Method Article

Tweedimensionale visualisatie en kwantificering van labiele, anorganische plantennutriënten en verontreinigingen in de bodem

DOI:

10.3791/61661

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een workflow voor sub-mm 2D visualisatie van meerdere labiele anorganische nutriënten- en verontreinigingsolute soorten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT) in combinatie met massaspectrometrie beeldvorming. Solutebemonstering en chemische analyse in hoge resolutie worden in detail beschreven voor het kwantitatief in kaart brengen van soluten in de rhizosfeer van terrestrische planten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor tweedimensionale (2D) visualisatie en kwantificering van de verdeling van labiele (d.w.z. reversibel geadsorbeerde) anorganische voedingsstof (bijv. P, Fe, Mn) en verontreiniging (bijv. As, Cd, Pb) solute soorten in de grond grenzend aan plantenwortels (de 'rhizosfeer') bij sub-millimeter (~ 100 μm) ruimtelijke resolutie. De methode combineert op gootsteen gebaseerde solutebemonstering door de diffusieve gradiënten in dunne films (DGT) techniek met ruimtelijk opgeloste chemische analyse door laser ablation inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS). De DGT-techniek is gebaseerd op dunne hydrogels met homogeen verdeelde analytselectieve bindingsfasen. De verscheidenheid aan beschikbare bindingsfasen maakt de voorbereiding van verschillende DGT-geltypen mogelijk volgens eenvoudige gelfabricageprocedures. Voor de implementatie van DGT-gel in de rhizosfeer worden planten gekweekt in vlakke, transparante groeicontainers (rhizotrons), die minimale invasieve toegang tot een grondgekweekt wortelsysteem mogelijk maken. Na een pre-groeiperiode worden DGT-gels aangebracht op geselecteerde gebieden die van belang zijn voor in situ solute bemonstering in de rhizosfeer. Daarna worden DGT-gels opgehaald en voorbereid voor de daaropvolgende chemische analyse van de gebonden solutes met behulp van LA-ICP-MS line-scan imaging. Toepassing van interne normalisatie met behulp van 13C en externe kalibratie met behulp van matrix-afgestemde gelnormen maakt verder de kwantificering van de 2D solute fluxen mogelijk. Deze methode is uniek in zijn vermogen om kwantitatieve, sub-mm schaal 2D-beelden van multi-element solute fluxen in bodem-plant omgevingen te genereren, die de haalbare ruimtelijke resolutie van andere methoden voor het meten van solute gradiënten in de rhizosfeer aanzienlijk overschrijden. We presenteren de toepassing en evaluatie van de methode voor het in beeld brengen van meerdere kationische en anionische solute soorten in de rhizosfeer van terrestrische planten en benadrukken de mogelijkheid om deze methode te combineren met complementaire solute beeldvormingstechnieken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nutriëntenaankopen door gewasplanten zijn een belangrijke factor bij het bepalen van de gewasproductiviteit. De processen voor een efficiënte opname van voedingsstoffen door gewassen zijn intensief bestudeerd, vooral de mechanismen die de beschikbaarheid van voedingsstoffen voor en de internalisering van voedingsstoffen door plantenwortels aan de grondwortelinterface, de rhizosfeer, beheersen, worden erkend voor hun rol bij de verwerving van gewasnutriënten. Belangrijke processen voor de opname van plantennutriënten zijn: nutriëntentransport naar de wortel; dynamisch sorptieevenwicht tussen soorten opgelost in het bodemporiënwater en soorten die gebonden zijn aan vaste bodemoppervlakken; microbiële concurrentie voor nutriënten; microbiële mineralisatie van voedingsstoffen die zich in organisch materiaal in de bodem bevinden; en nutriënten internalisatie in het wortelsymplasma. De opname van anorganische sporenmetaal(oid) verontreinigingen wordt grotendeels gecontroleerd door dezelfde mechanismen.

Afhankelijk van de beschikbaarheid van voedingsstoffen en verontreinigingen, de vraag naar planten en de diffusiviteit in de bodem, kunnen differentiële voedingspatronen in de rhizosfeer worden waargenomen. Voor sterk absorberende elementen met relatief hoge internalisatiesnelheden (bijv. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb) wordt uitputting van de labiele (d.w.z. reversibel geadsorbeerde) elementfractie in vergelijking met de bulkgrond gevonden, waarbij de breedte van de uitputtingszone vaak wordt ≤1 mm, terwijl voor meer mobiele voedingsstoffen zoals NO3-, uitputtingszones zich kunnen uitstrekken tot enkele centimeters1. Bovendien is accumulatie van elementen zoals Al en Cd waargenomen wanneer de beschikbaarheid de opnamepercentages van installaties overschrijdt2,3.

Gezien het belang van rhizosfeerprocessen in de cycli van nutriënten en verontreinigingen zijn verschillende technieken ontwikkeld voor het meten van de beschikbare elementfractie bij hoge ruimtelijke resolutie4,5. Het meten van kleinschalige labiele solute-distributies is echter om verschillende redenen een uitdaging gebleken. Een groot probleem is het bemonsteren van zeer kleine (lage μL-bereik) volumes grond en/of poriewater op gedefinieerde posities naast levende plantenwortels om de steile nutriëntengradiënten in de rhizosfeer op te lossen. Een benadering om dit probleem aan te pakken is het gebruik van micro-zuignappen voor de extractie van poriewatermonsters6. Met deze methode hebben A. Göttlein, A. Heim en E. Matzner7 de concentraties van bodemporiën in de buurt van Quercus robur L. wortels gemeten bij een ruimtelijke resolutie van ~1 cm. Een moeilijkheid van het analyseren van μL volumes van bodem of bodemoplossing is, dat deze kleine steekproefvolumes, in combinatie met de lage concentraties van alle behalve de belangrijkste nutriëntensoorten, zeer gevoelige chemische analysetechnieken vereisen.

Een alternatief systeem, dat in staat is om nutriëntengradiënten op te lossen met een resolutie tot ~ 0,5 mm, is om een wortelmat op het oppervlak van een bodemblok te laten groeien, met een dunne hydrofiele membraanlaag die grond scheidt van de wortels8,9. In deze configuratie kunnen soluten door het membraan gaan en kunnen wortels voedingsstoffen en verontreinigingen uit de grond opnemen, terwijl worteluitwerpsies in de grond kunnen diffunderen. Na de vaststelling van een dichte wortellaag kan het bodemblok worden bemonsterd en gesneden om bodemmonsters te verkrijgen voor de daaropvolgende extractie van elementfracties. Op deze manier kunnen eendimensionale voedingsstof en verontreinigingsgradiënten, gemiddeld over een relatief groot gebied (~ 100 cm2) worden geanalyseerd.

Een andere uitdaging is het verkrijgen van monsters van de labiele, plant-beschikbare elementfractie, omdat de meeste chemische bodemextractietechnieken heel anders werken dan de mechanismen waarmee planten voedingsstoffen en verontreinigingen opnemen. In veel bodemextractieprotocollen wordt de bodem gemengd met een extractieoplossing met als doel een (pseudo-)evenwicht tot stand te brengen tussen opgeloste en gesorbeerde elementenfractie. Planten internaliseren echter voortdurend voedingsstoffen en putten daarom vaak geleidelijk de rhizosfeergrond uit. Hoewel evenwichtsextractieprotocollen op grote schaal zijn aangenomen als bodemtests omdat ze gemakkelijk te implementeren zijn, vertegenwoordigt de geëxtraheerde nutriëntenfractie vaak niet de beschikbare nutriëntenfractie goed10,11,12,13. Zinkmethoden die de bemonsterde bodem voortdurend uitputten voor nutriënten zijn voorgesteld als voordelige methoden en kunnen beter lijken op het onderliggende opnamemechanisme van voedingsstoffen door de wortelopnameprocessen na te bootsen10,11,14,15.

Naast de hierboven beschreven methoden zijn voor specifieke elementen en bodem (bio)chemische parameters echte beeldvormingstoepassingen ontwikkeld, die continue parameterkaarten met resoluties ≤100 μm kunnen meten over gezichtsvelden van enkele cm2. Autoradiografie kan worden gebruikt om de elementverdeling in de rhizosfeer in beeld te brengt, op voorwaarde dat geschikte radio-isotopen beschikbaar zijn16. Planaire optodes maken visualisatie van belangrijke chemische parameters in de bodem mogelijk , zoals pH en pO217,18,19, en enzymactiviteit of totale eiwitverdelingen kunnen in kaart worden gebracht met behulp van fluorescerende indicatorbeeldvormingstechnieken zoals bodemzymografie20,21,22,23 en/of wortelvlekkenmethoden24. Hoewel zymografie en autoradiografie beperkt zijn tot het meten van één parameter tegelijk, kunnen pH- en pO2-beeldvorming met behulp van planaire optodes gelijktijdig worden uitgevoerd. De meer traditionele wortelmattechnieken bieden alleen 1D-informatie, terwijl micro-zuignappen puntmetingen of 2D-informatie met lage resolutie bieden, maar beide benaderingen maken analyse van meerdere elementen mogelijk. Meer recent presenteerden P. D. Ilhardt, et al.25 een nieuwe benadering met behulp van lasergeïnduceerde afbraakspectroscopie (LIBS) om 2D-totale multi-elementverdelingen in kaart te brengen met een resolutie van ~ 100 μm in bodemwortelkernmonsters waarbij de natuurlijke elementverdeling werd behouden door zorgvuldige monstervoorbereiding.

De enige techniek die in staat is tot gerichte 2D-bemonstering van meerdere nutriënten- en verontreinigingsolutes bij hoge ruimtelijke resolutie is de diffusieve gradiënten in thin films (DGT) techniek, een op sink gebaseerde bemonsteringsmethode die labiele spoormetaal(loid) soorten ter plaatse immobiliseert op een bindmateriaal ingebed in een hydrogellaag26,27. DGT werd geïntroduceerd als een chemische speciatietechniek voor het meten van labiele soluten in sedimenten en wateren, en werd al snel aangenomen voor gebruik in bodems28. Het maakt multi-element solute beeldvorming op sub mmschaal mogelijk, die aanvankelijk werd aangetoond in een riviersediment29, en is verder ontwikkeld voor de toepassing ervan in plantensubizosferen30,31,32,33.

Voor DGT-bemonstering wordt een gelplaat van ongeveer 3 cm x 5 cm aangebracht op een enkele plantenwortel die groeit in de oppervlaktelaag van een bodemblok, waarbij een hydrofiel membraan de gel van de grond scheidt. Tijdens de contacttijd verspreiden labiele voedingsstoffen en/of verontreinigingen zich naar de gel en worden ze onmiddellijk gebonden door het bindmateriaal dat in de gel is verwerkt. Op deze manier wordt een concentratiegradiënt, en dus een continue nettoflux naar de gel, vastgesteld en heerst tijdens de bemonsteringstijd. Na bemonstering kan de hydrogel worden verwijderd en geanalyseerd met behulp van een analytische chemische techniek die ruimtelijk opgeloste analyse mogelijk maakt. Een zeer gespecialiseerde en veelgebruikte techniek voor dit doel is laserablatie inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS). In sommige vroege studies werd ook microdeeltjes geïnduceerde röntgenemissie (PIXE) gebruikt29. DGT-bemonstering in combinatie met LA-ICP-MS-analyse maakt chemische beeldvorming met meerdere elementen mogelijk met een ruimtelijke resolutie van ~ 100 μm. Als zeer gevoelige ICP-MS-technieken (bijv. sectorgebied ICP-MS) worden toegepast, kunnen uitzonderlijk lage detectielimieten worden bereikt. In een studie naar het effect van liming op Zn en Cd opname door maïs15, konden we labiele Cd in de maïs rhizosfeer in ongerontreinigde grond in kaart brengen met een detectiegrens van 38 pg cm-2 cd per gelgebied. DGT, planaire optodes en zymografie zijn gebaseerd op diffusie van het doelelement uit de bodem in een gellaag, die kan worden gebruikt voor gecombineerde toepassing van deze methoden om tegelijkertijd of achtereenvolgens een groot aantal parameters in beeld te brengen die relevant zijn voor de opname van plantenvoeding en verontreinigingen. Gedetailleerde informatie over analytische chemische aspecten van DGT-beeldvorming, over het potentieel van het combineren van DGT en andere beeldvormingsmethoden en over de toepassingen ervan wordt uitvoerig herzien in ref.34,35.

In dit artikel beschrijven we hoe we een solute imaging experiment kunnen uitvoeren met behulp van de DGT-techniek op wortels van terrestrische planten in een onverzadigde bodemomgeving, inclusief plantenteelt, gelfabricage, geltoepassing, gelanalyse en beeldgeneratie. Alle stappen worden in detail uitgewerkt, inclusief notities over kritieke stappen en experimentele alternatieven.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vervaardiging van DGT gels

OPMERKING: Er zijn verschillende DGT-geltypen beschikbaar voor 2D-beeldvorming van labiele solutesoorten met een hoge (sub-mm) ruimtelijke resolutie35. Hier wordt de fabricage van drie goed gekarakteriseerde hoge resolutie (HR)-DGT bindingsgels die worden gebruikt in solute imaging-toepassingen kort samengevat. Laboratoriumprocedures voor analyse van sporenelementen, evenals gedetailleerde fabricageprocedures van alle gepresenteerde HR-DGT-gels worden beschreven in de secties Ondersteunende informatie (SI) S1 en S2.

  1. Gemengde anion- en kationbindingsgel op basis van polyurethaan (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. Bereid een polyurethaangelsuspensie met homogeen gedispergeerde fasen zirkonium (IV) en iminodiacetaat (IDA).
    2. Bekleed de gelsuspensie in een dunne film op een glasplaat en start de gelvorming door oplosmiddelverdamping om een 0,1 mm dunne, scheurbestendige gemengde anion- en kationbindingsgel (HR-MBG) te verkrijgen.
  2. Polyacrylamide-zirkonia anionbindingsgel (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. Fabriceer een 0,4 mm dunne agarose cross-linked polyacrylamide gel (APA) volgens vastgestelde gelgietprocedures37 (zie SI S2.4 voor een gedetailleerd protocol van de APA-fabricage).
    2. Precipitaat zirkonium (IV) hydroxide faseert in de prefab APA gel om een 0,4 mm dunne anionbindingsgel (HR-ABG) te verkrijgen.
  3. Polyacrylamide-iminodiacetaat kationbindingsgel (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. Bereid een polyacrylamide gelsuspensie voor met homogeen verspreide IDA-fasen.
    2. Giet de gel tussen twee glasplaten en start de polymerisatiereactie om een 0,4 mm dunne kationbindingsgel (HR-CBG) te verkrijgen waarbij de IDA-fasen aan één kant van de gel worden geregeld.

2. Plantenteelt

OPMERKING: Het experimentele systeem gebruikt rhizotronen4 (figuur 1) om planten in onverzadigde grond te kweken voor solute beeldvorming. Eerst worden rhizotron grondvulling en water geven beschreven, waarna details over de experimentele plantengroei worden gegeven. Details over het rhizotronontwerp en de voorbereiding van het bodemsubstraat voordat het in de rhizotron wordt gevuld, worden weergegeven in de SI-sectie S3.

figure-protocol-1
Figuur 1: Rhizotron ontwerp (niet op schaal). (A) Geëxplodeerd zicht op een rhizotron groeicontainer. (B) Geassembleerde rhizotron tijdens de plantengroei. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Rhizotron grondvulling
    1. Voordat u de rhizotron vult met voorbevochtigde grond (gravimetrische waterinhoud, figure-protocol-2 , is bekend; zie SI S3.2), sluit u de drinkgaten aan de achterkant van de rhizotron met plakband en verwijdert u de voorplaat en de bevestigingsrails en schroeven.
    2. Weeg de lege rhizotron (exclusief de voorplaat, rails en schroeven), acht acrylplaten van 5 cm x 11 cm en 16 klemmen(Materialentabel)en noteer de som van de gewichten.
    3. Bevestig een kleine acrylplaat aan de onderkant van de rhizotron met behulp van twee klemmen aan elke kant, waarbij de druk van de klemmen op het rhizotronframe wordt gericht, zodat de plaat niet naar binnen buigt en het volume constant is.
    4. Schuin de rhizotron iets naar de kleine plastic plaat en vul met voorbevochtigde grond tot een hoogte van ~4 cm (Figuur 2A). Verdeel de grond in de rhizotron door de rhizotron lichtjes te roeren en druk de grond voorzichtig met enkele mm (afhankelijk van de specifieke bodemkenmerken) samen met een verdichtingsgereedschap (figuur 2B).
    5. Herhaal 2.1.3 - 2.1.4 totdat de rhizotron is gevuld met aarde (figuur 2C). Laat een opening van ~3 cm aan de bovenkant voor de daaropvolgende aanplant van zaailingen in de rhizotron.
    6. Weeg de met aarde gevulde rhizotron (inclusief 8 kleine platen en 16 klemmen) en noteer het gewicht. Trek hieruit het lege rhizotrongewicht af dat in 2.1.2 is verkregen en noteer het gewichtsverschil, d.w.z. de massa van vochtige grond, figure-protocol-3 (g), in de rhizotron.
    7. Bereken de massa van droge grond in de rhizotron, figure-protocol-4 (g), volgens Eq. 1, en bereken vervolgens de droge grond bulkdichtheid, figure-protocol-5 (g cm-3), in de rhizotron volgens Eq. 2.
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      Hier figure-protocol-8 is (cm3) het totale binnenvolume van de rhizotron.
      OPMERKING: Typische figure-protocol-9 waarden in de rhizotron liggen tussen 1,0-1,4 g cm-3. Niet hoger zijn dan 1,5 g cm-3, omdat de wortelgroei boven deze waarde kan worden belemmerd.
    8. Plaats de met aarde gevulde rhizotron op een steunbak en verwijder alle klemmen en kleine platen van de rhizotron (figuur 2D). Reinig het rhizotronframe (d.w.z. randen) zorgvuldig met tissuepapier, omdat resterende bodemdeeltjes op het frame lekken kunnen veroorzaken.
      OPMERKING: Het blootgestelde bodemoppervlak moet homogeen zijn en geëgeerd zijn met het rhizotronframe zonder scheuren of openingen. Zo niet, maak dan de wortelstoktron leeg en herhaal 2.1.2 - 2.1.8.
    9. Snijd twee stukken polytetrafluorethyleen (PTFE)(Materialentabel)folie tot 22 cm x 13 cm per stuk. Snijd daarnaast een stuk plastic folie tot 46 cm x 15 cm. Noteer de som van PTFE- en plastic foliegewichten. Plaats het eerste stuk PTFE-folie op de bovenste helft van het blootgestelde bodemoppervlak in de rhizotron en strek ~ 1 cm uit over het bodemniveau aan de bovenkant van de rhizotron.
    10. Bevestig de PTFE-folie voorzichtig aan het rhizotronframe met plakband(afbeelding 2E). Begin met het bevestigen van een hoek aan de bovenkant van de rhizotron eerst, gevolgd door de tegenovergestelde hoek en ten slotte de twee hoeken verder naar beneden de rhizotron. Breng spanning aan bij het bevestigen van de hoeken 2-4 om een vlak folieoppervlak te garanderen. Als er plooien ontstaan, open en bevestig de tape opnieuw op afzonderlijke hoeken (niet allemaal tegelijk) totdat alle plooien zijn verwijderd en de PTFE-folie vlak en aaneengesloten is met het bodemoppervlak.
    11. Plaats het tweede stuk PTFE-folie op de onderkant van de rhizotron en overlap het bovenste PTFE-foliestuk met ~ 1 cm. Herhaal 2.1.10 voor het bevestigen van de tweede PTFE-folie aan de rhizotron.
    12. Plaats de plastic folie (46 cm x 15 cm) op de PTFE folies. Bevestig de plastic folie met behulp van de fixatieprocedure zoals beschreven in 2.1.10.
    13. Plaats een voorplaat op de met aarde gevulde en met folie bedekte rhizotron. Plaats één rail aan elke kant van de rhizotron en draai de schroeven met de hand vast om de rails en daarmee de voorplaat aan de rhizotron te bevestigen. De schroeven worden naar de gesloten kant van de rhizotron geplaatst, d.w.z. de zijkant met de drinkgaten (figuur 1A).

figure-protocol-10
Figuur 2: Rhizotron assemblage en vulling om planten in de bodem te kweken voor solute beeldvorming in de rhizosfeer. (A) Bodemvulling in de rhizotron. (B) Verdichting van de gevulde grond met behulp van een verdichtingsgereedschap. (C) Met aarde gevulde rhizotron met kleine acrylplaten en klemmen. (D) Met grond gevulde rhizotron met blootgesteld bodemoppervlak. (E) Met grond gevulde rhizotron gedeeltelijk bedekt met een beschermende PTFE-folie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-11
Figuur 3: Rhizotron handling en DGT gel applicatie. (A) Bodembewatering met behulp van 10 ml pipetpunten in de drinkgaten aan de achterkant van de rhizotron. (B) Planten van zaailingen (aangegeven als groene vlekken) in de met grond gevulde en gesloten rhizotron. (C) Rhizotron beplant met Salix smithiana stekken en verwijderde voorplaat en plastic folie deksel. (D) Voorzichtig afpellen van de PTFE folie cover voor DGT gel aanbrengen. (E) Hoge resolutie foto van de bodem-wortel interface ROI. (F) Aanbrengen van de voorplaat voorzien van de DGT gel op de rhizotron. (G) Foto van de ROI met de DGT gel aangebracht tijdens solute sampling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Het water geven van de grond
    1. Bepaal de watervasthoudende capaciteit (WHC) van de experimentele grond in de rhizotron. Maak hiervoor twee rhizotrons met een open bodem en vul ze met grond zoals gespecificeerd in punt 2.1. Verzadig deze open, met grond gevulde rhizotronen volledig door onderdompeling in een waterreservoir gedurende 16 uur en laat de rhizotrons 8 uur uitlekken.
    2. Neem een samengesteld bodemmonster van ~50 g van willekeurige locaties in de rhizotrons met open bodem en droog het monster op 105 °C om te bepalen figure-protocol-12 volgens Eq. S1. De figure-protocol-13 vastgestelde komt overeen met de WHC van de bodem en wordt daarom uitgedrukt als figure-protocol-14 (g g-1).
    3. Definieer het doel figure-protocol-15 in de experimentele rhizotron. Stel tijdens de groeifase een figure-protocol-16 van 60 % van de WHC (d.w.z. de WHC-factor) in figure-protocol-17 om planten van voldoende water te voorzien en tegelijkertijd anoxische omstandigheden in het rhizotron te vermijden.
    4. Bereken de totale toe te voegen hoeveelheid figure-protocol-18 water(g), om de grond in de rhizotron op het doel te irrigeren figure-protocol-19 volgens Eq. 3. Houd rekening met de massa water in de grond in de figure-protocol-20 rhizotron(g).
      figure-protocol-21
    5. Deel figure-protocol-22 door het aantal rhizotron drinkgaten (hier 14) om de massa water te verkrijgen die in elke drinkplaats moet worden toegevoegd. Voeg water toe door 10 ml pipetpunten in de drinkgaten te duwen en het water door de zwaartekracht in de grond te laten stromen (figuur 3A).
  2. Plantengroei
    1. Voorkiem zaden van de experimentele plant (bijv. op nat filterpapier) volgens de specifieke zaadkiemingsvereisten totdat de radicle tevoorschijn komt (tot 1 cm lang).
    2. Plant maximaal twee zaailingen in de rhizotron zoals aangegeven in figuur 3B. Voeg bij het planten ~ 5 ml water rechtstreeks toe aan de zaailingen om hun groei te ondersteunen. Bedek de bovenste opening van de rhizotron gedurende de eerste ~ twee dagen na het planten met een transparante, vochthoudende film(Tafel van materialen). Wikkel de rhizotron in aluminiumfolie om microfytische groei te voorkomen.
      OPMERKING: Naast zaailingen kunnen plantenstekken ook in rhizotrons worden gekweekt.
    3. Breng de geplante rhizotron over in een groeiruimte, waarbij de omgevingsomstandigheden (d.w.z. temperatuur, vochtigheid, lichtintensiteit) zijn ingesteld op de specifieke plantvereisten. Schuin de rhizotron op 25°-35° om wortelontwikkeling langs de voorplaat via gravitropisme te garanderen.
    4. Tijdens de plantengroei handhaaft gravimetrisch het beoogde watergehalte in de rhizotron door elke 2-4 dagen periodiek water te geven met behulp van de rhizotron-drinkgaten zoals beschreven in 2.2.5. Houd het bodemoppervlak aan de bovenste opening vochtig door regelmatige toevoegingen van ~ 5 ml water.
      OPMERKING: Als planten voor langere tijd worden gekweekt en de plantbiomassa naar verwachting de hoeveelheid water die volgens de voorgestelde methode aan het rhizotron wordt toegevoegd, aanzienlijk zal verminderen, moet u rekening houden met het gewicht van de biomassa van de plant door planten in afzonderlijke rhizotron-replica's te kweken en de plantenweefsels met bepaalde tussenpozen te oogsten en te wegen.
    5. Zodra de wortels een geschikte plaats langs de voorplaat bereiken, bij voorkeur in het midden van de rhizotron, breng DGT-gels aan voor het bemonsteren van de rhizosferische soluteverdeling.

3. Bemonstering van de soluteverdeling

  1. Gel aanbrengen
    1. Verhoging figure-protocol-23 van de rhizotron van 60 % figure-protocol-24 tot 80 % figure-protocol-25 24 uur vóór het aanbrengen van de gel, zoals beschreven in 2.2.4.-2.2.5. Dit zorgt voor een goed contact tussen bodem en gel en zorgt voor een solute diffusie in de gel, terwijl anoxische bodemomstandigheden tijdens solutebemonstering worden vermeden.
    2. Neem een nieuwe, zuur gereinigde voorplaat, lijn deze uit op de rhizotron die wordt gebruikt voor bemonstering en markeer de interessegebieden (ROC's) op de plaat. Breng de plaat over in een laminaire stromingsbank of een andere stof- en metaalvrije omgeving, ongemarkeerde zijde naar boven gericht.
    3. Snijd de DGT-bindingsgel op een acrylsteun tot de vereiste rechthoekige grootte die overeenkomt met de ROI, meestal ongeveer 3 cm × 5 cm, met behulp van PTFE-gecoate scheermesjes. Snijd de gel door op het scheermesje te drukken in plaats van te schuiven om een duidelijke snede te garanderen. Plaats het rechthoekige gelstuk op de ongemarkeerde kant van de plaat op de gemarkeerde locatie van de ROI.
      OPMERKING: Als HR-MBG wordt gebruikt, kan een 100 μm dunne afstandsfolie onder de gel worden toegevoegd om ervoor te zorgen dat de gel in goed contact staat met het bodemwortelsysteem.
    4. Snijd een 10 μm-dun polycarbonaatmembraan (0,2 μm poriegrootte; Tabel met materialen) tot een maat die de gelgrootte met ≥1 cm aan elke kant uitbreidt en het membraan op de gel plaatst. Breng wat water aan om luchtbellen uit de stapel te verwijderen.
    5. Bevestig het membraan langs alle vier de randen met behulp van vinyl elektrische tape(Tabel met materialen). Verwijder daarbij voorzichtig luchtbellen die tussen de gel en het membraan zijn opgesloten met behulp van een plastic pincet. De tape mag alleen in contact komen met het membraan en niet met de gel.
      OPMERKING: Als de tape in contact komt met de gel, luchtbellen worden opgesloten tussen de gel en het membraan, of het uiteindelijke membraanoppervlak plooien vertoont, moet de gel/ membraanstapel opnieuw worden gemonteerd omdat de diffusieve flux van solutes in de gel kan worden aangetast35 (herhaal 3.1.3 - 3.1.5).
    6. Plaats de rhizotron op een standaard, verwijder de rails en til voorzichtig de voorplaat eraf (afbeelding 3C). Verwijder de plastic folie, snijd de PTFE-folie aan de randen van de rhizotron af en pel de PTFE-folie langzaam af om verstoring van het bodemwortelsysteem te voorkomen (figuur 3D).
    7. Maak een orthogonale foto van de ROI met behulp van een digitale single-lens reflex (DSLR) camera(Table of Materials)om de interpretatie en presentatie van de solute verdeling op basis van de bodemstructuur en wortelmorfologie te vergemakkelijken (Figuur 3E). Gebruik een camerastandaard en, indien beschikbaar, een macrolens. Lijn de camera zo uit dat het midden van de foto overeenkomt met het midden van de ROI en het scherpstelvlak van de camera evenwijdig is aan het bodemoppervlak. Voeg een schaalbalk (bijv. een liniaal) toe aan de foto.
    8. Bevestig de plaat met de gel/membraanstapel aan de open rhizotron (afbeelding 3F). Lijn daarom één rand van de plaat uit met een rand van de rhizotron en 'buig' de plaat voorzichtig naar de grond. Deze toepassingswijze helpt luchtbellen tussen de gel/membraanstapel en het bodemwortelsysteem te voorkomen. Bevestig de voorplaat met behulp van de rails en schroeven.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang en moet zorgvuldig worden uitgevoerd. De plaat kan niet worden verplaatst na het tot stand brengen van contact tussen de gel/membraanstapel en het bodemwortelsysteem zonder bodem en wortels te verplaatsen.
    9. Noteer de exacte begintijd van de gelimplementatie en maak een foto van de geïmplementeerde gel op de ROI zoals gegeven in 3.1.7 (Figuur 3G). Wikkel de rhizotron in aluminiumfolie en breng over in de groeiruimte tot het einde van de solute bemonsteringsperiode (vaak 24 uur).
  2. Het ophalen van de gel
    1. Plaats de rhizotron op een steundoos, til de voorplaat voorzichtig op en spoel de gel/membraanstapel op de plaat af met water om hechtende deeltjes af te wassen (figuur 4A). Noteer de exacte eindtijd van de gelimplementatie. Proefgrond van de ROI om de werkelijke w-bodem in de rhizotron te bepalen volgens Eq. S1.
    2. Breng de voorplaat over in de laminaire flowbank, gel/membraanstapel naar boven gericht. Haal de gel van de voorplaat door eerst de tape langs alle vier de randen voorzichtig te verwijderen en vervolgens het polycarbonaatmembraan dat de gel bedekt (figuur 4B). Breng water aan om de gel vrij te laten drijven op een dunne laag water op de plaat met de grondcontactzijde naar boven gericht.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de geloriëntatie bij te houden. De gelzijde die aan de grond en wortels wordt blootgesteld, moet altijd naar boven gericht zijn (naar de gebruiker).
  3. Het drogen van de gel
    1. Snijd een rechthoekig stuk gelvlekkenpapier(Materialentabel)en plaats een iets kleiner stuk van een polyethersulfonmembraan (0,45 μm poriegrootte; Tabel met materialen) bovenop.
    2. Breng de gel van de plaat over op de stapel gelvlekkenpapier/membraan met behulp van een plastic pincet, met de kant van het grondcontact naar boven gericht. De gel moet ontspannen (d.w.z. niet uitgerekt) en volledig plat zijn, zonder luchtbellen tussen gel en membraan. Breng wat water aan op de gelvlekkende papier/membraanstapel om de geloverdracht en -positionering te vergemakkelijken.
    3. Bedek het gelvlekkenpapier/membraan/gelstapel volledig met een stuk plastic folie en label het gelmonster en de oriëntatie ervan op de plastic folie (figuur 4C). Plaats de gelvlekkende papier/membraan/gel/plastic foliestapel in een vacuümgeldroger(Materialentabel)en droog tot de stapel volledig uitgedroogd is (meestal 48-72 uur). Stel voor HR-MBG de temperatuur in op 50-55 °C, voor HR-ABG en HR-CBG het beste droog bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het gelvlekkenpapier uit de gedroogde stapel en breng de gel, die nu onlosmakelijk is samengevoegd met het polyethersulfonmembraan, over in een ritszak. De plastic foliehoes blijft op de gel tot kort voor de LA-ICP-MS analyse.
    5. Voeg een gelstuk van het originele gelblad toe als een lege methode, die niet wordt blootgesteld aan grond. Verwerk de methode blanco gel identiek aan de monstergel na 3.3.2 - 3.3.4.

figure-protocol-26
Figuur 4: DGT gel retrieval en voorbereiding voor het drogen bij solute bemonstering. (A) Plaat met de DGT gel en rhizotron direct na solute bemonstering. (B) Ophalen van de DGT-gel van de plaat in een laminaire flowbank. (C) Stapel van gel blotting papier / polyethersulfon membraan / DGT gel / plastic folie cover voor gel drogen. Merk op dat de gel licht gekleurd is na zijn inzet op de rhizosfeergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Chemische analyse van de DGT-bindingsgel

OPMERKING: In dit protocol wordt de analyse van de soluteverdeling op de DGT-bindingsgel uitgevoerd door LA-ICP-MS met behulp van een nanoseconde 193 nm ArF excimer LA-systeem uitgerust met een tweedelige ablatiecel gekoppeld aan een viervoudigE ICP-MS (figuur 5). Alle instrumenten staan vermeld in de Materialentabel. Als alternatief kunnen nanoseconde 213 nm of 266 nm solid-state LA-systemen worden toegepast36,39,40,41,42,43. Indien een verbeterde gevoeligheid of massaresolutie vereist is , is ICP-MS op sectorgebied een alternatief voor viervoudige ICP-MS15,44. Details over de voorbereiding van DGT-gelnormen voor externe kalibratie en koppeling van het LA-systeem aan de viervoudige ICP-MS worden gepresenteerd in de SI-secties S4 en S5.

figure-protocol-27
Figuur 5: LA-ICP-MS setup voor DGT gel analyse. (A) Nanoseconde 193 nm ArF excimer LA systeem en viervoudig ICP-MS. (B) Gedroogde gels gemonteerd op glasplaten en bevestigd op de LA monsterfase klaar voor introductie in de ablatiecel. (C) Vernevelgas (Ar) van ICP-MS en aerosoldragergas (Hij of Ar) uit ablatiecel die via een tweeweg Y-splitter en toortsadapter op het ICP is aangesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Monstervoorbereiding voor LA-ICP-MS
    1. Breng de gedroogde gelmonsters, normen en methodeleegstanden (die zijn samengevoegd met de ondersteuning van het polyethersulfonmembraan) over op afzonderlijke stukken dubbelzijdig plakband(tabel met materialen),gelzijde naar boven gericht. Snijd overtollige tapeonderdelen bij om ruimte in de ablatiecel te besparen.
    2. Monteer de gedroogde gels op glasplaten. Gebruik afzonderlijke glasplaten voor elk gelmonster, standaardserie of methode blanco om een flexibele opstelling op de LA-monsterfase mogelijk te maken (typische grootte van 10 cm × 10 cm). Gebruik een glaszetter om de grootte van de glasplaat naar behoefte aan te passen. Bevestig de glasplaten met de gels op de monsterfase van LA (figuur 5B) met behulp van plasticine(materialentabel). Egaler het geloppervlak door de podiumvloer aan te passen en vergrendel de monsterfase in de ablatiecel.
  2. LA-ICP-MS line-scan analyse
    1. Koppel het LA-systeem aan de ICP-MS zoals gespecificeerd in de SI-sectie S5. Stel in de LA-software (Materialentabel) de lichtinstellingen van de camera (d.w.z. 'Ring', 'Coax' en 'Transmitted') in om het geloppervlak in de ablatiecel te verlichten en scherp te stellen op het geloppervlak door de z-asafstand aan te passen. Ga naar willekeurige locaties in de cel om ervoor te zorgen dat alle geloppervlakken scherp zijn.
    2. Stel de LA-parameters in het venster'Laser setup'van de LA-software in. Typische instellingen die worden gebruikt in LA-ICP-MS line-scan analyse van DGT gels zijn: modus continu; energie-output 20-30%; herhalingsfrequentie 10-20 Hz; spotdiameter 100-200 μm; scansnelheid 150-250 μm s-1.
      OPMERKING: De parameters moeten worden geoptimaliseerd voor het type gel dat wordt gebruikt en kunnen variëren. Parameters kunnen ook worden verbeterd voor het verhogen van de signaal-ruisverhouding, ruimtelijke resolutie of het verkorten van acquisitietijden, afhankelijk van de experimentele en instrumentale opstelling. Gebruik een relatief lage energie-output (≤40 %) en herhalingsfrequentie (≤25 Hz) om te voorkomen dat door de gels in de steunmaterialen wordt doordringen39. Zorg ervoor dat de laserscansnelheid wordt ≤ de spotdiameter gedeeld door de totale duur van de ICP-MS-scancyclus (zie 4.2.6) om compressie van de gegevenspunten en dus een verlies van resolutie in scanrichting45te voorkomen. Bij het instellen van een spotdiameter van 200 μm en een totale ICP-MS-scancyclusduur van 0,25 s moet de scansnelheid bijvoorbeeld worden ≤800 μm s-1.
    3. Selecteer het lijngereedschap en teken een enkel, ~1 mm lang lijnpatroon over een gelstandaard. Klik met de rechtermuisknop op het lijnpatroon in het venster 'Scanpatronen' en controleer of de LA-parameters zijn ingesteld in 4.2.3. zijn aangenomen. Gebruik het gereedschap 'Dubbele scans' om deze lijn vier keer te dupliceren, met een interline-afstand (afstand tussen het midden van de lijn) groter dan de steundiameter (figuur 6). Deze aanpak biedt in totaal vijf parallelle lijnen per gelstandaard (n = 5). Herhaal deze stap voor elke gelstandaard, kalibratie leeg en methode leeg.
    4. Ga naar het gelmonster en teken een enkele lijn langs de bovenrand van het te analyseren rechthoekige gebied. Dupliceer de lijn om parallelle lijnen te maken voor het hele monstergebied zoals gespecificeerd in 4.2.3. Gebruik een interline afstand van 300-400 μm. Zorg ervoor dat de scherpstelling (z-asafstand) correct is ingesteld voor elk begin- en eindpunt van elke lijn.
      OPMERKING: De ruimtelijke resolutie van de analyse is hoger langs de scanrichting in vergelijking met de interline afstand. Daarom kunnen begin- en eindpunten van de lijnen het beste de richting van de analytengradiënten volgen. Voor rhizosfeergradiënten staat dit meestal loodrecht op de wortelas (figuur 6).
    5. Stel in de ICP-MS-software (Materialentabel) een time-resolved 'Data Only'-methode in het scherm 'Methode' in, selecteer een of meer geschikte isotopen voor elke analyt en neem 13C op als interne normalisatienorm31,36,40,41,42. Controleer of de detectie van de isotopen niet wordt aangetast door storingen46.
    6. Stel de totale scancyclusduur van de ICP-MS-methode ('Est. Leestijd') in op ≤0,5 s met de juiste verblijftijden per isotoop (meestal tussen 10-50 ms). Stel de waarde'Metingen'van ICP-MS ' in op 1 en wijzig de waarde 'Metingen/Repliceren' om de totale meettijd per monster ('Est.Sampling Time'),d.w.z. per afzonderlijke ablatielijn, in te stellen. Dit is afhankelijk van de specifieke LA-parameters en lijnafstanden die zijn ingesteld in 4.2.2 - 4.2.4.
    7. Gebruik voor gegevensrapportage een modus voor het verzamelen van intensiteit versus tijdgegevens en stel de optie 'Bestandsschrijven' in op 'Nieuw per voorbeeld' om voor elke ablatielijn een individueel gegevensbestand (hier .xl) te maken.
    8. Stel een voorbeeldreeks'Batch'in op het scherm ICP-MS'Sample',waarbij elke monstervermelding overeenkomt met een afzonderlijke ablatielijn die is ingesteld in 4.2.3 - 4.2.4.
    9. Klik op 'Batch analyseren' om de voorbeeldsequentie op de ICP-MS te starten, die wacht met gegevensverwerving totdat deze wordt geactiveerd door de eerste laserpuls (zie SI S5 voor meer informatie over de triggerconfiguratie).
    10. Selecteer in de LA-software alle regels die moeten worden geanalyseerd en controleer of de ICP-MS-methode ('Est. Sampling Time', zie 4.2.6.) overeenkomt met de duur van de afzonderlijke regelablaties, wat meestal anders is voor gelmonsters, standaarden en methode-blanks. Herhaal 4.2.6. indien nodig de ICP-MS-methode aan te passen.
    11. Klik op 'Emissie' in het venster 'Laserenergie' om de laserkop op te laden en klik vervolgens op 'Uitvoeren' om het venster 'Experiment uitvoeren' te openen. Selecteer hier 'Selected Patterns Only', stel de 'Washout Delay' in op 20-30 s, vink het vakje ' Laser inschakelen tijdensscans' aan en stel de 'Laser Warmup Time' in op 10 s.
    12. Klik op 'Uitvoeren' in het venster 'Experiment uitvoeren' om de line-scan analyse te starten en de onbewerkte signaalintensiteit in tellingen per seconde (cps) voor elke isotoop op de ICP-MS in realtime te controleren. Elke lijn moet beginnen ('Laser Warmup Time', 10 s) en eindigen ('Washout Delay', 20-30 s) met een gas blank.
    13. Controleer de laserfluence (J cm-2)tijdens de analyse om de laserstabiliteit te beoordelen. Als de fluence sterk varieert, breekt u de analyse af en controleert u of de laserbron en/of het spiegelsysteem volledig functioneel zijn.
    14. Stop na de analyse het ICP-MS plasma en stel het dragergasdebiet op het LA-systeem in op 0 ml min-1. Verwijder de gels uit de ablatiecel en bewaar ze in ritszakken voor verder gebruik.

figure-protocol-28
Figuur 6: Schematisch van het experimentele ontwerp van DGT LA-ICP-MS (niet op schaal). De illustratie toont de op DGT gebaseerde in situ solute bemonstering in de rhizosfeer en de LA-ICP-MS mapping van de soluteverdeling op het geloppervlak, inclusief een close-up met voorbeeldige lijnscanafmetingen en parameters. Merk op dat de DGT-gel horizontaal wordt omgedraaid wanneer deze van de rhizosfeergrond op de glasplaat wordt overgebracht, zoals aangegeven door de positie van de rechthoek in de onderste hoek van de DGT-gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gegevensverwerking en kalibratie
    1. Importeer het onbewerkte gegevensbestand (.xl) voor elke ablated regel in spreadsheetsoftware (Tabel met materialen). De raw data tabel toont de ICP-MS metingen (datapoints) voor elke isotoop in cps en de bijbehorende tijdspunten in s. Alle regels naast elkaar in verschillende kolommen weergeven.
    2. Evalueer de line-scan gegevens voor signaalstabiliteit van de interne standaard (13C) en adequate washouttijden.
    3. Bereken een gemiddelde gasloze waarde voor elke isotoop van alle gasloze waarden die vóór de lijnablaties zijn geregistreerd (d.w.z. tijdens de laseropwarmingstijd) en trek de gemiddelde gasloze af van de overeenkomstige ruwe intensiteiten voor elke isotoop om te corrigeren voor het achtergrondsignaal.
    4. Pas interne normalisatie toe door de signaalintensiteit van elke isotoop (cps) te delen door de signaalintensiteit van de interne standaard (cps) voor elk datapunt om te corrigeren voor variaties in de hoeveelheid materiële ablated en instrumentale drift.
    5. Snijd gegevens bij voor het begin en na het einde van elke ablated lijn om het achtergrondsignaal te verwijderen. Zet de gegevenstabel om om een rastermatrix te verkrijgen waarbij elke rij overeenkomt met een geableerde lijn en elke kolom met een genormaliseerde isotopenintensiteitswaarde. Scheid de matrices voor elke isotoop in afzonderlijke werkbladen.
    6. Bereken de gemiddelde genormaliseerde signaalintensiteitsverhouding per isotoop voor de kalibratienormen en kalibratie blank en bereken de kalibratiefunctie (y = ax + b) met behulp van een lineair regressiemodel met de gelstandaard analytbelastingen (μg cm-2; zie SI S4) als x-waarden. Evalueer de kalibratiefunctie van elke isotoop op lineariteit47.
    7. Pas de kalibratiefunctie toe op de voorbeeldgegevensmatrix. Converteer de genormaliseerde signaalintensiteitsverhoudingen figure-protocol-29 , naar gelanalytenbelastingen figure-protocol-30 (μg cm-2), en vervolgens naar tijdgemiddelde solute fluxen figure-protocol-31 (pg cm-2 s-1), voor elke isotoop en datapunt volgens Eq. 4 en Eq. 5:
      figure-protocol-32
      figure-protocol-33
      Hier is a de helling van de kalibratielijn, b is het onderscheppen van de kalibratielijn en t (s) de gelimplementatietijd tijdens solutebemonstering.
    8. Sla de gekalibreerde voorbeeldgegevensmatrix voor elke analyt op als txt-bestand.
  2. Beeldgeneratie
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u pixelinterpolatie tijdens alle stappen van het genereren van afbeeldingen vermijdt, omdat dit kan leiden tot kunstmatig gladgestreken solute fluxverloop in de resulterende afbeeldingen.
    1. Importeer de gekalibreerde voorbeeldgegevensmatrix (.txt) als tekstafbeelding in de software voor beeldanalyse (Tabel met materialen).
    2. Bereken de afstand per pixel in x-richting (d.w.z. laterale resolutie) door de laserscansnelheid te vermenigvuldigen met de totale ICP-MS-scancyclusduur (bijv. uitgaande van een scansnelheid van 200 μm s-1 en een totale scancyclusduur van 0,25 s, komt de laterale resolutie overeen met 50 μm). De afstand per pixel in y-richting komt overeen met de interline-afstand (figuur 6).
    3. Bereken de aspect ratio correctiefactor van de afbeelding. Verdeel daarom de afstand per pixel in y-richting (bijv. 300 μm) door de afstand per pixel in x-richting (bijv. 50 μm). Pas de verkregen y/x correctiefactor (in dit voorbeeld 6) toe onder 'Schaal'. Pas de afstand per pixel (in μm of mm) in x-richting toe als schaling onder 'Schaal instellen'.
    4. Pas een 'Look Up Table' toe, d.w.z. pseudo-kleurenschaal voor een betere visualisatie van chemische gradiënten in de solute-afbeelding en pas de 'kleurbalans' van de afbeelding aan om de onder-/bovengrenzen van het weergavebereik te regelen. Voeg een 'Kalibratiebalk' toe en sla de solute-afbeelding op als tiff-bestand.
    5. Kopieer de solute-afbeelding met de opdracht 'Kopiëren naar systeem' in de software voor beeldanalyse en plak deze in desktoppublicatiesoftware(tabel met materialen). Schaal-match, lijn en stel de solute afbeelding samen met de foto van de ROI verkregen in 3.1.7.
      OPMERKING: Voordat u de solute-afbeelding kopieert, moet u het formaat van de solute-afbeelding wijzigen door bijvoorbeeld factor 10 toe te passen door een 'X-schaal' van 10 en een 'Y-schaal' van 10 onder 'Schaal instellen' toe te passen om voldoende pixels te garanderen voor publicatie met hoge resolutie.
DGT gel fabricagePlantenteeltIn situ solute bemonsteringLA-ICP-MS solute flux mapping
HR-MBG
1 week 		Bodemvoorbereiding
1 week 		Gel aanbrengen
1 uur per gel 		Monstervoorbereiding
1 uur per gel
HR-ABG
3 dagen 		Rhizotron montage
2 uur per repliceren 		Solute bemonsteringsperiode
variabel, meestal 24 uur 		LA-ICP-MS analyse
1 dag per gel
HR-CBG
3 dagen 		Plantengroei
afhankelijk van studie 		Het ophalen van de gel
1 uur per gel 		Gegevensverwerking
4 uur per gel
Het drogen van de gel
2-3 dagen 		Beeldgeneratie
10 min per afbeelding

Tabel 1: Geschatte tijden voor algemene stappen van de DGT LA-ICP-MS-techniek.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het vermogen en de gegevensdetails van de DGT-beeldvormingsmethode aan te tonen, hebben we de sub-mm, 2D-fluxverdeling van meerdere labiele voedings- en verontreinigingsolute-soorten in de bodem naast wortels van Fagopyrum esculentum en Salix smithiana samengesteld (figuur 7). Geschatte tijden voor algemene procedurele stappen van het protocol worden weergegeven in tabel 1.

Solute-afbeeldingen in figuur 7 werden gegenereerd in drie verschillende studies met behulp van HR-MBG- of HR-CBG-bindingsgels. De chemische beelden tonen de 2D solute fluxverdeling bij een ruimtelijke resolutie van 82-120 μm langs de x-as en 300-400 μm langs de y-as, afhankelijk van de gebruikte LA-ICP-MS parameters. Omdat er geen interpolatie is toegepast tijdens het kalibreren en wijzigen van het formaat van afbeeldingen, vertegenwoordigen enkele pixels gemeten gegevenspunten. Uitlijning van de solutebeelden met een fotografisch beeld van de ROI laat zien dat de sub-mm, 2D solute fluxverdeling van verschillende elementen zeer variabel is afhankelijk van bodemstructuur en wortelmorfologie. Dit kan worden toegeschreven aan het differentiële biogeochemische gedrag van de elementen in het bodem-rhizosfeer-plantensysteem, en hun interactie met de bodemmatrix en de plantenwortels.

In figuur 7A werden labiele anorganische mg-, al-, p-, mn- en fesolute-fluxen gevisualiseerd rond een jonge F. esculentumwortel gekweekt in carbonaatvrije grond bemest met NH4NO3. De sub-mm solute verdeling toonde zones van verminderde Al, P en Fe fluxen naast oudere wortelsecties als gevolg van wortelopname, en sterk verhoogde Mg, Al, P, Mn en Fe fluxen aan de wortel top als gevolg van gelokaliseerde P mobilisatie processen van de F. esculentum wortel. Merk op dat de wortelpunt zich enigszins achter het bodemoppervlak bevindt en daarom nauwelijks zichtbaar is in het fotografische beeld. Figuur 7B toont de verdeling van labiele sporenmetalen, waaronder Mn, Fe, Zn, Cd en Pb rond een wortel van metaaltolerante S. smithiana gekweekt in een met Zn, Cd en Pb matig verontreinigde bodem. De solute beelden visualiseerden duidelijke uitputting in het bijzonder van Zn, Cd en Pb bij de onmiddellijke wortelpositie, die aantonen dat de wortels van S. smithiana als gelokaliseerde gootsteen voor labiele spoormetalen in verontreinigde grond werken. Bovendien kunnen gelokaliseerde Zn-, Cd- en Pb-fluxverhogingen worden waargenomen, wat wijst op accumulatie van deze sporenmetalen op de directe bodemwortelinterface.

Naast multi-elementaire solute beeldvorming kan de gepresenteerde methode ook worden gecombineerd met complementaire diffusiegebaseerde beeldvormingstechnieken zoals planaire optodes34. Dit wordt aangetoond in figuur 7C, waar de distributie van labiele sporenmetalen in de rhizosfeer van S. smithiana werd gecoöpaliseerd met de verdeling van de pH met behulp van een gecombineerde, eenlaagse planaire optode-DGT kationbindingsgel33. Het bodemsubstraat werd bemest met (NH4)2SO4, wat leidde tot een pH-afname langs de wortelassen met ~ 1 eenheid in vergelijking met bulkgrond. De pH-verlagingen werden gecolokaliseerd met verhoogde solute fluxen van Mn, Fe, Co, Ni, Cu en Pb, wat wijst op pH-geïnduceerde metaaloplosbaarheid.

Bovendien tonen deze voorbeeldresultaten enkele van de mogelijke beeldvormingsartefacten die kunnen worden verkregen. Structurele bodeminhomogeniteiten, bijvoorbeeld waargenomen als een horizontale lijn in het onderste derde deel van het ROI-beeld van figuur 7A,kunnen bijvoorbeeld leiden tot stopzetting van het contact tussen bodem en gel, wat resulteert in beperkte diffusie op deze locatie in de bindgel. Omgekeerd kan overmatige bodemverdichting in het rhizotron leiden tot een slechte porositeit, wat resulteert in een kunstmatige verschuiving van de redoxstatus van de bodem naar anoxia. Dit wordt geïllustreerd in figuur 7B, waar uitgestrekte gebieden van hoog verheven Mn- en Fe-fluxen in de solute-afbeeldingen visueel overeenkomen met een dichte laag grond in het ROI-beeld. Dit suggereert een verminderd redoxpotentieel van de bodem als gevolg van een hoge bodemverdichting, wat resulteert in reductieve ontbinding en oplosbaarheid van de zeer redoxgevoelige elementen. Zorgvuldige rhizotronvulling en visuele inspectie van het bodemoppervlak direct na het vullen wordt daarom aanbevolen.

figure-results-1
Figuur 7: Sub-mm 2D-verdeling van labiele nutriënten- en verontreinigingsolutesoorten over verschillende bodemwortelinterfaces. (A) Distributie van anionische P en kationische Mg, Al, Mn en Fe solutes rond een jonge F. esculentum wortel. Co-gelokaliseerde bemonstering van anionische en kationische solutes werd bereikt met behulp van HR-MBG gedurende 24 uur bij een bodemwaterverzadiging van ~75% WHC. De Al-, P- en Mn-afbeeldingen worden weergegeven als gekalibreerde fDGT-waarden (pg cm-2 s-1),terwijl Mg- en Fe-afbeeldingen 13C-genormaliseerde intensiteiten vertonen. Schaalbalk staat voor 1 cm. Dit cijfer is aangepast aan ref.48. (B) Distributie van Mn, Fe, Zn, Cd en Pb rond een S. smithiana wortel gekweekt in grond matig verontreinigd met Zn, Cd en Pb. Kationische sporenmetaalsolutes werden bemonsterd met BEHULP van HR-CBG gedurende 20 uur bij een bodemwaterverzadiging van ~80 % WHC. Alle afbeeldingen worden weergegeven als gekalibreerde fDGT-waarden (pg cm-2 s-1). Schaalbalk staat voor 0,5 cm. Dit cijfer is aangepast aan ref.3. (C) Distributie van pH en meerdere kationische solutes rond S. smithiana wortels gekweekt in grond verrijkt met Cd. Co-lokalisatie van pH en solute dynamiek werd bereikt met behulp van een wijziging van het HR-MBG protocol, waardoor gelijktijdige solute sampling en planaire optode imaging33. De Mn-, Cu-, Zn- en Cd-beelden worden weergegeven als gekalibreerde fDGT-waarden (pg cm-2 s-1),terwijl Fe-, Co-, Ni- en Pb-afbeeldingen 13C-genormaliseerde intensiteiten vertonen. Schaalbalk staat voor 1 cm. Dit cijfer is aangepast aan ref.33. De gepresenteerde cijfers zijn overgenomen uit de aangehaalde artikelen3,33,48 met een vergunning onder CC BY. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde solute imaging protocol is een veelzijdige methode om 2D nutriënten- en verontreinigingsfluxen in bodem-plant omgevingen te visualiseren en te kwantificeren. Het is uniek in zijn vermogen om multi-element beelden van labiele solute soorten op sub mm schaal te genereren op de bodemwortelinterface, die de haalbare ruimtelijke resolutie van alternatieve methoden voor het meten van solutegradiënten in de rhizosfeer aanzienlijkoverschrijden 4. De gerichte in situ bemonsteringsbenadering van DGT, in combinatie met een zeer gevoelige chemische analysemethode zoals LA-ICP-MS, vergemakkelijkt het gedetailleerde onderzoek naar solute fluxdynamiek rond individuele plantenwortels die in grond of soortgelijke substraten worden gekweekt. Vanwege het op gootsteen gebaseerde bemonsteringsproces weerspiegelen de verkregen beelden de labiliteit van de gevisualiseerde solutes en zijn daarom een schatting van hun plantbeschikbaarheid10. Hoewel de methode-inherente meting van solute fluxen aanzienlijke voordelen heeft, zoals de interpreteerbaarheid als plant-beschikbare nutriëntenfracties, zijn fluxmetingen veel minder eenvoudig te begrijpen dan poriewaterconcentratiemetingen. De standaard DGT-bemonsteringsgeometrie in bulkgrondtoepassingen (met name de 0,8 mm dikke diffusiegels die in die opstelling worden gebruikt) maakt het mogelijk om de werkelijke poriewaterconcentratie, csoln, en een tijdgemiddelde poriewaterconcentratieschatting te vergelijken met een bulk-DGT-meting, cDGT, en voor de interpretatie van deze parameters met betrekking tot de bevoorradingsdynamiek van een solutesoort. Een dergelijke vergelijking kan echter niet worden uitgevoerd op basis van imaging DGT-toepassing met zeer dunne diffusielagen, omdat de afgeleide cDGT-waarden onrealistisch klein zijn34. DGT-beeldvormingsresultaten zijn daarom niet altijd eenvoudig en snel te interpreteren en zijn vaak niet direct vergelijkbaar met meer conventionele poriewaterconcentratiemetingen.

Bij het toepassen van de methode moeten een paar kritieke stappen zorgvuldig worden overwogen, voornamelijk met betrekking tot het vullen en bewateren van de rhizotron-groeicontainers. Bij het vullen van de grond in de rhizotron is het erg belangrijk om te voorkomen dat de grond te veel wordt verdicht, omdat de plantenwortels niet sterk verdichte grond kunnen doordringen en de wortelgroei wordt geremd. We hebben waargenomen dat wortels sterk verdichte grond vermijden en langs de binnenranden van de rhizotron-groeicontainer groeien, waar de grond meestal minder compact is. In dit geval kunnen individuele wortels in het midden van de rhizotrons, waar DGT-gels gemakkelijk kunnen worden aangebracht, zich helemaal niet ontwikkelen, waardoor succesvolle geltoepassing effectief wordt geremd. In ons laboratorium toonde de ervaring aan dat droge bodem bulkdichtheden van 1,0-1,4 g cm-3 ongehinderde wortelontwikkeling mogelijk maken. Bovendien is overmatige bodemverdichting ook een potentiële bron van artefacten met betrekking tot de oplosbaarheid van redoxgevoelige elementen en biogeochemisch geassocieerde soorten. Naarmate het totale porievolume wordt verminderd en de poriediameterverdeling wordt verschoven naar lagere diameters in sterk verdichte grond, is er minder met lucht gevuld porievolume met grotere diameter beschikbaar, wat lokaal kan leiden tot reductieve omstandigheden. Bijgevolg kunnen MnIII/IV- en FeIII-oxiden worden verminderd, wat leidt tot verhoogde Mn2+ en Fe2+ fluxen. De ontbinding van Fe-oxiden, die belangrijke sorptieplaatsen zijn, bijvoorbeeld voor fosfaat en micronutriënten, kan gesorbeerde en/of geco-neergeslagen soorten vrijmaken en daardoor kunstmatig verhoogde fluxen van de biogeochemisch geassocieerde soort veroorzaken. Een soortgelijk probleem kan zich voordoen als de groeicontainers te veel worden bewaterd. Verdamping via het kleine bodemoppervlak aan de bovenkant van de groeicontainer is laag en de grond kan tot enkele weken na het planten waterverzadigd blijven, wat ook redox-artefacten kan veroorzaken.

Een andere belangrijke overweging is de chemische functionaliteit van de gefabriceerde HR-DGT bindingsgel. Door het protocol te volgen, worden dunne gels met een homogene verdeling van bindingsfasen verkregen. Als de gels gebieden van inhomogene materiaalverdeling hebben (bijv. gaten in de gel of aggregaten van bindingsfasen), moeten deze gebieden worden verwijderd of, indien te uitgebreid, moet het protocol voor gelfabricage worden herhaald. Indien correct bereid, moet de gel in staat zijn om de doelsolute-soorten die in de gel diffunderen onmiddellijk en kwantitatief te binden27, wat wordt bepaald door de analytspecifieke gelbindingscapaciteit. Hoewel het overschrijden van de gelcapaciteit minder problematisch is in niet-verontreinigde bodems, moet het worden overwogen in met metaal verontreinigde bodems en zoute bodemomgevingen. Verzadiging van de gelbindingsfasen zal niet alleen de kwantitatieve solutebemonstering aantasten, maar ook leiden tot zijdelingse diffusie van soluten tussen bindingsfasen in de gel, wat leidt tot een onbepaalde lokalisatie van kleinschalige solute fluxfuncties. Als er dus zeer grote hoeveelheden labiele voedings-/verontreinigingssoorten worden verwacht in de doelbodemomgeving, moeten voorbereidende tests worden uitgevoerd. Voor de raming van de verwachte DGT-belastingen kan de bemonstering van de DGT-zuiger in bulk, gevolgd door gel-elutie en natchemischeanalyse,worden toegepast15,49. Indien nodig kunnen de implementatietijden van DGT worden aangepast om de contacttijd van de gel te verkorten en zo gelverzadiging boven capaciteitsdrempels te voorkomen. Omgekeerd kunnen voorbereidende tests ook nuttig zijn om de vereiste gelcontacttijden en/of LA-ICP-MS-gevoeligheden te identificeren als er zeer lage solutebelastingen worden verwacht, wat belangrijk kan zijn voor het in kaart brengen van sporenelementen op natuurlijke bodemachtergrondniveaus15. Bovendien moet de correcte werking van de DGT-gel vóór de experimentele toepassing ervan worden geverifieerd door gecontroleerde belasting van gels bij de bereiding van DGT LA-ICP-MS-kalibratienormen. De gelstandaard biedt een matrixgematchte referentiegelanalytenbelasting die kan worden gebruikt om te beoordelen of de monstergelbelasting bepaald door LA-ICP-MS binnen het verwachte bereik ligt. Indien de exploitant niet in staat is een signaal te verkrijgen dat verschilt van het gas- en methodeloze achtergrondgeluid, moet hij ervoor zorgen dat laboratoriumprocedures voor de analyse van sporenelementen zijn uitgevoerd en dat alle protocolstappen correct zijn uitgevoerd. Soms wordt de DGT-gel per ongeluk omgedraaid na solute-bemonstering met de bodem-blootgestelde, geladen kant gericht op de glasplaat in plaats van de laserstraal, wat resulteert in lage signaalintensiteiten en ten onrechte omgedraaide kenmerken in de uiteindelijke solute fluxbeelden.

Tijdens de LA-ICP-MS-analyse wordt een grote hoeveelheid gegevens gegenereerd, wat veel tijd kost om te evalueren. In ons lab gebruiken we interne gegevensevaluatiescripts die zijn afgestemd op ons doelgegevensuitvoerformaat met behulp van standaard spreadsheetsoftware. Na semi-geautomatiseerde sortering en kalibratie wordt het plotten van afbeeldingen uitgevoerd met behulp van open source, open access beeldanalysetools (ImageJ, Fiji50). Deze aanpak biedt volledige controle over gegevenssortering, evaluatie en presentatie, wat essentieel is omdat de verzamelde gegevens overeenkomen met rechthoekige en niet kwadratische pixels, die correct moeten worden weergegeven in de gegenereerde solute-kaarten. Bovendien moet tijdens de gegevensverwerking elke pixelinterpolatie zorgvuldig worden vermeden. Pixelinterpolatie leidt tot vloeiende gradiënten in de chemische afbeeldingen, wat resulteert in verzachtte, vaak cirkelvormige elementverdelingskenmerken en is daarom een ongewenste wijziging van de oorspronkelijke gegevens. Pixelinterpolatie is een standaardprocedure bij het opnieuw schalen en opnieuw formatteren van bewerkingen in veel softwareproducten voor beeldverwerking, maar kan meestal worden gedeselecteerd.

Concluderend is de beschreven methode een belangrijke vooruitgang voor het begrijpen van de voedings- en verontreinigingsdynamiek in natuurlijke bodem-rhizosfeer-plantsystemen. Naast DGT-only toepassingen kan de methode worden gecombineerd met andere, op diffusie gebaseerde beeldvormingstechnieken zoals planaire optodes3,33,42,43,48,51 en zymografie20,21,22,23,24, en kan verder worden ontwikkeld voor het opnemen van extra elementen en bodemparameters.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd medegefinancierd door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) en het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF) en de Deelstaat Neder-Oostenrijk: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS)VWR21300.260≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM8250-100G≥99.5%
Acrylamide solutionSigma-AldrichA4058-100ML40%, for electrophoresis
Analyte saltsn/an/aUse water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnelVWR511-006513 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling softwareKTH Swedenn/aVisual MINTEQ
ClampLocal warehousen/a
Desktop publishing softwareAdobe Inc.n/aInDesign CS6
DGT cross-linkerDGT Research Ltdn/a2%, agarose derivative
DGT piston samplerDGT Research Ltdn/a2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) cameraCanon Inc.n/aCanon EOS 1000D
Dispersion deviceIKA3737000Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tapeTesa56171
EthanolSigma-Aldrich34923Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paperWhatman10426981Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drierUniEquipn/aUNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave systemAnton Paarn/aMultiwave 3000
HNO3VWR1.00456.2500P65%, ISO for analysis
Horizontal shakerGFL305
HydroMed D4AdvanSource Biomaterials Corp.n/aEther-based hydrophilic urethane
ICP-MS softwarePerkin Elmern/aSyngistix
Image analysis softwareNational Institutes of Health (NIH)n/aImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating deviceBYK5561Single Bar 6″, 0.5 mils
LA softwareElemental Scientific Lasersn/aActiveView
LA systemElemental Scientific Lasersn/aNWR193
Laminar flow benchTelstar Laboratory Equipment B.V.n/aClass II biological safety cabinet
Magnetic stirrerIKA0003582400C-MAG MS 7
Moisture-retaining filmBemis Company, Inc.PM999Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281-50MLBioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3Sigma-Aldrich229938-10G99.995% trace metals basis
NaOHSigma-Aldrich1064980500Pellets for analysis
Overhead shakerGFL3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vialsSavillex200-015-2015 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meterThermo Scientific13-644-928Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probeThermo Scientific8157BNUMDOrion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutterDGT Research Ltdn/aUse empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezersSemadeni602
PlasticineLocal stationary shopn/anon-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discsWhatman110606Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheetWhatman113506Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discsPall Corporation60172Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheetPall Corporation60179Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foilHaberkornn/a50 µm thickness
PTFE spacerHaberkornn/aVariable thicknesses available
PTFE-coated razor bladesPersonna GEM62-0178Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubingS-prep GmbHSP81800.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MSPerkin ElmerN8150044NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454VWR516-0854Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet softwareMicrosoft Corporationn/aMicrosoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutterLocal locksmitheryn/a2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA)Teledyne CETAC Technologiesn/a10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cablen/an/aConsult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cellElemental Scientific Lasersn/aTwo-volume cell 1
Vinyl electrical tape3Mn/aScotch Super 33+
Water purification systemTermo Electron LED GmbHn/aTKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2OAlfa Aesar86108.3099.9 %, metals basis

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).">Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).">Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).">Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).">Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).">Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).">Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).">Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).">Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).">Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).">Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).">Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).">Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).">Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).">Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).">Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).
  16. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).">Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).">Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).">Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).">Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).">Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).">Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).">Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).">Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).">Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).
  25. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).">Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).">Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).">Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).">Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).">Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).">Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).">Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).">Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).">Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).">Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).">Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).">Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).">Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).">Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).">Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).">Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).">Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).">Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).">Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).
  44. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).">Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).">Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).">May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).">Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).">Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).">Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).">Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DGT TechniqueLA ICP MS ImagingRhizosphere VisualizationSoil Nutrient MappingGel FabricationRhizotron AssemblyLaser Ablation AnalysisInternal NormalizationMulti Element QuantificationSub millimeter Resolution

Related Articles