Methodenartikel

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

4.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61687

⸱

5 november 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Pancreassap is een kostbare bron van biomarkers voor menselijke alvleesklierkanker. We beschrijven hier een methode voor intraoperatieve incassoprocedure. Om de uitdaging van het aannemen van deze procedure in muizenmodellen te overwinnen, stellen we een alternatief monster voor, tumor interstitiële vloeistof, en beschrijven we hier twee protocollen voor de isolatie ervan.

Samenvatting

Pancreasadenocarcinoom (PDAC) is de vierde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte en binnenkort de tweede. Er is een dringende behoefte aan variabelen geassocieerd met specifieke pancreaspathologieën om preoperatieve differentiële diagnose en patiëntprofilering te helpen. Pancreassap is een relatief onontgonnen lichaamsvloeistof, die, vanwege de nabijheid van de tumorplaats, veranderingen in het omliggende weefsel weerspiegelt. Hier beschrijven we in detail de intraoperatieve incassoprocedure. Helaas is het vertalen van pancreassapverzameling naar muizenmodellen van PDAC, om mechanistische studies uit te voeren, technisch zeer uitdagend. Tumor interstitiële vloeistof (TIF) is de extracellulaire vloeistof, buiten bloed en plasma, die tumor- en stromale cellen baadt. Net als bij pancreassap, voor zijn eigenschap om moleculen te verzamelen en te concentreren die verdund in plasma worden aangetroffen, kan TIF worden gebruikt als een indicator van veranderingen in de micro-omgeving en als een waardevolle bron van ziekte-geassocieerde biomarkers. Omdat TIF niet gemakkelijk toegankelijk is, zijn verschillende technieken voorgesteld voor de isolatie ervan. We beschrijven hier twee eenvoudige en technisch niet veeleisende methoden voor de isolatie ervan: weefselcentrifugatie en weefselelutie.

Inleiding

Pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een van de meest agressieve tumoren en wordt binnenkort de tweede belangrijkste doodsoorzaak 1,2,3. Het staat bekend om zijn immunosuppressieve micro-omgeving en om zijn niet-responsiviteit op immunotherapieprotocollen4. Momenteel is chirurgische resectie nog steeds de enige curatieve optie voor PDAC, maar er is een hoge frequentie van vroege recidieven en postoperatieve complicaties. Het ontbreken van specifieke symptomen tot een vergevorderd stadium maakt een vroege diagnose niet mogelijk, wat bijdraagt aan de deadlines van de ziekte. Bovendien kan de overlap van symptomen tussen PDAC en andere goedaardige pancreaspathologieën het bereiken van een snelle en betrouwbare diagnose met de huidige diagnostische strategieën belemmeren. De identificatie van variabelen geassocieerd met specifieke pancreaspathologieën kan het chirurgische besluitvormingsproces vergemakkelijken en de patiëntprofilering verbeteren.

Veelbelovende resultaten bij het ontdekken van biomarkers zijn bereikt met behulp van gemakkelijk toegankelijke lichaamsvloeistoffen, zoals bloed 5,6,7, urine8, speeksel9 en pancreassap 10,11,12. Veel studies hebben gebruik gemaakt van uitgebreide "omics" -benaderingen, zoals genomische, proteomische en metabolomische technieken, om kandidaat-moleculen of handtekeningen te identificeren die onderscheid kunnen maken tussen PDAC en andere goedaardige pancreasaandoeningen. We hebben onlangs aangetoond dat pancreassap, een relatief onontgonnen lichaamsvloeistof, kan worden gebruikt om metabole handtekeningen van patiënten met verschillende klinische profielen te identificeren12. Pancreassap is een eiwitrijke vloeistof, die het secretoom van pancreaskanaal verzamelt en naar het hoofdkanaal van de pancreas stroomt en vervolgens naar het belangrijkste gemeenschappelijke galkanaal. Vanwege de nabijheid van de alvleesklier kan het sterk worden beïnvloed door micromilieuverstoringen veroorzaakt door de tumormassa (figuur 1), en daarom informatiever dan bloed of urine, of op weefsel gebaseerde profilering. Verschillende studies hebben het potentieel van pancreassap onderzocht om nieuwe biomarkers van ziekten te identificeren met behulp van verschillende benaderingen, waaronder cytologische analyse13, proteomische analyse uitgevoerd door massaspectrometrie14,15, beoordeling van genetische en epigenetische markers zoals K-ras- en p53-mutaties 16,17, veranderingen in DNA-methylatie18 en miRNA's19 . Technisch gezien kan pancreassap intraoperatief of met minimaal invasieve procedures worden verzameld, zoals endoscopische echografie, retrograde cholangio-pancreatografie of door endoscopische verzameling van duodenale sapsecretie20. Het is nog niet duidelijk in hoeverre de samenstelling van pancreassap wordt beïnvloed door de gebruikte verzameltechniek. We beschrijven hier de intraoperatieve verzamelprocedure en tonen aan dat pancreassap een kostbare bron kan zijn voor PDAC-biomarkers.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van de verzameling van pancreassap. (A) Schematische weergave van de afscheiding van pancreassap in de pancreaskanalen en de verzameling ervan tijdens de operatie. De inzet toont een close-up van de micro-omgeving van de tumor: pancreassap verzamelt moleculen die vrijkomen door tumor- en stromale cellen in de pancreaskanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het verzamelen van pancreassap in genetische en orthotopische muismodellen van PDAC zou worden gewaardeerd in het perspectief om deze biofluïde te exploiteren in preklinische mechanistische studies; deze procedure kan echter technisch zeer uitdagend zijn en is niet haalbaar voor eenvoudigere modellen zoals subcutane tumoren. Om deze reden identificeerden we tumor interstitiële vloeistof (TIF) als een alternatieve bron voor pancreassap, vanwege het vergelijkbare kenmerk van het fungeren als een indicator van omliggende verstoringen. Interstitiële vloeistof (IF) is de extracellulaire vloeistof, gevonden buiten bloed- en lymfevaten, die weefselcellen baadt21. ALS de samenstelling wordt beïnvloed door zowel de bloedcirculatie naar het orgaan als de lokale secretie; in feite produceren en scheiden omliggende cellen actief eiwitten af in de IF21. Het interstitium weerspiegelt micromilieuveranderingen van omliggende weefsels en kan daarom een waardevolle bron zijn voor biomarkerontdekking in verschillende pathologische contexten, zoals tumoren. De hoge concentratie van lokaal uitgescheiden eiwitten in TIF kan worden gebruikt om kandidaat-moleculen te identificeren die moeten worden getest als prognostische of diagnostische biomarkers in plasma 22,23,24. Verschillende studies hebben aangetoond dat TIF een geschikt monster is voor proteomische benaderingen met hoge doorvoer, zoals massaspectrometrietechnieken23,24,25, evenals multiplex ELISA-benaderingen26 en microRNA-profilering27.

Er zijn verschillende benaderingen voorgesteld voor de isolatie van IF in tumoren, die in grote lijnen kunnen worden gecategoriseerd als in vivo (capillaire ultrafiltratie 28,29,30,31 en microdialyse 32,33,34,35) en ex vivo methoden (weefselcentrifugatie 22,36,37,38 en weefselelution 39,40,41,42). Deze technieken zijn uitgebreid besproken43,44. Bij de keuze van de geschikte methode moet rekening worden gehouden met zaken als de downstreamanalyses en -toepassingen en het teruggewonnen volume. We hebben deze aanpak onlangs gebruikt als een proof of principle om de verschillende metabole activiteit van tumoren van twee muizen pancreas adenocarcinoom cellijnen12 aan te tonen. Op basis van literatuur24,38 hebben we ervoor gekozen om de lage snelheid centrifugatiemethode te gebruiken om celbreuk en verdunning door intracellulaire inhoud te voorkomen. Zowel de hoeveelheid glucose als lactaat in TIF weerspiegelden de verschillende glycolytische kenmerken van de twee verschillende cellijnen. Hier beschrijven we in detail het protocol voor de twee meest gebruikte methoden voor de isolatie van TIF: weefselcentrifugatie en weefselelutie (figuur 2).

figure-introduction-2
Figuur 2: Schematische weergave van tumor interstitiële vloeistofisolatiemethoden. Schematische illustratie van de in detail beschreven technieken in het protocol, namelijk weefselcentrifugatie (A) en weefselelutie (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor alle geïncludeerde patiënten werden perifeer bloed en pancreassap verzameld op het moment van de operatie volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van de instelling. Alle patiënten werden geïncludeerd in de studie na ondertekende geïnformeerde toestemming, inclusief het verzamelen van biologische monsters en klinische gegevens. De studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Instelling (protocolnummer ICH-595, goedkeuring afgegeven in mei 2009). Procedures met muizen en hun verzorging werden nageleefd in overeenstemming met de EU- en institutionele richtlijnen (protocol ID 121/2016-PR).

1. Isolatie van pancreassap

OPMERKING: De terugtrekking van pancreassap wordt uitgevoerd in de context van een open procedure van pancreasresectie (bijv. Pancreaticoduodenectomie, totale pancreatectomie, distale pancreatectomie) door een equipe van deskundige pancreaschirurgen.

  1. Selectie van patiënten
    1. Overweeg voor de procedure elke patiënt die is gepland voor een open pancreasresectie.
    2. Bevestig de opname als de grootte van de hoofdkanalen van de pancreas voldoende wordt geacht om het ophalen van pancreassap mogelijk te maken. De minimale limiet in diameter van het hoofdkanaal van de pancreas wordt beschouwd als 2 mm bij contrastverbeterde CT-beeldvorming.
  2. Preoperatieve studie van pancreaskanaal bij contrastverbeterde CT-beeldvorming om de planning van het ophalen van pancreassap te helpen
    1. Plaats het hoofdkanaal van de pancreas driedimensionaal in de klier ter hoogte van de pancreashals: meet de afstand van het hoofdkanaal van de pancreas tot de voorste, superieure en inferieure pancreasmarge op dwarsdoorsnedeglijbanen en coronale en sagittale renderings. Eenmaal in de operatiekamer, gebruik deze metingen om de juiste plaats te benaderen waar de alvleesklier moet worden doorboord om het Wirsung-kanaal te cannuleren en pancreassap op te halen.
  3. Voorbereiding van materiaal
    1. Steriel materiaal: Open de steriele envelop van een naald van 25 G en een spuit van 3 ml en plaats ze in het steriele veld met de medewerking van de scrubverpleegkundige.
    2. Niet-steriel materiaal: Houd een K2EDTA vacuümtestbuis van 3 ml bij de hand in de operatiekamer voor de opslag van de vloeistof.
  4. Voorbereiding van de patiënt
    1. Plaats de patiënt op het bed in de operatiekamer. Induceer gemengde algemene anesthesie, met behulp van Remifentanil, Sevorane en Rocuronium, intubeer vervolgens en begin met het ventileren van de patiënt. Plaats de patiënt in liggende decubitus met de rechterarm tegen het lichaam en de linkerarm ontvoerd tot 90° graden vastgezet op een armplank.
    2. Desinfecteer de huid van de buik op de plaats van de incisie. Creëer en onderhoud een steriel veld op de buik dat de patiënt drapeert.
  5. Chirurgische ingreep
    1. Voer een subcostale incisie uit en krijg toegang tot de buikholte. Plaats een Rochard abdominale retractie voor orgaanblootstelling.
    2. Blootstellen en mobiliseren van de alvleesklier door Kocher-manoeuvre, opening van het gastrocolische ligament, incisie van het retroperitoneale weefsel langs superieure en inferieure rand van de pancreas, waardoor een dissectievlak ontstaat tussen pancreashals en superieure mesenteriale ader die zich achteraan bevindt.
    3. Zodra de alvleesklier is gemobiliseerd en blootgesteld, gaat u verder met pancreassapontwenning voordat u de pancreashals doorsnedet.
  6. Identificatie en lokalisatie van de pancreaskanaal
    1. Schat de locatie van de pancreaskanaal met behulp van de meting die is uitgevoerd bij beeldvorming en palpeer vervolgens het voorste oppervlak van de pancreas om de exacte locatie te identificeren.
  7. Verzameling van pancreassap
    1. Houd de pancreaskop en de twaalfvingerige darm van onderaf vast en til deze op met de linkerhand en markeer de locatie van het pancreaskanaal met het eerste cijfer.
    2. Houd de spuit van 3 ml vast met de naald van 25 G erop.
    3. Gebruik de rechterhand om de naald in de alvleesklier te steken, net distale naar de linkerduim. Bepaal de penetratiediepte en de mate van helling van de naald op basis van preoperatieve metingen en op basis van de perceptie dat u de kanaalwand bent binnengedrongen.
    4. Zuig het sap op met de spuit. Als het niet mogelijk is om het sap op te halen, verplaats dan de naald in de vier richtingen en probeer het pancreaskanaal te cannuleren.
    5. Zodra het pancreassap is opgehaald, verplaatst u het buiten het steriele veld en brengt u het over naar de K2EDTA-vacuümtestbuis van 3 ml. Bewaren bij 4 °C totdat het monster naar het laboratorium wordt overgebracht en zo vroeg mogelijk verder worden verwerkt.
      OPMERKING: Het volume pancreassap dat met deze procedure kan worden hersteld, varieert sterk, variërend van ongeveer 0,2 ml tot 3 ml in onze ervaring. De hoeveelheid opgehaald sap is sterk afhankelijk van de patiënt: de afmeting van het Wirsung-kanaal en de functionele status van de alvleesklier (functioneren versus atrofische klier). In onze ervaring is er geen hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de hoeveelheid opgehaald pancreassap te verhogen.

2. Verwerking van pancreassap

  1. Centrifugeer pancreassap bij 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om cellen of vuil te verwijderen.
    OPMERKING: Pancreassap moet helder en transparant van kleur zijn vóór centrifugatie. Bloedbesmetting tijdens de operatie kan soms optreden, waardoor het monster troebeler en roder van kleur lijkt. Overweeg om dergelijke monsters uit te sluiten van verdere analyses.
  2. Herstel het supernatant, aliquot en bewaar het bij -80 °C tot verdere analyses.

3. Inductie van subcutane tumoren

OPMERKING: De murine Panc02- en DT6606-cellijnen werden verkregen van respectievelijk Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milaan, Italië) en Prof. Francesco Novelli (Centrum voor Experimenteel Onderzoek en Medische Studies, Turijn, Italië), zoals eerder beschreven12.

  1. Groei van tumorcellen
    1. Kweek Panc02 en DT6606 cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS), 2mM L-Glutamine en 1% penicilline-streptomycine antibioticum.
    2. Ontdooi bevroren cellen 1-2 weken vóór tumorinjectie, volgens de groeisnelheid van de cellijn.
    3. Kweek cellen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid in steriele omstandigheden.
    4. Maak cellen los met 0,025% Trypsine/EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken en elimineer trypsine door centrifugatie.
      OPMERKING: DT6606 zijn primaire, niet vereeuwigde cellen, afgeleid van de LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre muis, en mogen niet meer dan 3 keer worden gepasseerd voor injectie in vivo om hun oorspronkelijke kenmerken te behouden. Het wordt aanbevolen om DT6606-cellen 7-10 dagen voorafgaand aan de injectie te ontdooien.
  2. Injectie van tumorcellen in vivo
    1. Trypsinize cellen (zie stap 3.1.4) en was ze eenmaal met Phosphate-Buffered Saline (PBS). Elimineer PBS door centrifugatie en resuspendeer cellen in verse PBS voordat u gaat tellen.
    2. Tel de cellen en resuspenteer ze in PBS in een concentratie van 0,5-1 x 107 cellen / ml om een uiteindelijke concentratie van 0,5-1 x 106 cellen / 100 μL te hebben om in elke muis te injecteren. Bereid de overtollige cellen voor. Houd de cellen op 4 °C of op ijs tot het einde van de procedure.
    3. Groepeer de dieren (8 weken oude vrouwelijke C57BL/6J muizen) in verschillende kooien volgens verschillende cellijnen of behandelingen.
    4. Houd de dieren handmatig in bedwang en verdoof ze met een mengsel van Ketamine (80 mg/kg) en Xylazine (10 mg/kg) of volgens lokaal goedgekeurde procedures.
    5. Scheer de injectieplaats, meestal een flank boven een been, met een elektrisch scheerapparaat en reinig de injectieplaats zorgvuldig met alcohol.
    6. Pipetteer de celophanging op en neer met een spuit van 1 ml, verwijder eventuele luchtbellen door de zuiger op en neer te bewegen. Bevestig een naald van 25 G aan de spuit en duw de zuiger omhoog totdat de celsuspensie de naaldopening bereikt.
    7. Knijp de huid van de flank met een platte tang en steek de naald voorzichtig aan de basis van de huidplooi tussen de tang zonder de peritoneale holte of de musculatuur te doorboren. Om de juiste positie van de naald te controleren, probeert u voorzichtig de punt van de naald zijwaarts onder de huid te bewegen. De naald moet vrij bewegen.
    8. Injecteer langzaam 100 μL celsuspensie (met 0,5-1 x 106 cellen), klem de injectieplaats voorzichtig gedurende enkele seconden vast en trek de naald langzaam terug zonder enige zijwaartse beweging.
    9. Breng de muis terug naar zijn kooi en controleer het herstel van de anesthesie.
    10. Controleer de tumorgroei met behulp van een remklauw gedurende 3-4 weken. Euthanaseer de dieren wanneer tumoren ongeveer 0,5-1 cm3 bereiken met behulp van CO2 of volgens lokaal goedgekeurde procedures.

4. Isolatie van tumor interstitiële vloeistof (TIF)

  1. Excisie van subcutane tumoren
    1. Blokkeer de ledematen van de dieren met papieren tape en reinig de huid met alcohol. Snijd de huid op de buik open om deze van het buiklichaam te scheiden en door te gaan naar de ledematen. Snijd de tumor die onder de huid van de flank is gegroeid met behulp van een schaar, klemmen en uiteindelijk een scalpel.
    2. Weeg de tumor en bewaar deze in een schone buis op ijs tot na isolatie van TIF.
  2. Isolatie van TIF door centrifugatie
    1. Snijd de tumor doormidden, spoel de twee delen snel in PBS en dep ze voorzichtig op filterpapier om overtollige PBS te verwijderen. Voer deze stappen zo snel mogelijk uit om verdamping van de tumor te voorkomen.
    2. Breng de tumor onmiddellijk over in een nylon celzeef van 20 μm die bovenop een conische buis van 50 ml is aangebracht.
    3. Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
      OPMERKING: Deze centrifugatie met lage snelheid behoudt de celintegriteit en voorkomt besmetting van TIF door intracellulair compartiment. Intracellulaire inhoudslekkage kan worden getest in downstream-toepassingen, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van intracellulaire huishoudeiwitten, zoals ribosomale eiwitten, te beoordelen 25.
    4. Herstel de TIF van de bodem van de buis, aliquot deze uiteindelijk en vries deze onmiddellijk in op droogijs en bewaar bij -80 °C tot verdere analyse.
      Optioneel: Op basis van de downstream proteomische analyse die moet worden uitgevoerd, verdunt u het monster in PBS met een proteaseremmercocktail om afbraak van specifieke moleculen te voorkomen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de samenstelling van de tumor, leveren in sommige gevallen zeer kleine tumoren geen vloeistof op.
  3. Isolatie van TIF door elutie
    1. Snijd de tumor in kleine stukjes (≈1-3 mm3) met een schaar of een scalpel en spoel voorzichtig met koude PBS.
      OPMERKING: In deze stap is het erg belangrijk om snel te werken en minimale manipulatie uit te voeren om celbeschadiging te voorkomen.
    2. Breng de tumorstukken over in een buis van 1,5 ml en voeg 500 μL PBS toe met een proteaseremmercocktail om afbraak van analyten te voorkomen. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
    3. Herstel het supernatant en breng het over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om eventuele cellen uit het monster te verwijderen.
    4. Breng het supernatant over in een nieuwe buis en centrifugeer opnieuw bij 2.000 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C.
    5. Breng het supernatant over in een nieuwe buis en centrifugeer opnieuw bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om vuil te verwijderen. Herstel het supernatant. Onmiddellijk aliquot en vries het TIF-monster in op droogijs en bewaar het bij -80 °C tot verdere analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We volgden de hierboven beschreven procedure om pancreassap te verkrijgen van patiënten met PDAC (n = 31) en andere goedaardige pancreasaandoeningen (niet-PDAC, n = 9), waaronder pancreatitis (n = 2), papillaire-ampulltumoren (n = 4), neuro-endocriene tumoren (n = 2), intraductale papillaire mucineuze neoplasie (IPMN; n = 1) 12. De pancreassapmonsters werden vervolgens onderworpen aan metabolomische analyse met behulp van nucleaire magnetische resonantie (1H-NMR)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we de techniek beschreven om intraoperatief pancreassap te verzamelen, een grotendeels onontgonnen vloeistofbiopsie. We hebben onlangs aangetoond dat pancreassap kan worden gebruikt als een bron van metabole markers van ziekte12. Metabolomische analyse op andere vloeibare biopten, zoals bloed 5,6,7, urine8 en speeksel9, hebben veelbelov...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Roberta Migliore voor de technische bijstand. Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) in het kader van het IG2016-ID.18443-project - P.I. Marchesi Federica. De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuitBD Biosciences309659
1.5 mL Eppendorf buisjeGreiner BioOneGR616201
20 µm nylon celstrainerpluriSelect43-50020-03
25G naaldBD Biosciences305122
3 mL K2EDTA vacutainerBD Biosciences366473
3 mL spuitBD Biosciences309656
50 mL Falcon buisjeCorning352098
KlemmenMedicon06.20.12
WegwerpsprietjeMedicom9000-10
Foetaal bovien serumMicrotechMG10432
Platte punttangMedicon06.00.10
Penicilline-StreptomycineLonzaECB3001D
Fosfaat-Gebufferde Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Protease inhibitor cocktailRoche34044100
RPMI mediumEurocloneECB9006L
SchaarMedicon02.04.09
Trypsine/EDTA 1xLonzaBE17-161F
Ultraglutamine 100xLonzaBE17-605E/U1

Referenties

  1. Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
  4. Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
  5. Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
  6. Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
  7. Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
  8. Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
  9. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  10. Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
  11. Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
  12. Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
  13. Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
  14. Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
  15. Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241(2008).
  16. Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
  17. Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
  18. Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
  19. Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
  20. Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
  21. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  22. Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217(2011).
  23. Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
  24. Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
  25. Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
  26. Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015(2016).
  27. Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
  28. Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
  29. Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
  30. Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
  31. Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
  32. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
  33. Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
  34. Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
  35. Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
  36. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  37. Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
  38. Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
  39. Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173(2013).
  40. Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
  41. Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
  42. Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
  43. Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115(2015).
  44. Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
  45. Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
  46. Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
  47. Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
  48. Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
  49. Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Alvlekliersapinterstiti le tumorvloeistofweefselcentrifugatieweefselelutiebiomarkerontdekkingmetabolomicanalysemicroRNA profileringmassaspectrometrieverwijdering van celresten

Gerelateerde artikelen