Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van weefsels met een hoge zuiverheid uit de ontwikkeling van gerstzaden

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

26 oktober 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor handmatige isolatie en kwaliteitscontrole van embryo-, endosperm- en zaadmaternale weefsels tijdens de gehele ontwikkeling van gerstzaden.

Samenvatting

Inzicht in de mechanismen die de ontwikkeling van graanzaden reguleren, is essentieel voor plantenveredeling en het verhogen van de opbrengst. De analyse van graanzaden is echter een uitdaging vanwege de minuscule grootte, het vloeibare karakter van sommige weefsels en de nauwe verbindingen tussen weefsels. Hier demonstreren we een gedetailleerd protocol voor dissectie van het embryo, endosperm en maternale weefsels van het zaad in de vroege, middelste en late stadia van de ontwikkeling van gerstzaden. Het protocol is gebaseerd op een handmatige weefseldissectie met behulp van fijnpuntige gereedschappen en een binoculaire microscoop, gevolgd door op ploïdieanalyse gebaseerde zuiverheidscontrole. Zaad, maternale weefsels en embryo's zijn diploïde, terwijl het endosperm triploïde weefsel is. Dit maakt het mogelijk om de zuiverheid van het monster te bewaken met behulp van flowcytometrie. Aanvullende metingen toonden de hoge kwaliteit van het RNA geïsoleerd uit dergelijke monsters en hun bruikbaarheid voor hooggevoeligheidsanalyse. Concluderend beschrijft dit protocol hoe zuivere weefsels praktisch kunnen worden ontleed van zich ontwikkelende korrels van gecultiveerde gerst en mogelijk ook andere granen.

Inleiding

Zaden zijn complexe structuren die zijn samengesteld uit verschillende weefsels van maternale en kinderlijke oorsprong1. Graankorrels vertegenwoordigen een speciaal soort zaad, waarvan het grootste deel wordt gevormd door endosperm, een gespecialiseerd triploïde weefsel dat het embryo beschermt en voedt. Granen leveren ongeveer 60% van de wereldwijde voedselbronnen en zijn de meest waardevolle output van de plantaardige productie2. De kennis van moleculaire processen die de ontwikkeling van graanzaden beheersen, is belangrijk vanwege hun economische bekendheid en centrale rol bij de voortplantingvan planten 1,3.

Gecultiveerde gerst (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5,1 Gbp) is wereldwijd het vierde belangrijkste graangewas. Het wordt gebruikt voor diervoeder, voedsel en biotechnologie4. Daarnaast is het ook een klassieke graansoort in de gematigde zone die steeds belangrijker wordt5. Gerstgenomische bronnen omvatten genetische kaarten, verzamelingen van cultivars, landrassen en mutanten, hoogwaardige genoomassemblages en annotaties, evenals transcriptomische gegevens van de belangrijkste ontwikkelingsstadia 5,6,7. Ook worden gerstgenen gebruikt voor genetische verbeteringen van andere granen. Resistentie tegen abiotische stress zoals droogte en zoutgehalte, specifieke pathogenen en een hoog gehalte aan heilzame verbindingen (bijv. β-glucaan) maken gerst tot een waardevolle bron van eigenschappen voor de tarweveredeling8.

De zaadontwikkeling wordt geïnitieerd door bevruchting op de dag van bestuiving (DOP). DOP wordt gedefinieerd door evaluatie van de morfologie van stigma en helmknoppen volgens de Waddington-schaal (W10.0)9. De aren met niet-bestoven bloemen werden gekenmerkt door compacte (onvertakte) stempels en groene helmknoppen, terwijl bestoven aren verlengde spiketten, verlengde en wijd vertakte stempel, gezwollen zaadknop, geopende helmknoppen en vrij stuifmeel bevatten. De bloemen bij DOP vertegenwoordigden een tussenliggend fenotype. De helmknoppen hadden een gele kleur, verstoorden gemakkelijk en gaven vervolgens stuifmeel af. Stigma had wijd verspreide sigmatische takken van de stamper (Figuur 1C).

De ontwikkeling van gerstzaad omvat drie gedeeltelijk overlappende fasen 1,10. Het stadium I (0 – 6 dagen na bestuiving; DAP) wordt gelanceerd door dubbele bevruchting, gekenmerkt door celproliferatie en de afwezigheid van zetmeelsynthese; fase II (7 – 20 DAP) omvat differentiatie en grote toename van de biomassa, vergezeld van de productie van zetmeel- en eiwitopslagmoleculen; stadium III (na 21 DAP) komt overeen met zaadrijping, gewichtsvermindering door uitdroging en het begin van de kiemrust. Als alternatief worden de fasen respectievelijk vroeg, midden en laat genoemd11.

Gerstkorrel is bedekt met schillen, die bestaan uit de lemma, palea en glumes12. In de meeste gerstgenotypen wikkelen de schillen droge zaden stevig in. Het zaad zelf wordt gevormd door het embryo, het endosperm en de weefsels van de moeder van het zaad (Figuur 1A). Het diploïde embryo is ontstaan door de bevruchting van de eicel door één zaadcelkern. In het volledig ontwikkelde zaad bestaat het embryo uit de embryonale as met de coleorhiza rond de kiemwortel, het coleoptiel dat het meristeem en de primaire bladeren van de scheut omsluit, en het scutellum (zaadlob)1,10,13,14. Het triploïde endosperm is het resultaat van bevruchting van de diploïde centrale cel door de tweede zaadcelkern. De proliferatie van het endosperm begint met het syncytiële (coenocyt) stadium, waar de delende kernen door de centrale vacuole naar de periferie worden geduwd. Aan het einde van de syncytiële fase vormen microtubuli een radiaal netwerk rond de kernen en geven ze de anticlinale celwandvorming en het begin van cellularisatie van het endosperm aan. Endospermdifferentiatie vindt gelijktijdig plaats met de cellularisatie en resulteert in vijf belangrijke weefsels: het zetmeelrijke endosperm, de transfercellen, de aleuron- en subaleurinelagen en het embryo-omringende gebied. Zaad maternale weefsels zijn een meerlagige diploïde structuur van maternale oorsprong die zilvervlies en zaadvliezen bevat 10,12. Zaadmaternale weefsels omvatten een nucellair uitsteeksel aan de dorsale zijde van het graan dat een transportgerelateerde functie heeft en in latere stadia van de zaadontwikkeling in het endosperm wordt ingebed15.

figure-introduction-1
Figuur 1: Ontwikkeling van gerstzaden. (A) De schematische tekening van de graankorrel op het sagittale plan met aangegeven zaadmaternale weefsels (SMT's, groen), endosperm (END, geel), embryo (EMB, oranje) en schillen (H, grijs). (B) Morfologie van gerstpiek dicht bij de anthese. Schaalbalk = 1 cm. (C) Morfologie van stempel en helmknoppen in de stadia voor, tijdens en na de bestuiving. Inzet toont detail van de stempel met stuifmeelkorrels (pijlpunten). Schaalbalk = 5 mm, inzetstaaf = 200 μm. (D) Sagittale en transversale secties van 4, 8, 16 en 24 DAP-zaden. (NP, nucellaire projectie) Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Recente vooruitgang in high-throughput genomics biedt de instrumenten voor de studie van de ontwikkeling van individueel zaadweefsel. Het grootste obstakel voor dit doel is echter de compacte structuur en strakke hechting van de zaadweefsels1. We ontwikkelden een protocol voor zeer zuivere dissectie van zaadweefsels van het ontwikkelen van gerstzaden met de mogelijkheid om ze vervolgens te gebruiken voor zeer gevoelige analyses, zoals RNA-sequencing. Bovendien kan het gepresenteerde protocol eenvoudig worden aangepast aan andere granen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Planten kweken

OPMERKING: Gezien het feit dat een enkele gerstplant meestal 5 tot 6 uitlopers heeft en alleen de middelste 5 tot 6 aartjes van elke tak moeten worden gebruikt voor dissectie, dan is een maximale opbrengst per plant 72 zaden voor tweerijige en 216 zaden voor zesrijige cultivars.

  1. Om gerstzaden te laten ontkiemen, maakt u een petrischaal die is opgevuld met drie lagen cellulosetissuepapier bedekt met een laag filterpapier. Bevochtig het met gedestilleerd water, zodat er geen overtollig water is, leg de zaden op het oppervlak en sluit de petrischaal. Filtratiepapier voorkomt dat de wortels door het celluloseweefsel groeien. Ontkiem de zaden 3 dagen bij 25 °C in het donker.
    OPMERKING: U kunt de zaden ook laten ontkiemen door ze direct in een nat grondmengsel te doen (zie stap 1.2).
  2. Breng ontkiemde zaden met een zichtbare kiemwortel en scheut van ongeveer 5 cm over in turfpotten van 5 cm x 5 cm met een mengsel van aarde en zand (3:1, v/v). Geef regelmatig water. Breng de planten na 10 dagen over in potten van 12 cm x 12 cm gevuld met hetzelfde grondmengsel.
  3. Kweek de planten in een klimaatkamer onder het gecontroleerde lange-dagregime (16 uur per dag 20 °C, 8 uur per nacht 16 °C; lichtintensiteit 200 μmol m-2 s-1; vochtigheid 60%).
    OPMERKING: Lentegerst heeft ongeveer 8-10 weken nodig vanaf het zaaien tot het begin van de anthese, zonder dat vernalisatie nodig is. Wintergerst heeft 7-8 weken vernalisatie nodig (kortedagomstandigheden, 8 uur per dag 4 °C, 16 uur 's nachts 4 °C; lichtintensiteit 200 μmol m-2 s-1; vochtigheid 85%) om de bloei op te wekken.

2. Bepaling van de bestuiving

OPMERKING: Nauwkeurige bepaling van de bestuiving is nodig voor een goede schatting van de ontwikkelingsprogressie. Gerst is een zelfbestuivende soort. Om de dag van bestuiving (DOP) te definiëren, hebben we de dag van zelfbestuiving gemonitord. Deze eigenschap is cultivarspecifiek, maar het begin van het uitsteken van de vleugels uit de bladschede is een goede indicator voor het naderen van DOP (Figuur 1B).

  1. Open de bladschede die de aar bedekt. Gebruik een pincet met fijne punt om helmknoppen en de eierstok in de aartjes in het centrale deel van de spike te controleren. Aartjes met gele helmknoppen en "donzige" stempel zullen binnen enkele uren bestuiven16 en worden beschouwd als DOP (Figuur 1B).
  2. Knip de aar bij de punt van het laatste aartje af en verwijder het vlagblad en het bovenste deel van de awns. Knip vervolgens de bovenste 1/3 van de rompen in elk aartje af. Dit droogt de helmknoppen uit en leidt tot hun meer gesynchroniseerde opening en afgifte van stuifmeel.
  3. Bedek de spike met een pergamijnzak met de spike-ID, het plantnummer en de gedefinieerde DOP-datum. Dit voorkomt ook kruisbestuiving, die specifieke experimenten in het gedrang kan brengen.
  4. Noteer de informatie aan een tabeleditor. Gebruik de volgende formule om de dag na bestuiving (DAP) te berekenen wanneer weefselisolatie moet plaatsvinden.
    xDAP = DOP + x
    x = verwachte DAP
    OPMERKING: De waarden moeten de notatie 'Gegevens' hebben.
  5. Verzamel voor dissectie van zaadweefsels de spikes bij DAP volgens de voorbereide tabelkalender.

3. Dissectie van de zaadweefsels

OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop. Verwijder de rompen voor het dissectien met een pincet. Merk op dat rompen droger en meer hechtend worden vanaf ongeveer 16 DAP. Om de fysiologische omstandigheden te behouden en uitdroging van het plantmateriaal tijdens de dissectie te voorkomen, bevochtigt u de monsters door ze in een druppel van 1x PBS te doen (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4). Gebruik een nieuw zaadje voor dissectie van elk weefsel om DNA-, RNA- of eiwitafbraak als gevolg van een langere monsterafnametijd te voorkomen. Gebruik voor RNA-isolatie uit ontleed materiaal alleen RNase-vrije materialen en chemicaliën. Overschrijd de totale dissectietijd van 15 minuten niet voor één monster, meestal bestaande uit weefsels die zijn ontleed van 5-10 zaden om RNA-afbraak te minimaliseren.

  1. Verwijder de rest van de rompen met een pincet met fijne punt voordat u het weefsel dissectiet. Hydrateren met 1× PBS gedurende 1 minuut helpt om droge resten van het aartje te verwijderen.
  2. Leg het gepelde zaad op een petrischaal met een druppel 1× PBS en ontleed de afzonderlijke delen met een pincet met fijne punt, een fijne naald en een microcapillaire pipet. Een iets andere strategie wordt toegepast voor de dissectie van individuele weefsels: de zaadweefsels van de moeder (stap 3.3), het embryo (stap 3.4) en het endosperm (stap 3.5).
  3. Dissectie van maternale weefsels van het zaad
    1. Dissectie van zaden tot 8 DAP
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde en snijd het zaadje voorzichtig langs een lengteas af, en pel het weefsel van het zaad van de moeder af, behalve de laatste laag die grenst aan het endosperm van het apicale naar het basale deel met behulp van een pincet.
      2. Verzamel zaadweefsel van de moeder van 5 tot 10 zaden in een buisje van 1,5 ml met 50 μl 1× PBS, gooi de buffer weg met een pipet, spoel het weefsel twee keer met 100 μl PBS, verwijder overtollige buffer door te pipetteren en sluit de buis en vries in vloeibare stikstof in of gebruik direct voor flowcytometrische ploïdiemeting. De hoeveelheid materiaal is voldoende voor typisch één downstream-toepassing (bijv. RNA-isolatie of flowcytometrische ploïdiemeting).
    2. Dissectie van zaden na 8 DAP
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde, snijd voorzichtig in het midden van de ventrale zijde van het moederlijk weefsel van het zaad en pel geleidelijk het weefsel rond het hele zaad af, inclusief nucellaire projectie. Verzamel en was voor elke downstream-toepassing het weefsel van 5 tot 10 zaden zoals beschreven in stap 3.3.1.
  4. Dissectie van het embryo
    1. Dissectie van zaden bij 8 DAP en jonger
      1. Leg een zaadje op de dorsale kant en snijd basaal 1/3 van het zaadje af. Splits het afgescheiden deel voorzichtig in tweeën en laat het embryo los. Verzamel en spoel voor elke downstream-toepassing de embryo's van 10 tot 20 zaden zoals beschreven in 3.3.1.
    2. Dissectie van zaden na 8 DAP
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde en verwijder het weefsel van het moederlijk zaad van het basale deel van de ventrale zijde. Verstoor voorzichtig de dunne laag endosperm rond de omtrek van het embryo met een fijne naald of een pincet met fijne punt en pel het embryo eruit. Verzamel en spoel voor elke downstreamtoepassing embryo's van maximaal 5 zaden zoals beschreven in 3.3.1.
  5. Dissectie van het endosperm
    1. Dissectie van syncytieel endosperm van 4 DAP-zaden.
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde en verwijder het weefsel van de zaadmoeder, met uitzondering van de laatste laag cellen die grenst aan het endosperm. Prik voorzichtig in het midden van de buikzijde door een dunne naald en zuig het syncytiële endosperm door capillaire werking op met behulp van een microcapillaire pipet.
      2. Verzamel voor elke stroomafwaartse toepassing vloeibare endospermen van 10 tot 15 zaden in een nieuwe buis van 1.5 ml met buffer die geschikt is voor de geplande stroomafwaartse analyse (d.w.z. 1x PBS, RNA-isolatiebuffer, flowcytometriebuffer). Het buffervolume moet overeenkomen met het protocol voor de geplande downstreamtoepassing. Bevries in vloeibare stikstof.
    2. Dissectie van het celullariserende endosperm van 5 tot 8 DAP-zaden
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde en verwijder al het zaad, het moederlijk weefsel en het embryo. Verzamel en was voor elke stroomafwaartse toepassing het endosperm van 10 tot 15 zaden in een nieuwe tube van 1,5 ml met 1x PBS en vries in vloeibare stikstof in.
    3. Dissectie van het gecoullariseerde endosperm uit zaad na 8 DAP
      1. Plaats een zaadje op de dorsale zijde, verwijder al het zaad, het weefsel van de moeder en het embryo. Verzamel en was voor elke downstreamtoepassing het endosperm van een enkel zaadje per buisje, zoals beschreven in stap 3.3.1.
  6. Bewaar de buisjes met geïsoleerd materiaal tot gebruik bij – 80 °C.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. Controle van de weefselzuiverheid met behulp van flowcytometrie

OPMERKING: De zuiverheid van het monster kan worden gecontroleerd met behulp van flowcytometrie vóór RNA-isolatie. Een goede kalibratie van het instrument is van cruciaal belang voor de analyse van biologische monsters. De optiek van de flowcytometer/ploïdie-analysator moet worden afgesteld met behulp van kalibratiekralen (fluorescerend gekleurde polystyreenmicrosferen die zeer uniform zijn wat betreft hun grootte en fluorescentie-intensiteit) tot de maximale piekscherpte, die doorgaans de variatiecoëfficiënt (CV) < 2% bereikt. Weefsels van graanzaad bevatten voornamelijk populaties van G1, G2 en endogeredupliceerde kernen; Daarom wordt het gebruik van een logaritmische schaal aanbevolen. Begin met een bladweefsel dat voornamelijk G1-kernen bevat en dient als een basale ploïdiecontrole.

  1. Gebruik vers bereide monsters die op ijs worden bewaard (zie stap 3.3.1) of ingevroren weefsel zoals beschrevenin punt 17.
    OPMERKING: Omdat het hele < 8 DAP-monster wordt gebruikt voor flowcytometrie, vertegenwoordigt dit slechts een indirecte controle. We raden onderzoekers aan om meerdere isolaties en metingen uit te voeren totdat een hoog percentage zuivere monsters (>90%) is bereikt voordat ze overgaan tot RNA-isolatie met < 8 DAP-monsters.
  2. Maak de kernen van de 4 en 8 DAP-embryomonsters vrij (voor andere monsters zie stap 4.4) door de weefsels te homogeniseren met 5 tot 10 slagen van de plastic stamper in een buis van 1.5 ml met 300 μl Otto I-buffer (0.1 M citroenzuurmonohydraat, 0.5% (v/v) Tween 20, gefilterd door een filter van 0.22 μm)18.
  3. Filtreer de ruwe suspensie door 50 μm nylon gaas in een flowcytometrie-analysebuis en voeg 600 μL Otto II-buffer (0,4 M Na2HPO4·12H2O) met 2 μg mL-1 DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool)18 toe om DNA te kleuren.
  4. Plaats alle andere weefsels (inclusief 16 DAP of oudere embryo's) op een petrischaaltje met 500 μL Otto I-buffer en gehomogeniseerd door hakken met een scheermesje. Filtreer de suspensie zoals in stap 4.3 en kleur met 1 ml Otto II-buffer die DAPI bevat.
    OPMERKING: Manipulatie met een scherp dubbelzijdig scheermesje vereist speciale aandacht. Om het risico op letsel te verminderen, zijn er scheermesjes met één rand of speciale meshouders beschikbaar.
  5. Schat het nucleaire DNA-gehalte van het monster met behulp van een flowcytometer. Er zijn minimaal 2000 deeltjes per monster nodig voor het analyseren van de monsterzuiverheid.

5. RNA-isolatie en kwaliteitsmeting

  1. Gebruik bevroren weefsel om RNA-afbraak door endogene ribonucleases te voorkomen. Uit zaad, maternale weefsels en embryomonsters wordt RNA geïsoleerd met behulp van in de handel verkrijgbare kits of TRIzol-reagens19. Vanwege een hoog zetmeelgehalte in endospermweefsels, isoleer het totale RNA uit alle monsters met behulp van commerciële on-column RNA-extractieprotocollen voor problematische weefsels (bijv. Spectrum Plant Total RNA Kit) met een on-column DNase I-behandeling20.
  2. Meet de RNA-concentratie en -integriteit met behulp van een speciaal protocol voor RNA-gelelektroforese of Agilent 2100 Bioanalyzer.
    OPMERKING: Intact totaal RNA heeft een duidelijke 18S en 25S rRNA-banden/pieken met een grootte van respectievelijk ongeveer 1,9 en 3,7 kb. De 25S rRNA-band moet ongeveer twee keer intenser zijn dan de 18S rRNA-band.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een weefselspecifieke transcriptomische analyse van de ontwikkeling van gerstzaad uit te voeren, hebben we een protocol opgesteld voor weefselisolatie met een hoge zuiverheid. Het protocol is gebaseerd op de handmatige dissectie van embryo-, endosperm- en zaadmaternale weefsels van gepelde (na handmatige verwijdering van de romp) korrels (Figuur 1A). Het protocol werd met succes gebruikt voor het isoleren van materialen van verschillende twee- en zesrijig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een protocol dat een zeer zuivere isolatie van gerstzaadweefsels mogelijk maakt. Hoewel het is ontwikkeld en getest voor gerst, kan het gemakkelijk worden overgenomen door andere leden van de Triticeae-stam , zoals tarwe, haver, rogge of triticale27. Het eerste deel van het protocol, gericht op dissectie van zaadweefsel, vereist geen niet-standaard of dure apparatuur en zou daarom voor veel wetenschappers toegankelijk moeten zijn. Een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Jan Vrána en Dr. Mahmoud Said voor het onderhoud van flowcytometers, Eva Jahnová voor het opstellen van buffers, Marie Seifertová voor de materiaallijst en Zdenka Bursová voor de verzorging van de planten. Dit werk werd voornamelijk ondersteund door de subsidie 18-12197S van de Tsjechische Wetenschappelijke Stichting. A.P. werd verder ondersteund door de J. E. Purkyně Fellowship van de Tsjechische Academie van Wetenschappen en het EFRO-project "Planten als instrument voor duurzame wereldwijde ontwikkeling" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 um filterMerckSLGSV255F
1.5 ml Eppendorf tubeSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phenylindoleInvitrogenD21490
50 um nylon meshSilk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Bulb AssemblyDrummond Scientific Company1-000-9000
Calibration beadsInvitrogenA16502
Cellulose tissue paper
Citric acid monohydratePenta13830-31000
Climatic chamberWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter paperFagron
Fine-pointed tweezersFine Science Tools11254-20
Flow cytometerSysmex-Partec
Flow cytometry tubeSarstedt55.484
Freezer
Glassine bag
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Liquid nitrogenLinde
Microcapillary pipetteFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Peat potsJiffy5x5 cm
Petri dish
Pin HolderFine Science Tools26016-12
Plastic pestlep-LabA199001
Pots12x12 cm
Razor bladeGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Sand
ScissorsFine Science Tools14060-11
Soil
Spectrum Plant Total RNA KitSigma AldrichSTRN50
StereomicroscopeOlympus
Tween 20Sigma AldrichP2287
TRIzol reagentInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513

Referenties

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Ontwikkeling van gerstzadenweefseldissectieploidieanalyseflowcytometrieembryo isolatieendosperm isolatieisolatie van maternaal weefselbinoculair microscooponderzoekRNA kwaliteitsanalysezuiverheid van granenweefsel
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.