Methodenartikel

Detergentvrije decellularisatie van de menselijke alvleesklier voor de productie van oplosbare extracellulaire matrix (ECM)

DOI:

10.3791/61663

⸱

4 september 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, legt de stappen uit voor de fabricage van een oplosbare extracellulaire matrix (ECM) uit de menselijke alvleesklier. Het opgeloste ECM-poeder dat via dit protocol wordt verkregen, kan worden gebruikt voor de recapitulatie van de micro-omgeving van pancreaseilandjes in vitro en, mogelijk, in vivo-instellingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eilandjestransplantatie (ITx) heeft het potentieel om de standaardbehandeling te worden in bètacelvervangende geneeskunde, maar de resultaten blijven inferieur aan die verkregen met transplantatie van de hele alvleesklier. De protocollen die momenteel worden gebruikt voor de isolatie van menselijke eilandjes worden onder de loep genomen omdat ze gebaseerd zijn op de enzymatische vertering van het orgaan, waarbij de alvleesklier wordt gesloopt, de verbindingen met het lichaam verloren gaan en eilandjes onomkeerbaar worden beschadigd. Eilandjesschade wordt gekenmerkt door kritieke factoren zoals de vernietiging van de extracellulaire matrix (ECM), die het 3D-raamwerk van de eilandjesniche vertegenwoordigt en waarvan het verlies onverenigbaar is met de eufysiologie van eilandjes. Onderzoekers stellen het gebruik voor van op ECM gebaseerde steigers die zijn afgeleid van de alvleesklier van zoogdieren om dit probleem aan te pakken en uiteindelijk de levensvatbaarheid, functie en levensduur van eilandjes te verbeteren. De momenteel beschikbare methoden om dergelijke steigers te verkrijgen zijn hard omdat ze grotendeels op wasmiddel zijn gebaseerd. Daarom stellen we een nieuwe, wasmiddelvrije methode voor die minder ECM-schade veroorzaakt en kritieke componenten van pancreas-ECM kan behouden. De resultaten tonen aan dat het nieuw ontwikkelde decellularisatieprotocol het mogelijk maakte om volledige DNA-klaring te bereiken terwijl de ECM-componenten behouden bleven. De verkregen ECM werd getest op cytotoxiciteit en ingekapseld met menselijke pancreaseilandjes die een positief cellulair gedrag vertoonden met insulinesecretie wanneer ze werden gestimuleerd met glucoseprovocatie. Gezamenlijk stellen we een nieuwe methode voor voor de decellularisatie van de menselijke alvleesklier zonder het gebruik van conventionele ionische en niet-ionische chemische detergenten. Dit protocol en de daarmee verkregen ECM kunnen van nut zijn voor zowel in vitro als in vivo toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De isolatie van pancreaseilandjes is een nauwgezet proces dat wordt uitgevoerd door de enzymatische vertering van de verbindingen tussen eilandjes en hun extracellulaire omringende ondersteunende structuur. Deze vernietiging van de extracellulaire matrix (ECM) is een van de kritische factoren bij het karakteriseren van de schade die plaatsvindt tijdens isolatieprocessen 1,2,3,4. Het peri-eilandje ECM is een essentieel acellulair bestanddeel van de endocriene alvleesklier. Het is samengesteld uit eiwitten en polysachariden, die op elkaar inwerken en verknopen om een driedimensionaal net te vormen dat structureel en biochemisch de fysiologische homeostase ondersteunt en helpt bij de recreatie van deze in vitro micro-omgeving 2,5,6. Het verlies van fundamentele signaalprocessen tussen eilandjes en ECM wordt erkend als een van de bijdragende factoren, die de overleving van eilandjes in vitro en in vivo beperken 2,7,8,9,10.

ECM van dieren en mensen zijn op grote schaal gebruikt voor de recapitulatie van de micro-omgeving van de pancreaseilandjes 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Sinds het vermogen van de ECM om de hechting, proliferatie en het behoud van de cultuur op lange termijn van ratteneilandjes te verbeteren voor het eerst werd gerapporteerd in ref.20, hebben veel andere studies sterk bewijs geleverd dat het herstel van inheemse ECM-interactie met menselijke eilandjes de functie van eilandjes verbetert21,22. Recente gegevens hebben bijvoorbeeld aangetoond dat eilandjes ingekapseld met ECM de glykemische controle bij diabetische muizen aanzienlijk verbeterden, waardoor de toediening van insuline in een nieuw celgebaseerd insulinetoedieningsplatform werd verbeterd en vergemakkelijkt23. Bovendien hebben studies aangetoond dat de opname van kritische componenten van pancreas-ECM de endocriene functie van β-cellen aanzienlijk kan verbeteren 24,25,26,27.

De productieprotocollen van ECM die in de literatuur aanwezig zijn, zijn gebaseerd op de toepassing van chemische wasmiddelen, bijv. Triton X-100 of natriumdodecylsulfaat (SDS). Ondanks het feit dat ze een uitstekende DNA-klaring bieden, zijn chemicaliën die worden gebruikt in decellularisatieprocessen cytotoxisch, duur en geven residuen op het gedecellulariseerde weefsel aanleiding tot bezorgdheid met het oog op mogelijke klinische toepassing.

Op basis van deze observaties waren de doelstellingen van deze studie drieledig: ten eerste het ontwikkelen van een decellularisatiemethode voor de menselijke alvleesklier met minimaal gebruik van ionische of niet-ionische chemische wasmiddelen; Ten tweede, het produceren van een oplosbare ECM-steiger voor weefselkweek; Ten derde, het karakteriseren van de ECM van de pancreas om de cytotoxiciteit en de impact op de functie van eilandcellen te beoordelen. De karakterisering is nodig voor alle op celkweek gebaseerde toepassingen, omdat het aantoont dat opgeloste pancreas-ECM nuttig kan zijn bij het recapituleren van de pancreasmicro-omgeving voor geïsoleerde eilandjes. Hierin wordt een effectieve, wasmiddelvrije decellularisatiemethode voor de menselijke alvleesklier, karakterisering van de ECM en het effect van ECM op de levensvatbaarheid en functie van ingekapselde geïsoleerde menselijke pancreaseilandjes beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de menselijke onderzoekscommissie van het Wake Forest Baptist Medical Center. Menselijke alvleesklieren werden ethisch verkregen van orgaandonoren via Carolina Donor Services. Orgaandonoren werden gescreend op infectieziekten die relevant zijn voor de mens, volgens de UNOS-voorschriften. Organen werden ontvangen in een steriele conserveringsoplossing waar ze werden bewaard tot gebruik. Bij levering aan het laboratorium werden alle organen geïnspecteerd en werden monsters van de inheemse alvleesklier verzameld voor histologische doeleinden. De organen werden vervolgens ingevroren en onder steriele omstandigheden bij -20 °C bewaard tot verder gebruik.

1. Chirurgische voorbereiding van de menselijke alvleesklier

OPMERKING: Bevroren alvleesklieren werden 's nachts bij 4 °C ontdooid.

  1. Voordat u begint met chirurgische dissectie van de menselijke alvleesklier, moet u 1 L wasoplossing bereiden, bestaande uit 950 ml gedeïoniseerd water (dH2O), 50 ml reagens op basis van jodium en 1% Pen/Strep-oplossing.
  2. Draag steriele handschoenen en een laboratoriumjas tijdens de chirurgische dissectie. Voer alle operaties uit onder een kap van celcultuurkwaliteit om mogelijke besmetting te voorkomen.
  3. Breng de alvleesklier uit de steriele transportzak over in het steriele placentabassin. Zorg ervoor dat de alvleesklier is georiënteerd met de kop van het orgaan naar links en de staart naar rechts.
  4. Ontleed voorzichtig de twaalfvingerige darm van de kop van de alvleesklier met behulp van een steriele schaar en een tang zonder tanden. Pas op dat u geen gat in de twaalfvingerige darm maakt, dit vergroot de kans op besmetting.
    OPMERKING: Als er een gat in het maagdarmkanaal is gemaakt, klem het gat dan snel vast en ga verder met de dissectie.
  5. Zodra de dissectie van de kop van de alvleesklier is voltooid, gooit u de twaalfvingerige darm weg in een geschikte zak voor biologisch gevaarlijk gebruik en volgt u de institutionele richtlijnen voor de verwijdering ervan.
  6. Ontleed en gooi al het extra-pancreasweefsel rond de kop van de alvleesklier weg, inclusief grote bloedvaten en de gemeenschappelijke galwegen, die meestal op het moment van orgaanverkrijging zijn gemarkeerd met niet-resorbeerbare hechtingen. Gooi het zakdoekje weg volgens de richtlijnen van de instelling.
  7. Ontleed en gooi al het extra-pancreasweefsel en peripancreasvetweefsel rond de staart van de alvleesklier weg, waardoor de miltbloedvaten bloot komen te liggen.
  8. Zodra de vasculaire pedikel van de milt is blootgelegd, verwijdert u de milt en ontleedt u de miltbloedvaten in hun geheel, inclusief die welke zijn bevestigd aan het achterste oppervlak van de alvleesklier (de miltslagader en ader). Gooi de milt weg en verwijder weefsel volgens de richtlijnen van de instelling.
  9. Ontleed en verwijder op de juiste manier al het duidelijk zichtbare extrapancreasvet, vooral peripancreasvet.
    OPMERKING: Ter hoogte van de staart van de alvleesklier kan het retroperitoneum zichtbaar zijn. Deze moet worden opgetild met een niet-getande tang, dienovereenkomstig worden verwijderd met een chirurgische tang en op de juiste manier worden weggegooid. De alvleesklier zou nu vrij moeten zijn van extra-pancreasweefsel.
  10. Ontleed de alvleesklier om 1 cm3 blokjes pancreasweefsel te verkrijgen met behulp van een chirurgische schaar, gesteriliseerde histologische mesjes of chirurgische scalpels. Blokjes pancreasweefsel die na deze dissectie worden verkregen, ondergaan het decellularisatieproces. Het gemiddelde aantal pancreasblokjes dat decellularisatie ondergaat, hangt af van de intrinsieke kenmerken van het orgaan. Gemiddeld ondergingen tussen de 40-60 pancreasblokjes decellularisatie in de gepresenteerde studie.
  11. Ga verder naar stap 2.1

2. Decellularisatie van het pancreasweefsel

OPMERKING: Dit protocol werd gebruikt bij alvleesklier met een gemiddeld gewicht van 100 g; Daarom wordt het niet aanbevolen om dit gewicht te overschrijden bij het gebruik van deze decellularisatietechniek.

  1. Plaats al het pancreasweefsel dat eerder in stap 1.10 is ontleed in een steriele plastic recipiënt (zie materiaaltabel) met de wasoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  2. Verwijder het pancreasweefsel met behulp van een steriele tang en plaats het in een nieuwe steriele container die steriel, endotoxinevrij gedeïoniseerd water bevat. Sluit de dop van de container stevig af en plaats deze op een gekoelde orbitale schudder met een ingestelde temperatuur van 4 °C en een schudsnelheid tussen 180-200 tpm gedurende 24 uur.
  3. Verwijder de container met het pancreasweefsel en maak de buitenkant op de juiste manier schoon voordat u deze in de kap plaatst om het proces voort te zetten.
  4. Verwijder het pancreasweefsel met behulp van een chirurgische tang en plaats het in een nieuwe steriele container, samen met 1 l gedeïoniseerd water, 50 mg DNase I en 0,0025% magnesiumchloride. Sluit de dop van de container stevig af en plaats deze in een orbitale schudder, met een vooraf ingestelde temperatuur van 37 °C en een schudsnelheid van 100 tpm gedurende 6 uur.
  5. Bereid de EDTA-Trizma-oplossing voor
    1. Verzamel een nieuwe steriele container van 1 liter en maak deze op de juiste manier schoon voordat u deze in de afzuigkap plaatst. Om 1 L EDTA-Trizma-oplossing te bereiden, voegt u het volgende toe: 985 ml steriel gedeïoniseerd water, 7,5 ml Tris-HCl Buffer en 7,5 ml EDTA-oplossing. Bewaar het tot gebruik bij 4 °C.
  6. Verwijder de container die het pancreasweefsel omsluit en reinig de buitenkant op de juiste manier voordat u deze in de kap plaatst voor de voortzetting van het proces.
  7. Verwijder het pancreasweefsel met behulp van een chirurgische tang en plaats het in een nieuwe steriele container met 1 L oplossing op basis van EDTA-Trizma. Sluit de dop van de container stevig af en plaats deze in een orbitale schudder, met een vooraf ingestelde temperatuur van 4 °C en een schudsnelheid tussen 180-200 tpm gedurende 18 uur.
  8. Verwijder de container met het pancreasweefsel en maak de buitenkant op de juiste manier schoon voordat u deze in de kap plaatst voor het proces.
  9. Verwijder het pancreasweefsel met behulp van een steriele tang en plaats het in een nieuwe steriele container met steriel endotoxinevrij gedeïoniseerd water. Sluit de dop van de container stevig af en plaats deze op een gekoelde orbitale schudder, met een ingestelde temperatuur van 4 °C en een schudsnelheid tussen 180 en 200 tpm gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Tijdens deze verwerkingsperiode zal er een merkbare kleurverandering zijn, waarbij het weefsel helderder zal lijken.
  10. Verzamel het pancreasweefsel en bewaar het in steriele centrifugatiebuizen van 50 ml, met een maximum van 25 ml per tube om vervolgens in te vriezen en te vriesdrogen. Het aantal centrifugatiebuisjes varieert afhankelijk van de grootte van de alvleesklier. Bewaar monsters bij -80 °C.

3. Productie van ECM-poeder van de pancreas – vriesdrogen en cryomalen

  1. Na minimaal 24-40 uur opslag van het gedecellulariseerde materiaal bij -80 °C, brengt u de pancreas-ECM over in een vriesdroger.
  2. Breng het bevroren materiaal over in een vriesdroger en voorkom dat het materiaal ontdooit.
    OPMERKING: De vriesdroogstap duurt ongeveer 3-5 dagen, afhankelijk van verschillende factoren, zoals de hoeveelheid materiaal in elke buis die het proces ondergaat en het oppervlak dat wordt blootgesteld voor vriesdrogen. Het wordt aanbevolen dat het gedecellulariseerde weefsel het niveau van 25 ml in elke buis niet overschrijdt en dat de buizen in een hoek van 45° worden ingevroren, zodat meer oppervlak gemakkelijk kan worden blootgesteld zodra de vriesdroogbehandeling begint. Verwijder de deksels van de tubes.
  3. Breng de materialen na lyofilisatie over in een kap van celcultuurkwaliteit.
  4. Knip elk stuk van de gedroogde ECM met een steriele schaar in de helft van zijn grootte. Deze gedroogde ECM-stukken worden onderworpen aan een geautomatiseerd maalproces om een ECM-poeder te produceren. Gebruik een cryo-gefreesde automatische processor om een temperatuurstijging en daaropvolgende denaturatie van de biologische eigenschappen van de ECM te voorkomen. Zorg ervoor dat u de instelling van de cryo-freesmachine aanpast om na het maalproces een fijn poeder te verkrijgen.
    OPMERKING: In dit onderzoek werd pancreas gebruikt van donoren met een BMI < 30. Pancreata van donoren met een BMI > 30 vertoonde de neiging om meer intraparenchymaal vet te bevatten. Het proces van vriesdrogen wordt niet als optimaal beschouwd en kan worden geremd door het vetgehalte. Als het weefsel na vriesdrogen zichtbaar olieachtig is, moet het worden weggegooid omdat het niet optimaal is voor de productie van het ECM-poeder.

4. Solubilisatie van de pancreas-ECM

OPMERKING: Op dit punt is de opbrengst van een alvleesklier van gemiddelde grootte (100 g) van het gedecellulariseerde pancreaspoeder 1-2 g.

  1. Weeg 1 g ECM-poeder af met behulp van een steriele plastic spatel.
  2. Bereik oplosbaarheid volgens de eerder beschreven protocollen: Solubiliseren 1 g ECM in 100 ml 0,01 M HCl en 100 mg pepsine gedurende 48 uur bij RT onder constant roeren28.
  3. Gebruik na 48 uur NaOH om de pH (pH = 7) van de zure ECM te neutraliseren, terwijl het bekerglas met de zure ECM op ijs blijft om geleervorming te voorkomen.
    OPMERKING: De geleerkinetiek varieert afhankelijk van de temperatuur, het collageengehalte, de pH en de neutraliserende oplossing. In dit onderzoek werd 0,01 M NaOH gebruikt. Het volume NaOH dat werd toegevoegd voor pH-neutralisatie was ongeveer 100 ml. Overweeg om de pH meerdere keren te meten terwijl u de zure ECM-oplossing neutraliseert.
  4. Breng de neutrale ECM-oplossing over in steriele centrifugebuisjes van 50 ml. Sluit de buisjes en plaats ze in een centrifuge. Centrifugeer de buisjes met de opgeloste ECM gedurende 15 minuten bij 4 °C op maximale snelheid (12.000 x g). Breng de buisjes na het centrifugeren over in een celkweekkap.
    OPMERKING: Na centrifugatie van het monster wordt het onoplosbare bestanddeel van de ECM op de bodem van de buis afgezet, terwijl de opgeloste ECM-oplossing aan de bovenkant in het supernatant wordt aangetroffen.
  5. Verzamel met behulp van steriele technieken het bovenstaande van de buis met de opgeloste ECM-oplossing en breng deze over in verse buisjes van 50 ml, met een maximum van 25 ml per buisje.
  6. Bewaar de ECM-oplossingsbuisjes bij -80 °C.

5. Productie van ECM-poeder van de alvleesklier – vriesdrogen en bewaren

  1. Na ten minste 24-40 uur opslag van de oplosbare ECM-oplossing bij -80 °C, brengt u de buisjes over in een vriesdroger.
  2. Breng het bevroren materiaal over in een vriesdroger en zorg ervoor dat het materiaal niet ontdooit.
    OPMERKING: De vriesdroogstap duurt ongeveer 3-5 dagen, afhankelijk van verschillende factoren, zoals de hoeveelheid materiaal in elke buis die het proces ondergaat en het oppervlak dat wordt blootgesteld voor vriesdrogen. Het wordt aanbevolen dat de opgeloste ECM-oplossing het niveau van 25 ml in elke buis niet overschrijdt en dat de buisjes onder een hoek van 45° worden ingevroren, zodat meer oppervlak gemakkelijk kan worden blootgesteld zodra de vriesdroogisatie begint. Verwijder de deksels van de valkenbuis voordat u vriesdroogt.
  3. Na vriesdrogen van de opgeloste ECM-oplossing wordt het materiaal overgebracht naar een kap van celcultuurkwaliteit. Na volledige vriesdrogen is een fijn ECM-poeder zichtbaar.
    OPMERKING: Het verkregen rendement is 700 mg uit 1 g gedecellulariseerd weefsel.
  4. Bewaar het opgeloste ECM-poeder of gebruik het voor celkweekdoeleinden.
    OPMERKING: Het wordt aangeraden om de ECM te bewaren bij 4 °C voor onmiddellijk gebruik, bij -20 °C voor later gebruik en bij -80 °C voor langdurige opslag.

6. Karakterisering van de pancreas-ECM met histologische kleuring

  1. Verzamel een stuk inheemse alvleesklier kort na de bevalling van het orgaan en vóór de decellularisatie. Fixeer dit gedurende 24 uur in 10% formaline. Was de monsters in gedeïoniseerd water. Dehydrateer het in gesorteerde alcohol voordat u het in paraffine inbedden en snijd het in secties van 5 mm.
  2. Verzamel aan het einde van het decellularisatieproces een monster van het gedecellulariseerde materiaal en fixeer het gedurende 24 uur in 10% formaline. Was het monster in gedeïoniseerd water. Dehydrateer het in gesorteerde alcohol voordat u het in paraffine inbedden en snijd het in secties van 5 mm.
  3. Om een succesvolle decellularisatie te verifiëren, voert u H&E- en DAPI-kleuring uit op zowel de inheemse alvleesklier als de gedecellulariseerde tegenhanger.
  4. Voor histologische karakterisering voert u Masson's Trichrome (MT) en Alcian Blue (AB) kleuringen uit, die respectievelijk de collagene en GAG-structuren zullen benadrukken.

7. Karakterisering van het oplosbare ECM-poeder

  1. Voer DNA-inhoud en totale collageenanalyse uit van het natuurlijke pancreasweefsel en het oplosbare ECM-poeder zoals eerder beschreven29.
  2. Kwantificeer gesulfateerde glycosaminoglycanen (sGAG) op basis van het protocol dat wordt geleverd door een in de handel verkrijgbare kit (zie Materiaaltabel). Gebruik een microplaatspectrofotometer om het gesulfateerde sGAG-gehalte in de ECM van de pancreas te meten bij een golflengte van 595 nm30.
    OPMERKING: Rapporteer het DNA-gehalte als ng/mg droog weefsel en het collageen- en GAG-gehalte als μg/mg droog weefsel.

8. Inkapseling van menselijke eilandjes met de ECM en cultuur

OPMERKING: Menselijke pancreaseilandjes werden commercieel verkregen (zie materiaaltabel).

  1. Bij aankomst worden de menselijke pancreaseilandjes gedurende 24 uur onder standaardomstandigheden gekweekt in met niet-weefselkweek behandelde platen met een dichtheid van ongeveer 2.000 IEQ in elke plaat van 10 cm.
  2. Manipuleer de menselijke eilandjes om het effect van de ECM op de functionaliteit en levensvatbaarheid van de eilandjes te testen met de volgende experimentele groepen: vrije eilandjes, eilandjes ingekapseld in alginaat en eilandjes ingekapseld in alginaat-ECM.
    OPMERKING: De bovengenoemde groepen eilandjes werden gedurende maximaal 8 dagen in vitro gekweekt onder standaardomstandigheden om het effect van de ECM op de functionaliteit en levensvatbaarheid van eilandjes te beoordelen.
  3. Weeg alginaat af op een weegschaal en suspendeer het met HBSS in een centrifugatiebuis om een verhouding van 1,5% (w/v) te verkrijgen. Plaats de centrifugebuis een nacht op een rotator bij 4 °C.
    OPMERKING: Een molecuulgewicht tussen 75-200 kDA en een G/M-verhouding van ≤ 1 werd door de fabrikant gerapporteerd voor het alginaat.
  4. Weeg 0,1 mg ECM af en suspendeer dit in 1 ml van het eerder bereide alginaat om een ECM-concentratie van 0,1 mg/ml te krijgen.
  5. Capsuleer menselijke pancreaseilandjes in alginaat en alginaat-ECM volgens een eerder beschreven protocol31. De procedure wordt hieronder in het kort beschreven.
    1. Verzamel en meng voorzichtig 3.000 IEQ in 1 ml alginaat en 3.000 IEQ in 1 ml alginaat-ECM in een ECM-concentratie van 0,1 mg/ml die eerder in stap 8.4 is bereid.
    2. Pomp de verkregen suspensies door een microfluïdisch inkapselingsapparaat dat is ingesteld op respectievelijk 0,2 ml/min en een debiet en luchtdruk van 2,0 Pa.
    3. Verzamel bij productie de microcapsules in 100 mM CaCl2 bad met 10 mM HEPES. Laat het alginaat 10 minuten verknopen.
    4. Was de ingekapselde eilandjes voordat ze worden gekweekt met HBSS onder standaardomstandigheden, gedurende 2-3 minuten bij 37 °C, met 5% CO2.
    5. Voeg de kweekmedia toe (zie Tabel met materialen) en vervang tweederde van de media om de dag tot het einde van het experiment.
      OPMERKING: De bovenstaande stappen moeten zowel voor de eilandjes in alginaat als voor eilandjes in alginaat-ECM worden uitgevoerd.
  6. Voer op dag 8, na de inkapseling, glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) en DNA-analyse uit om respectievelijk de productie van insuline en de levensvatbaarheid van eilandjes te beoordelen.
  7. Verkrijg helderveldbeelden en levende/dode kleuring van vrije en ingekapselde eilandjes om de cellulaire morfologie en levensvatbaarheid te beoordelen.
    OPMERKING: Er is een kwalitatieve beoordeling van de afbeeldingen uitgevoerd om de gezondheid van de eilandjes te beoordelen. Parameters waarmee rekening wordt gehouden, zijn onder meer de vorm, grens, integriteit en diameter van de eilandjes, evenals de aanwezigheid van afzonderlijke cellen in de cultuur.

9. Glucose-gestimuleerde insulineafgifte (GSIS) en DNA-meting

OPMERKING: Op dag 8, na de inkapseling, werden menselijke pancreaseilandjes verzameld en geïncubeerd met de buffer van Kreb, met lage (2,8 mM) en hoge (16,8 mM) glucoseconcentraties, gevolgd door KCl-depolarisatieoplossing (25 mM). De glucoseprovocatie werd uitgevoerd met aanpassing van een eerder beschreven protocol32.

  1. Plaats gelfiltratiehars in polypropyleen kolommen.
  2. Plaats behandelingsgroepen (vrije eilandjes of ingekapselde eilandjes) in het middelste gedeelte van de gelfiltratiehars in de polypropyleen kolommen.
  3. Pipetteer glucose en depolariserende oplossingen in de hierboven beschreven polypropyleen kolommen en incubeer gedurende 1 uur, in de volgende volgorde: voer een pre-incubatieperiode uit met glucoseoplossing met lage molariteit en ga vervolgens verder met een reeks incubaties met lage, hoge, lage en depolariserende glucoseoplossing zoals vermeld in de opmerking aan het begin van sectie 9.
  4. Verzamel het medium van elke incubatiefase en bewaar het bij -80 °C voor latere analyse.
  5. Na incubatie en verzameling van de depolariserende oplossing, incubeer menselijke pancreaseilandjes met 1 ml DNA-extractiebuffer en bewaar deze tot verdere analyse.
  6. Meet het insulinegehalte van de incubaties van glucose en depolariserende oplossing met een insuline-ELISA-test, volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Meet het DNA-gehalte van de extractiebuffer die in stap 9.5 is verzameld met behulp van een DNA-testkit volgens het protocol van de fabrikant.
  8. Normaliseer de insulinemetingen op basis van het DNA-gehalte.

10. Statistische analyse

OPMERKING: Groepsvergelijkingen verwijzen naar dezelfde partij menselijke eilandjes met n = 3 onafhankelijke beoordeling uitgevoerd voor elke test die in dit manuscript wordt beschreven. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD.

  1. Gebruik statistische software om de Mann-Whitney-test uit te voeren voor de beoordeling van decellularisatie en DNA-restantenanalyses, vergelijk de native, de gedecellulariseerde alvleesklier en de opgeloste ECM.
  2. Voer een ongepaarde t-test uit voor de beoordeling van de glycosaminoglycanen en collageen tussen de inheemse, de gedecellulariseerde alvleesklier en de opgeloste ECM.
  3. Voer een 2-weg ANOVA uit met post-hoc meerdere vergelijkingen van Turkije voor de glucosestimulatietest bij de beoordeling van de stimulatie van de eilandjes op dag 8.
  4. Beschouw statistische significantie op p < 0,05 met aanduiding van *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inheemse en acellulaire pancreasmonsters werden verwerkt voor histologische kleuring met H&E, MT en AB. De H&E-kleuring toonde volledige afwezigheid van nucleair materiaal en cellen, wat een succesvolle decellularisatie bevestigt. MT- en AB-kleuringen toonden het raamwerk van de ECM, waarbij respectievelijk kwalitatief collagene en stromale componenten werden benadrukt (Figuur 1).

Deze methode maakte het mogelijk om consistent een...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit werk was om een zachter, wasmiddelvrij decellularisatieprotocol te ontwikkelen om pancreas-ECM te produceren. Er werd aandacht besteed aan het behoud van ECM-componenten van het pancreaskarenchym en het vermijden van langdurige weefselblootstelling aan conventionele ionische of niet-ionische chemische detergenten tijdens het decellularisatieproces.

Het meest innovatieve aspect van de ontwikkelde decellularisatiemethode is het vermijden van kla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen concurrerende financiële belangen te verklaren door een van de coauteurs.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020 Research and Innovation Program van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 646272. Menselijke pancreaseilandjes werden verkregen van Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Corning 1L Easy Grip Polystyrene Opslagflessen met 45mm DoppenThermoFisher430518Containergebruik voor decellularisatie
Cryogenic MillSPEX Certiprep6870-230
Deoxyribonuclease I uit bovien pancreasSigma AldrichDN25
Gedistilleerde WaterThermoFisher15230147
Falcon 50mL Kegelvormige CentrifugeerbuizenCorning352070
Menselijke Pancreasnana
Insulin-ElisaMercodia10-1113-01
Magnesium Chloride, 1M, SterileBio-World41320004-1
Pepsine uit porcine gastrische mucosaSigma AldrichP7012-5G
Placenta Bekken z/o Deksel, SterileDeRoyal32-881
Polypre chromatografiebuizenBio-rad731-1500Polypropyleen kolommen
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInvitrogenP7589DNA Kit
SamplePrep Large-Capacity Freezer/Mill AccessoireSPEX6801Grote Malende Flacon Set
Sephadex G-10 kralenCytiva17001001Gel Filtratie Hars
Chirurgisch kitnana
UltraPur 0.5M EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5ThermoFisher15567027
UltraPure DNase/RNase-Vrij Gedistilleerd WaterThermoFisher10977023

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

Trefwoorden

Decellularisatie van de pancreasdetergentvrije methodeeilandjestransplantatieisolatie van eilandjesECM scaffoldDNA klaringpancreaseilandjesinsulinesecretievervanging van b tacellen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen