Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61672

⸱

1 mei 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.

Samenvatting

Het oculaire oppervlak werd ooit beschouwd als immuun bevoorrecht en abiotisch, maar onlangs lijkt het erop dat er een kleine, maar aanhoudende commensale aanwezigheid is. De identificatie en monitoring van bacteriële soorten in het oogslijmvlies waren een uitdaging vanwege hun geringe overvloed en beperkte beschikbaarheid van geschikte methodologie voor commensale groei en identificatie. Er zijn twee standaardbenaderingen: op cultuur gebaseerde of DNA-sequencingmethoden. De eerste methode is problematisch vanwege de beperkte herwinbare bacteriën en de tweede benadering identificeert zowel levende als dode bacteriën die leiden tot een afwijkende weergave van de oculaire ruimte. We ontwikkelden een robuuste en gevoelige methode voor bacteriële isolatie door voort te bouwen op standaard microbiologische kweektechnieken. Dit is een op uitstrijkjes gebaseerde techniek, met behulp van een "in-lab" gemaakt dun wattenstaafje dat zich richt op het onderste bindvlies, gevolgd door een versterkingsstap voor aerobe en facultatieve anaerobe geslachten. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om conjunctivale soorten zoals Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., enz. te isoleren en te identificeren. De aanpak is geschikt om commensale diversiteit bij muizen onder verschillende ziekteomstandigheden te definiëren.

Inleiding

Het doel van dit protocol is om de specifieke isolatie van levensvatbare en zeldzame aerobe en facultatieve anaerobe microben uit het oculaire bindvlies te verbeteren om het oculaire microbioom te karakteriseren. Uitgebreide studies hebben commensale mucosale gemeenschappen geprofileerd op de huid, darmen, luchtwegen en geslachtsorganen en tonen aan dat deze gemeenschappen de ontwikkeling van het immuunsysteem en de respons1,2,3beïnvloeden . Van oculaire commensale gemeenschappen is aangetoond dat ze veranderen tijdens bepaalde ziektepathologieën, zoals droge ogenziekte4,syndroom van Sjogren5 en diabetes6. Toch wordt het vermogen om een typische oculaire oppervlaktecommensale gemeenschap te definiëren belemmerd door hun relatief lage overvloed in vergelijking met de andere mucosale sites6,7,8. Dit leidt tot een controverse over de vraag of er een ingezeten oculaire microbioom is en of het bestaat, of het verschilt van het huidmicrobioom en bijgevolg het lokale effect ervan op de ontwikkeling en reactie van het aangeboren immuunsysteem. Dit protocol kan helpen deze vraag op te lossen.

Over het algemeen zijn benaderingen om de oculaire commensale niche te definiëren gebaseerd op sequencing en op cultuur gebaseerde technieken4,7,9. S rDNA-sequencing en BRISK-analyse7 vertonen een bredere diversiteit dan op cultuur gebaseerde technieken, maar kunnen geen onderscheid maken tussen levende en dode microben. Omdat het oculaire oppervlak vijandig is voor veel microben als gevolg van de antimicrobiële eigenschappen van traanfilm4 die een grote reeks DNA-fragmenten genereren, zullen DNA-gebaseerde benaderingen deze artefacten detecteren die de gegevens kunnen scheeftrekken in de richting van identificatie van dode bacteriën als ingezeten commensalen in plaats van verontreinigingen. Dit resulteert in afwijkende commensale identificatie en karakterisering van de oculaire ruimte als hoger in microbenrijkdom en diversiteit10. Dit maakt het moeilijk om het ingezeten oculaire microbioom te definiëren via DNA-gebaseerde methoden. Overwegende dat standaard kweekgebaseerde technieken geen commensalen kunnen detecteren omdat de belasting te laag is11. Onze methode verbetert de standaardpraktijken door een dun wattenstaafje te gebruiken dat zich op het bindvlies kan richten, waardoor besmetting van de naburige huid wordt vermeden, evenals het concept dat levensvatbare organismen kunnen worden verrijkt door een korte cultuur in voedingsrijke media met als doel levensvatbare maar niet-cultureerbare, evenals verrijking voor zeldzame levensvatbare microben te reanimeren.

De resultaten, relatieve overvloed aan oculaire commensalen per oogdoekje, karakteriseren het conjunctiva resident microbioom en zijn belangrijk voor vergelijkende doeleinden. Onze gegevens tonen aan dat er een verschil is tussen huid en conjunctivale microbiota, evenals een grotere diversiteit met verhoogde leeftijd en een geslachtsspecifiek verschil in overvloed. Bovendien heeft deze aanpak reproduceerbaar commensale verschillen gevonden in knock-out muizen12. Dit protocol kan worden toegepast om het oculaire microbioom te beschrijven dat kan variëren als gevolg van kooipraktijken, geografie of ziektetoestand, evenals de lokale effecten van commensale metabolieten en producten op de ontwikkeling en respons van het immuunsysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met muizen volgen de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee. Volg de laboratoriumveiligheidsrichtlijnen (zoals voorgeschreven door uw afdeling Institutionele Milieuhygiëne) bij het werken met micro-organismen en mogelijk verontreinigde materialen. Gebruik geschikte afvalrecipiënten en ontsmettingsprocedures voordat mogelijk biologisch verontreinigde materialen worden verwijderd.

1. Voorbereiding van oogdoekjes, opstelling van het werkveld, uitstrijkjes van muizenogen en verrijking van monsters

  1. Bereid steriele oogdoekjes voor
    OPMERKING: Steriele oogdoekjes zijn dun gecoate houten tandenstokers met een vezeldunne laag katoenen batting en in huis gemaakt.
    1. Autoclaaf de juiste hoeveelheid wattenslag en tandenstokers voor het aantal muizen dat moet worden uitgewreven.
    2. Knijp een half centimeter lang stuk katoenen slag met duim en wijsvinger af. Plaag het slaan door met duimen en wijsvingers aan de randen te trekken om een vlakke enkele poreuze laag te vormen, stoppend net voordat het slaan uit elkaar valt (kleine stukjes katoen verspreid over het uitgerekt slaan zijn acceptabel).
    3. Draai het slaan rond een van de scherpe uiteinden van de tandenstoker door het uitgerekt stuk lichtjes op de tandenstokerpunt te houden terwijl het gedraaid is, zie figuur 1. Het "voltooide" oogdoekje heeft een zeer dunne laag katoen over de punt, die zich ongeveer een halve tot een centimeter van de punt uitstrekt.
    4. Plaats "voltooide" wattenstaafjes in een klein bekerglas, veeg het wattenstaafje naar beneden en dek af. autoclaaf.
  2. De werkruimte instellen
    1. Bereid anesthesie voor met 2 ml ketamine (100 mg/ml), 400 μL xylazine (100 mg/ml) en 27,6 ml steriele zoutoplossing (0,9% NaCl in dH2O) in een steriele steriele centrifugebuis van 50 ml. Filtersterilisatie en aliquot anesthesie voor onmiddellijk gebruik (kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard; laat altijd vóór gebruik op kamertemperatuur komen).
    2. Maak het werkgebied vrij en reinig het met ontsmettingsmiddel om verontreiniging tot een minimum te beperken.
    3. Aliquot 0,5 ml steriele Brain Heart Infusion media (BHI) in gelabelde steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml (1 buis per muis en controle); schik in microcentrifugerek. Zet het rek op ijs.
    4. Stel de werkstroom als volgt in (van links naar rechts): anesthesiestation voor muizen (kooi met experimentele muizen, lege steriele kooi, anesthesie op kamertemperatuur, 25 G naald en 1 ml spuit), oogswabstation (gesteriliseerd BHI op ijs, gesteriliseerde oogdoekjes, schone papieren handdoeken, 70% isopropanolspray) en beplatingsstation (bloedagarplaten op kamertemperatuur, 10 μL pipet , 10 μL steriele wegwerptips, biogevaarlijke afvalcontainer).
  3. Oog swabbing
    1. Dien 10 μL anesthesie toe per 1 g muisgewichtsdosering van respectievelijk ketamine en xylazine intraperitoneaal aan elke volwassen muis en plaats in een autoclaafkooi. Test anesthesie door achtervoetkussen te knijpen; geen beweging duidt op een passende anesthesie.
    2. Wijs één hand toe om alleen verdoofde muizen te behandelen en de andere hand om alleen het oogdoekje en de cultuur te hanteren. Verwijder voor swabbing de volledig verdoofde muis uit de kooi; plaats bovenop het schone werkoppervlak dat aan de zijkant is geplaatst met het linkeroog bloot. Spuit gehandschoende handen met isopropanol, droog met schone papieren handdoek.
    3. Uncap specifiek gelabeld BHI micro-centrifuge buis met speciale media handling hand. Plaats de buis terug in het microcentrifugerek op ijs.  Dompel de met katoen beklede punt van het oogdoekje in BHI, trek het oogdoekje uit de buis en wervel de punt 2 keer tegen de binnenband om overtollige vloeistof te verwijderen.
    4. Houd de muis met de hand voorzichtig bij het nekvel. Plaats met de andere hand de punt van het oogdoekje tegen het mediale conjunctivale gebied van het linkeroog, zie figuur 2A. Druk de oogbol licht in en beweeg het wattenstaafje in een raamwasbeweging(figuur 2B)heen en weer, tussen het onderste ooglid en het oog, 10 keer. Houd constante druk aan.
    5. Zonder de vacht aan te raken, verwijdert u voorzichtig de punt van het wattenstaafje, loodrecht op de plaats waar het is ingebracht, en plaatst u het wattenstaafje met de katoenen kant direct naar beneden in een gelabelde microcentrifugebuis met BHI-media. Breng een smerende oogdruppel aan op het gesmeerd oog.
    6. Breng de muis terug naar de kooi.
    7. Laat het wattenstaafje 10 tot 15 minuten op ijs staan en verwijder het oogdoekje met de gesteriliseerde gehandschoende hand door de punt gedurende 10 omwentelingen in het medium te mengen. Trek het wattenstaafje gedurende 5 omwentelingen terug door de punt tegen de binnenwand van de microcentrifugebuis te draaien. Gooi het wattenstaafje weg in een biogevaarlijke container.
    8. Herhaal de stappen 1.3.2 tot en met 1.3.7 voor elke muis en voor controlemonsters (huid- of bontdoekje). Steriliseer handschoenen op de juiste manier tussen elk wattenstaafje.
  4. Verrijking
    1. Verrijk het monster door de buis statisch gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen
    2. Label tijdens de incubatie één trypticase soja op kamertemperatuur met 5% schapenbloedagarplaat (TSA-plaat) per muis en verdeel in tweeën.
    3. Verwijder na de incubatie van de oogswabcultuur verrijkte monsters uit de incubator en plaats deze op ijs.
    4. Kort vortexmonsters om te mengen en te borderen volgens het schema in figuur 3A. Aliquot 10 μL van het monster op de TSA-plaat en kantel de plaat om een strip te vormen, herhaal dit 2 keer.
    5. Aan de andere kant van de scheidingslijn van de plaat, punt 10 μL monster op agar, herhaal 9 keer.
    6. Incubeer platen bij 37 °C gedurende 18 uur, 2 dagen en 4 dagen (in een schone kamer die voorkomt dat agarplaten drogen). Tel kolonies in stroken, noteer morfologie en bereken kolonievormende eenheden (CFUs) per swab voor morfologisch vergelijkbare isolaten. Kijk naar stippen voor unieke organismen die niet in stroken zijn gevangen.

2. Masterplaat, karakterisering en identificatie van oculaire microben

  1. Hoofdplaat
    1. Teken roosters op de achterkant van een TSA-plaat (figuur 3B). Kies een kolonie met een steriele tandenstoker van elke muis oog swab plaat en streep de master plate vierkant (rasters), label raster met kolonienummer en muis informatie. Kies en bord drie verschillende kolonies voor elke morfologisch verschillende kolonie.
    2. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C. Ga 96 uur door met incubatie en controleer dagelijks op het verschijnen van nieuwe isolaten.
      OPMERKING: De Commensal-populatie zal variëren op basis van de leeftijd van de muis, voeding, ziektetoestand en kooipraktijken. Isolaatkarakterisering is gebaseerd op de overheersende aerobe en facultatieve anaerobe bacteriën die in ons laboratorium worden aangetroffen.
  2. kenschets
    1. Dupliceer13 plaatmicroben op Mannitol Salt Agar (MSA) en MacConkey (MAC) platen, incubeer 's nachts bij 37 °C. Noteer groei voor elk isolaat en aanwezigheid van wasachtige kolonies of gele kolonies met halo op MSA.
    2. Voor Gram positieve cocci, test met de catalasetest13,14. Plaats een druppel van 3% waterstofperoxide op een schone glazen glijbaan. Kies met een steriele tandenstoker de bijbehorende microbe uit de oogswabplaat. Geen bellenvorming duidt op Streptococcus spp., lichte bubbelvorming duidt op Corynebacterium spp. en misschien Aerococcus spp. en snelle bubbelvorming duidt op Staphylococcus spp.
  3. Identificatie: MALDI-TOF MS-analyse
    OPMERKING: Bacteriële identificaties worden uitgevoerd met behulp van de MALDI-TOF en de Software Database. Dit systeem maakt gebruik van matrix-ondersteunde laser desorptie ionisatie-tijd van vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) voor het ontwikkelen van spectra profielen die worden vergeleken met bekende bacteriële spectra voor identificatie. E.coli, ATCC 8739, wordt gebruikt voor systeemkalibratie.
    1. Plaatbacterieel isolaat op TSA-platen die 5% schapenbloed bevatten en 's nachts incuberen met 5% kooldioxide bij 37 °C.
    2. Breng met behulp van een lus van 1 μL een dunne laag van de zuivere bacteriën aan op de MALDI-TOF-doelschuif; 1 μL MALDI-TOF MS CHCA matrixoplossing (alfa-cyano-4-hydroxycinnoïnezuur) wordt bedekt en volledig aan de lucht gedroogd voordat de dia in het MALDI-TOF-instrument wordt geladen.
    3. Elk isolaat wordt in tweevoud gespot.
    4. Rapporten met waarschijnlijkheidsscores van meer dan 80%, die wijzen op een hoge discriminatiewaarde, worden geaccepteerd als betrouwbare resultaten en de bacteriële identificatie wordt geaccepteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve resultaten voor een oogswabplaat die verschillende methoden voor plateren aantoont, zijn afgebeeld in figuur 3A met morfologisch diverse isolaten van C57BL/6-muis. Voor elk afzonderlijk isolaat werden de kolonies geteld in de strip en de relatieve overvloed, unieke Kolonievormende Eenheden (CFUs) per oogswab, berekend en uitgezet voor vergelijkingsdoeleinden. Voor microbiologische karakterisering werden bacteriën uit individuele muisoogswabplaten geplukt om een master TSA-pla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege de paucibacteriële toestand van het oculaire oppervlak hebben veel laboratoria moeite gehad met het isoleren van oculaire commensalen7,20, wat resulteerde in een laag aantal monsters met groei, lage overvloed en lage diversiteit8. Deze methode verbetert de standaard kweekpraktijken4,21 aanzienlijk door de toevoeging van een verrijkingsstap, evenals een opnieuw ontworpen oog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenverstrengeling om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Financiering van P30 DK034854 ondersteunde VY, LB en studies in het Massachusetts Host-Microbiome Center en financiering van NIH / NEI R01 EY022054 ondersteunde MG.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1 tot 10 µl pipettipUSA Scientific1110-300autoclave voor gebruik
0.5 tot 10 µl Eppendorf pipetFisher Scientific13-690-026
1 ml injectiespuitFisher ScientificBD3096231 spuit voor elke oogveeggroep
1.5 ml EppendorfbuisjesUSA Scientific1615-5500autoclave voor gebruik
1000 µ ml pipettipUSA Scientific1111-2021autoclave voor gebruik
200 tot 1000µl Gilson pipetman (P1000)Fisher ScientificF123602G
25 G naaldFisher Scientific14-826AA1 naald per oogveeggroep
3 % WaterstofperoxideFisher ScientificS25359
37 ° C IncubatorLab apparatuur
70 % IsopropanolFisher ScientificPX1840-4
Ana-Sed Injectie (Xylazin 100 mg/ml)Santa Cruz Animal HealthSC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kitFisher ScientificB12539
BunsenbranderLab apparatuur
Schone papieren handdoekenLab apparatuur
Katoenen watten/Steriele gerolde katoenCVS
Variabele 1 ml PipettenFisher Scientific13-711-9AMvoor Gram kleuring en catalase testen
E.coliATTCATCC 8739
GlijmiddelFisher Scientific12-550-A3voor Gram kleuring en catalase testen
Ketamine (100mg/ml)Henry Schein9950001
Mac Conkey Agar PlatenFisher Scientific4321270bewaar op 4 °C tot gebruik
Mannitol Zout AgarCarolina Biological Supply784641Bereid platen volgens de instructies van de fabrikant, bewaar 1 week op 4 °C
MuizenJackson LabsC57/BL6J
PetrischalenFisher Scientific08-757-12voor Mannitol Zout agar platen
RPI Brain Heart Infusion MediaFisher Scientific50-488525bereid volgens de richtlijnen en autoclave
SteriFlip (0.22 µm poriegrootte polyester sulfone)EMD/Millipore, Fisher ScientifcSCGP00525om anesthesie te steriliseren
Steriele Corning CentrifugebuisFisher Scientific430829anesthesie voorbereiding
Steriele muizenkooiLab apparatuur
Tandenstokers (ronde bamboe)Kitchen Essentialsautoclave voor gebruik en preparatie van het veegje
Trypticase Soy Agar II met 5% Schapenbloed PlatenFisher Scientific4321261bewaar op 4 °C tot gebruik
Vitek doelslideBioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MSBioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrixoplossingBioMerieux Inc. Durham, NC411071
Eenmalig gebruik oogdruppelsCVS PharmacyBausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. elk

Referenties

  1. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
  3. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
  4. Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
  5. Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
  6. Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
  7. Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
  8. Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
  9. Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
  10. Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
  11. Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
  12. Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547(2020).
  13. Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
  14. Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
  15. UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
  16. Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
  17. Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
  18. Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
  19. Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
  20. Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117(2018).
  21. Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880(2017).
  22. Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
  23. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
  24. Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
  25. Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56(2019).
  26. Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831(2019).
  27. Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
  28. Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
  29. Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855(2016).
  30. Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
  31. Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
  32. Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
  33. Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11(2020).
  34. Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van het occulaire microbioombacteriële swabtechniekaerobe bacteriële verrijkingMALDI-TOF MS-identificatiecolony forming unitsprotocol voor oogswabsocculaire oppervlakte van muizendetectie van levensvatbare micro-organismenconjunctivale bacteriële isolatie
Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.