiken via passieve diffusie, wat de belangrijkste factor is die verantwoordelijk is voor lange incubatietijden in deze techniek. Dit effect wordt de massatransportbeperking (MTL)3genoemd. Er is voorgesteld dat het herhaaldelijk aftappen en aanvullen van de antilichaambevattende oplossing de uitputtingslaag kan verstoren en MTL4kan overwinnen . Hier hebben we een unieke techniek ontwikkeld die dit cyclische draining and replenishing (CDR) concept implementeert om het effect van MTL in een traditioneel westers blotting protocol te verminderen en de vereiste incubatietijd te verkorten.

Om de detectiegevoeligheid met een korte incubatietijd te behouden, hebben we gebruik gemaakt van een immunoreactieverhogende technologie die de antigeen-antilichaamreactie versnelt, waardoor de signaal-ruisverhouding5wordt verbeterd. Veel in de handel verkrijgbare immunoreactieverhogende middelen (IRE) bestaan uit 2 componenten (oplossing 1 en 2, zie tabel met materialen). De eigen samenstelling of werkingsmechanisme van IRE is niet bekendgemaakt, maar we hebben eerder vastgesteld dat IRE de dissociatieconstante tussen het antigeen en het antilichaam in vastefasebindende tests heeft verminderd, wat erop wijst dat verhoogde affiniteit ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk is voor het versterkende effect van IRE6. De combinatie van CDR met IRE levert een ultrasnel westers vlekkenprotocol op dat de hele proceduretijd vermindert zonder in te boeten aan gevoeligheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SDS-PAGE en overdracht naar een PVDF-membraan

  1. Voer SDS-PAGE uit om eiwitten te scheiden op basis van de relatieve grootte.
    OPMERKING: Elk commercieel of zelfgemaakt gelsysteem is prima. Volg het protocol van de fabrikant.
  2. Breng gescheiden eiwitten van een gel over op een PVDF-membraan.
    OPMERKING: Gemeenschappelijke overdrachtsmethoden (halfdroge of natte overdracht) zijn geschikt. Volg het protocol van de fabrikant.

2. Blokkeren van PVDF membranen

  1. Incubeer de membranen gedurende 1 uur in geschikte blokkeerbuffers met agitatie bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Afhankelijk van het primaire antilichaam en detectiesysteem moet een geschikte blokkeringsbuffer worden geselecteerd. De meest typische blokkers zijn bijvoorbeeld BSA, vetvrije droge melk, caseïne en commerciële synthetische polymeren. PBS en/of TBS met 0,1% Tween20 zijn de meest gebruikte buffers. Deze blokkeringsstap kan 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd.

3. Incubatie met primair antilichaam

  1. Bereid 10% immunoreactieverhogende agent-1-oplossing (IRE-1) met gedestilleerd water. Vortex goed.
  2. Bereid het verdunde primaire antilichaam voor met 10% IRE-1. Meng het voorzichtig en grondig.
  3. Als u een groter membraan (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) gebruikt, voeg dan 8 ml van de antilichaamoplossing toe aan conische centrifugebuizen van 50 ml. Als u een kleiner membraan (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) gebruikt, voeg dan 3 ml van de antilichaamoplossing toe aan 14 ml polypropyleenbuis met ronde bodem(materialentabel).
  4. Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de blokkeeroplossing kort leeglopen. Steek het PVDF-membraan met gehandschoende vingers in deze buis en zorg ervoor dat het hele membraan aan de wand van de buis hecht. Wanneer het PVDF-membraan in een buis wordt gestoken, kijk dan naar de "eiwitzijde" van het membraan dat oorspronkelijk in contact kwam met de gel naar binnen. Sluit de dop goed.
  5. Steek de buis van 50 ml in een glazen fles voor de hybridisatieoven.
    OPMERKING: Wanneer voor deze incubatie 14 ml buizen worden gebruikt, plaatst u een buis van 14 ml in de buis van 50 ml, met behulp van een paar plastic ringhouders om de binnenband in het midden van de buis van 50 ml te houden.
  6. Zet de hybridisatieoven aan.
  7. Incubeer het membraan met 6 tpm rotatie gedurende ten minste 5 minuten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het membraan te allen tijde aan de muur hecht en dat de (binnen)buis horizontaal is om het membraan gelijkmatig te bedekken met de antilichaamoplossing. Kalibreer de verdunning van het antilichaam en de incubatietijd voorafgaand aan het eigenlijke experiment.

4. Membraanwas

  1. Stop de rotatie.
  2. Verwijder voorzichtig het PVDF-membraan met een pincet uit de buis en plaats het membraan in een container met 50 ml PBS-T.
  3. Spoel het membraan kort af met PBS-T.
  4. Spoel het membraan in de container af met gedestilleerd water totdat er geen bubbels verschijnen. Dit is om het grootste deel van het antilichaam te verwijderen.
  5. Breng het PVDF-membraan over van de container naar de saladespinner die 250 ml PBS-T bevat.
  6. Plaats de zeefmand in de spinner. Zorg ervoor dat het deksel goed is aangebracht.
  7. Activeer de spinner en voer deze ongeveer 20-30 s uit.
  8. Gooi de oplossing weg en spoel de binnenkant van de spinner kort af met gedestilleerd water.
  9. Voeg weer 250 ml PBS-T toe aan de spinner.
  10. Herhaal stap 4.6 en 4.7.

5. Incubatie met het secundaire antilichaam

  1. Bereid 10% immunoreactieverhogende agent-2-oplossing (IRE-2) met gedestilleerd water. Vortex goed.
  2. Bereid het verdunde secundaire antilichaam voor met 10% IRE-2. Meng het voorzichtig en grondig.
  3. Selecteer het volume van de antilichaamoplossing en -buis zoals vermeld in stap 3.3.
  4. Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de oplossing kort uitlekken. Steek het PVDF-membraan in de buis zoals vermeld in stap 3.4.
  5. Steek de buis van 50 ml in een glazen fles voor de hybridisatieoven.
  6. Zet de hybridisatieoven aan.
  7. Incubeer het membraan met 6 tpm rotatie gedurende ten minste 5 minuten. Zorg ervoor dat het membraan te allen tijde aan de muur hecht en dat de (binnen)buis horizontaal is om het membraan gelijkmatig te bedekken met de antilichaamoplossing.
    OPMERKING: Kalibreer de incubatietijd voorafgaand aan het eigenlijke experiment. Wanneer het secundaire antilichaam fluorescerend is geconjugeerd, voert u de incubatie in het donker uit.

6. Membraanwas

  1. Volg stap 4.1 tot en met 4.10.

7. Beeldverwerving

  1. Chemiluminescente detectie
    1. Plaats een stuk semi-transplantatie flexibele film (10 cm x 15 cm) op een vlakke ondergrond.
    2. Meng 2 componenten van het chemiluminescente substraat in een buis van 5 ml.
    3. Breng onmiddellijk 1,5 ml van het gemengde substraat over op de semitransplantatie flexibele film en plaats het PVDF-membraan erop. Breng vervolgens de rest van de substraatoplossing over op het membraan.
    4. Incubeer het PVDF-membraan met het gemengde substraat gedurende 1 minuut op een semi-transparante flexibele film.
    5. Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de substraatoplossing kort uitlekken.
    6. Sandwich het membraan tussen een paar transparantiefilms.
    7. Verkrijg het beeld in de chemiluminescente modus.
  2. Fluorescerende detectie
    1. Pak het PVDF-membraan op met een pincet en laat de oplossing kort uitlekken.
    2. Sandwich het membraan tussen een paar transparantiefilms.
    3. Verkrijg de afbeelding in de fluorescerende modus.
      OPMERKING: De stappen 7.1 en 7.2 moeten in de nabijheid van de beeldvormingsmachine worden uitgevoerd om een maximale gevoeligheid te garanderen.
    4. Wanneer het achtergrondsignaal hoog is, voert u een wasstap uit in een container met 80-100 ml PBS-T: 10 minuten spoelen 3 keer voor het primaire antilichaam en 5 minuten spoelen 6 keer voor het secundaire antilichaam.
      OPMERKING: Zowel primaire als secundaire antilichamen verdund met 10% IRE-oplossingen kunnen tot 8-10 keer worden gebruikt zonder verlies van gevoeligheid6. De oplossing moet tot 1 maand op 4 °C worden bewaard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit voorbeeld illustreert de effectiviteit van de CDR-methode samen met immuno-fenhancingtechnologie op western blot. Statische incubatie werd uitgevoerd op een semi-transparante flexibele film waar PVDF-membranen werden geïncubeerd met de antilichaamoplossing, terwijl cdr-incubatie zich in een hybridisatieoven bevond door roterende buizen die de membranen en de antilichaamoplossing bevatten (Movie). Figuur 2 toonde de hoeveelheden antigeen en antilichamen die nodig zijn voor chemiluminescen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot is een veel gebruikte analytische techniek om specifieke eiwitten te detecteren die ~40 jaar geleden werd ontwikkeld7,8. Sindsdien is de techniek verder geëvolueerd, waarbij latere innovaties de gevoeligheid, snelheid en kwantificering van de techniekverbeterden 2,9,10,11,12,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende belangen verklaard die rechtstreeks relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. werd ondersteund door Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, en H.N. en K.Y. waren door Valor en V Drug Overseas Training Scholarship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap CapFalcon352059
Apollo Transparency Film for Laser PrintersN/AN/AAlle soorten Laser Printer Transparency Film zijn prima.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600Elk soort beeldverwervingssysteem is prima voor chemiluminescente en/of fluorescente detectie.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer SolutionTOYOBONKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry MilkCarnationN/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheepGE HealthcareNA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkeyGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/AElke hybridisatie-oven is prima zolang de buizen gelijkmatig in een horizontale positie worden geroteerd.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore sizeMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLICOR926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary AntibodyLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrateseracare5430-0049
Mouse anti-ß actin antibodyMillipore SigmaA5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)LICOR927-40100Blocking Buffer voor fluorescente detectie
OXO Salad SpinnerOXO32480V2BElke saladespinner is prima zolang de PVDF-membranen krachtig worden gespoeld zonder te scheuren.
Parafilm Sealing FilmBemisParafilm M PM996semi-transparante flexibele film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge TubesFalcon352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tubeN/AN/ABereid in een machinewerkplaats
Rabbit anti-6X His tag antibodyAbcamab9108
Tween20Millipore SigmaP2287

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cyclisch afvoeren en aanvullenprote nedetectieantilichaamincubatiechemiluminescentiedetectiefluorescentiedetectiePVDF membraanblokkeringsbuffercentrifugesla berkom

Gerelateerde artikelen