Methodenartikel

Groottebepaling en fenotypische analyse van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van flowcytometrie

DOI:

10.3791/61695

⸱

23 april 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine, uEV's, van gezonde menselijke donoren en hun fenotypische karakterisering door de grootte en expressie van oppervlaktemarkers met behulp van flowcytometrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes, EV's, zijn een heterogeen complex van lipide membranen, uitgescheiden door elk celtype, in elke vloeistof zoals urine. EV's kunnen verschillende groottes hebben, variërend van 40-100 nm in diameter, zoals in exosomen, tot 100-1000 nm in microblaasjes. Ze kunnen ook verschillende moleculen bevatten die kunnen worden gebruikt als biomarkers voor de prognose en diagnose van vele ziekten. Er zijn veel technieken ontwikkeld om deze blaasjes te karakteriseren. Een daarvan is flowcytometrie. Er zijn echter geen bestaande rapporten om aan te tonen hoe de concentratie van EV's kan worden gekwantificeerd en gedifferentieerd op basis van grootte, samen met de detectie van biomarkers. Dit werk heeft tot doel een procedure te beschrijven voor de isolatie, kwantificering en fenotypering van extracellulaire blaasjes in de urine, uEV's, met behulp van een conventionele cytometer voor de analyse zonder enige wijziging van de configuratie. De beperkingen van de methode omvatten het kleuren van maximaal vier verschillende biomarkers per monster. De methode wordt ook beperkt door de hoeveelheid EV's die beschikbaar zijn in de steekproef. Ondanks deze beperkingen kunnen we met dit protocol en de daaropvolgende analyse meer informatie verkrijgen over de verrijking van EV-markers en de overvloed van deze blaasjes die aanwezig zijn in urinemonsters, bij ziekten met nier- en hersenbeschadiging.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij zoogdieren wordt bloed gefilterd door 250 - 300 keer door de nieren te gaan; Gedurende deze tijd wordt urine gevormd. De productie van deze biovloeistof is het resultaat van een reeks processen, waaronder glomerulaire filtratie, tubulaire reabsorptie en secretie. Metabolische afvalproducten en elektrolyten zijn de belangrijkste componenten van urine. Ook andere bijproducten zoals peptiden, functionele eiwitten en extracellulaire blaasjes (EV's) worden uitgescheiden 1,2,3,4,5,6. Aanvankelijk werden extracellulaire blaasjes (uEV's) in urine geïdentificeerd in urinemonsters van patiënten die leden aan stoornissen in de waterbalans. Deze patiënten vertoonden de aanwezigheid van moleculen zoals aquaporine-2 (AQP2), dat vervolgens werd gebruikt als biomarker voor deze ziekte7. Verschillende daaropvolgende studies richtten zich op het identificeren van de cellulaire oorsprong van uEV's, waarbij werd beschreven dat deze structuren kunnen worden uitgescheiden door niercellen (glomerulus, podocyten, enz.) en andere celtypen van endotheel- of leukocytische lijnen. Bovendien kan het aantal en de molecuulverrijking in uEV's correleren met de status van veel ziekten en aandoeningen 8,9,10,11,12,13,14.

In totaal vormen EV's een zeer heterogene familie van deeltjes omsloten door lipidedubbellagen en door cellen via passieve of actieve mechanismen in verschillende vloeistoffen worden afgegeven. Afhankelijk van hun oorsprong kunnen EV's worden geclassificeerd als exosomen afkomstig van endosomen of van plasmamembranen afgeleide microblaasjes/microdeeltjes. Dit classificatiecriterium kan echter alleen worden toegepast wanneer de biogenese van de deeltjes direct wordt waargenomen. Daarom zijn andere niet-triviale criteria, waaronder fysische, biochemische en cellulaire oorsprong, onderschreven door verschillende onderzoekers in het veld 15,16,17. Afhankelijk van de aard van het geanalyseerde isolaat, werden verschillende analytische technieken voorgesteld voor de karakterisering van EV's. Op basis van de verrijking van grote (≥100 nm) of kleine (≤100 nm) EV's wordt bijvoorbeeld kwantificering via flowcytometrie of het volgen van nanodeeltjes voorgesteld, respectievelijk18.

Tegenwoordig is het gebruik van EV's als biomarkers voor veel ziekten relevant geworden, dus wordt er gezocht naar verschillende bronnen. Een van de meest veelbelovende bronnen is de urine, omdat deze op een gemakkelijke en niet-invasieve manier kan worden verkregen. Daarom beschrijft dit protocol een procedure voor de isolatie van uEV's door differentiële centrifugatie, verwerking met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen en stroomafwaartse analyse met behulp van een conventionele 2-lasers/4-kleuren cytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke urinemonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers die een door de donor geïnformeerde toestemming hadden ondertekend. Deze procedures werden ook goedgekeurd door het Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán Research Ethics Committee.

1. Isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine

OPMERKING: Het isolatieprotocol van uEV's is gewijzigd ten opzichte van ref.19. Figuur 1 toont de weergave van het protocol om uEV's te isoleren.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de uEVs-isolatie voor flowcytometrie-analyse. In dit protocol centrifugeer je eerst de eerste urine van de dag om de cellen en het vuil te verwijderen. Centrifugeer vervolgens om de grote blaasjes te verwijderen met een behandeling om het THP-eiwit te verwijderen en voer ten slotte ultracentrifugatie uit om de uEV's te verrijken en te verkrijgen met een enkele wasbeurt. Stappen om urinefracties te bewaren voor de WB-validatie zijn gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Gebruik de eerste ochtendurine (15 ml) van gezonde vrijwilligers. Centrifugeer de urine bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om alle cellen en vuil te verwijderen.
    OPMERKING: Gebruik bij voorkeur verse urine; indien niet beschikbaar, gebruik dan urine die maximaal 3 maanden bij -20 °C is bewaard of maximaal 6 maanden bij -70 °C is bewaard. Ontdooi het urinemonster op ijs en draai het krachtig. Voer alle procedures uit op ijs of bij 4 °C. Een optionele stap voor Western blot-analyse is het maken van een duplicaat van een buisje en aliquoot 200 μL van de urine in de eerste ochtend in een apart buisje. Bewaar het monster tot gebruik bij -20 °C en label het als "volle urine", om te controleren op markers van extracellulaire blaasjes.
  2. Breng het in stap 1.1 verkregen bovenstaande over in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 45 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C. Breng het bovenstaande over in een ultracentrifugatiebuis van 8 ml polycarbonaat en bewaar dit op ijs.
    OPMERKING: Optioneel wordt 200 μl van het bovenstaande verkregen in stap 1.1 in een afzonderlijk buisje met het label "urine zonder cellen" voor Western blot-analyse.
    1. Verwijdering van Tamm-Horsfall-eiwit, THP
      OPMERKING: THP is aanwezig in de urine en wordt verrijkt wanneer een persoon een nieraandoening heeft. Er is gemeld dat THP de opbrengst van uEV's vermindert omdat het zich kan binden aan uEV's. Om dit eiwit te verwijderen, is het gebruik van een reductiemiddel nodig 3,6.
      1. Bereid de isolatieoplossing voor door 250 mM sacharose te mengen met 10 mM triethanolamine. Stel de pH in op 7,6.
      2. Meng de in stap 1.2 verkregen pellet met 500 μl isolatieoplossing en voeg vervolgens 5 μl β-mercaptoethanol toe.
      3. Incubeer het pelletmengsel gedurende 10 minuten bij 37 °C en vortex om de 2 minuten. Voeg 500 μl isolatieoplossing toe en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 17.000 x g bij 37 °C. Verzamel het verkregen supernatans (met gereduceerde-niet-geaggregeerde THP plus uEV's).
  3. Meng beide gereserveerde supernatanten (uit de stappen 1.2 en 1.2.1.3) in dezelfde ultracentrifugatiebuis van 8 ml polycarbonaat en centrifugeer vervolgens gedurende 70 minuten bij 4 °C bij 160.000 x g met behulp van een ultracentrifugerotor met vaste hoek.
    OPMERKING: Optioneel, voor de analyse van Western blot, slaat u 200 μL van het hierboven verkregen supernatans op en labelt u het als "supernatant zonder EV's". Dit monster zal dienen als negatieve controle bij het zoeken naar extracellulaire vesikel markers.
  4. Gooi het bovenstaande weg. Voeg ijskoude 1x PBS toe aan de 8 ml polycarbonaat buis en centrifugeer bij 160.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de pellet niet weggooit, aangezien deze de uEV's bevat. De 1x PBS moet worden gesteriliseerd en gefilterd met een poriënspuitfilter van minimaal 0,22 μm.
  5. Gooi het bovenstaande weg. Voeg de rest van het bovenstaande toe aan de polycarbonaatbuis van 8 ml en centrifugeer gedurende 70 minuten bij 160.000 x g bij 4 °C.
  6. Gooi het bovenstaande weg en voeg 8 ml ijskoude PBS toe aan de pellet om de uEV's te wassen.
  7. Gooi het bovenstaande weg. Laat de pellet drogen en suspendeer deze vervolgens opnieuw met 1 ml ijskoude PBS. Bewaren bij -70 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Als u een Western blot-analyse uitvoert, suspendeer dan de pellet van de dubbele buis met 50 μL RIPA-buffer plus proteaseremmers. Bewaren bij -20 °C tot gebruik.

2. Vlekken van uEV's

OPMERKING: Alvorens uEV's te kleuren en te analyseren, is het essentieel om ten minste één methodologie uit te voeren die wordt aanbevolen door MISEV201818 om de juiste isolatie van uEV's te verifiëren; hier wordt de analyse van de westerse vlek afgebeeld. Figuur 2 toont een representatief protocol voor uEVs-kleuring.

figure-protocol-2
Figuur 2: Overzicht van de uEV's die kleuren en opvangen in de cytometer. (A) Weergave van de uEV-kleuring. Gedurende 500.000 uEV's werd het antilichaam gemengd en gedurende 12 uur bij 4 °C geïncubeerd. Vervolgens werd CFSE toegevoegd en gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De uEV's hadden de CFSE aan de binnenkant en het antilichaam zal zich binden aan het oppervlak van het antigeen. 400 μL koude PBS werd gebruikt om 100 μL van het monster met lage snelheid in de flowcytometer te resustribueren en op te vangen. (B) Analyse strategie. De eerste puntplot (SSC-H VERSUS FL-X) toont de negatieve controle voor uEV's, gevolgd door de puntplot die uEV's toont die kleuring met CFSE tonen, en ten slotte een histogram met de antilichaamkleuring van uEV's (zwarte lijn), de negatieve controle wordt weergegeven in de grijze lijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereken het relatieve aantal uEV's door het eiwitgehalte te kwantificeren met behulp van een conventionele colorimetrische eiwittest, zoals vermeld in de materiaaltabel. Voer een 1:5 verdunning van de uEV's uit en volg de instructies van het gegevensblad in de analyse-eiwitkit.
  2. Op basis van een eerder gerapporteerde formule20, beschouw 1 μg/ml uEVs-eiwit als gelijk aan 800.000 uEVs/μL. Zorg ervoor dat er 500.000 uEV's aanwezig zijn in 20 μL ijskoude PBS.
  3. Label de buisjes zoals aangegeven in tabel 1.
    OPMERKING: Het aantal gebruikte buizen is afhankelijk van het aantal gebruikte antilichamen, de beperking voor 2-lasers/4 kleuren cytometer is een maximum van 4 antilichamen per buis die kunnen worden gebruikt; daarom konden alleen FL1, FL2, FL3 en FL4 in de cytometer worden afgelezen, hoewel compensatie nodig is. Gebruik voor deze procedures microcentrifugebuisjes van 1,5 ml of buisjes van 5 ml met ronde bodem voor flowcytometrie. De benodigde buizen zijn weergegeven in Tabel 1. Buisjes 4 en 5 bestaan uit een cocktail van alle antilichamen die in dit protocol gebruikt moeten worden. Als voorbeeld worden twee probleembuizen (8 en 9) gegeven; Daarom moet deze set bedieningselementen de combinatie hebben die in elke buis moet worden gebruikt.
Buis 1.Megamix FSC kralen
Buis 2.PBS
Buis 3.PBS met CFSE
Buis 4.PBS met alle antilichamen van probleem 1
Buis 5.PBS met alle antilichamen van probleem 2
Buis 6.Autofluorescentie-regelinguEV's zonder enig reagens, alleen in PBS.
Buis 7.#uEVsuEV's met CFSE
Buis 8.Probleem 1uEV's met CD37 FITC, CD53 PE, ADAM10 APC
Buis 9.Probleem 2uEV's met CD9 FITC, TSPAN33 APC

Tabel 1: Etikettering van buizen. Voorbeeld dat laat zien hoe de buizen moeten worden geëtiketteerd. De eerste buizen zijn alle benodigde besturingen. De buisjes met de antilichamen-fluorochromen zijn afhankelijk van de kleuring.

  1. Voeg 20 μL PBS met 500.000 uEV's toe aan de gelabelde buisjes.
  2. Voeg de antilichamen toe zoals aangegeven in tabel 1, eerder getitreerd. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Vóór het kleuren wordt aanbevolen om de antilichamen minimaal 5 minuten bij 4 °C op volle snelheid te centrifugeren om de aggregaten te voorkomen. De antilichamen die hier worden gebruikt, zijn een voorbeeld van eiwitten die aanwezig zijn in de uEV's en behoren tot een onafhankelijk manuscript dat momenteel in voorbereiding is.
  3. Voeg 0,4 μL carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) [5 nM] toe aan buisje nummer 3. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: CFSE is een kleurstof die wordt gebruikt om alle EV's in een monster te kleuren en onderscheid te maken tussen het achtergrondgeluid wanneer een flowcytometeranalyse wordt uitgevoerd. Zie de sectie Discussie voor meer informatie.
  4. Voeg 400 μL ijskoude 1x PBS toe aan alle buisjes.
  5. Houd alle buisjes op 4 °C.

3. Verwerving van uEV's met behulp van een conventionele cytometer

NOTITIE: Instructies voor het gebruik van de flowcytometer (zie materiaaltabel) worden hier beschreven.

  1. Voer de kwaliteitskalibratie van de cytometer uit met behulp van de 6- en 8-pieken.
    OPMERKING: De %CV van de laatste piek moet een waarde onder de 6 zijn; De cytometertechnicus zorgt hiervoor.
  2. Open de flowcytometersoftware.
    OPMERKING: Zodra de software is geopend, wordt een nieuw experiment geopend, met een screening met een sjabloon voor 96 monsters, de parameters voor het uitvoeren en een "lege" sectie om puntdiagrammen of histogrammen te maken.
  3. Pas de parameters aan op het scherm van de software die wordt uitgevoerd: 100 μL monster om vast te leggen, langzaam draaiend, stel de drempel in op 10.000 op FSC-H en 2.000 op SSC-H.
    OPMERKING: De hier aanbevolen drempel is een voorbeeld; Het is vereist om de drempel in te stellen op basis van de geanalyseerde monsters.
  4. Laadbuis nummer 1 (Megamix buis), zoals aangegeven in Tabel 1. Leg de kralen vast. Maak twee puntplots in het "lege" deel van het softwarescherm door op de optie Dot Plot te klikken. Maak als paneel A en B van de figuur 3.
    OPMERKING: De Megamix fluorescerende kralen (kralen die worden gebruikt om de groottes van 0.1, 0.3, 0.5 en 0.9 μm af te bakenen en de sjabloon voor maten te maken), kunnen worden geanalyseerd met behulp van de FL1 (FITC) detector. Alle puntdiagrammen en histogrammen moeten worden weergegeven in hoogtewaarden. Neem zoveel mogelijk gebeurtenissen op; Eventuele wijzigingen in het werkblad hebben geen invloed op de gegevens.

figure-protocol-3
Figuur 3: Megamix FSC kralen dot plots. De getoonde puntdiagrammen werden gegenereerd met behulp van de flowcytometersoftware; In de flowcytometer zal het beeld erg op elkaar lijken. (A) De eerste puntplot die wordt gegenereerd om de kralen te selecteren, waarbij het achtergrondgeluid wordt vermeden. (SSC-H VERSUS FL1-H). (B) De puntplot die wordt gegenereerd door de selectie van de vorige poort, die de verschillende maten van de kralen aangeeft. (SSC-H VERSUS FSC-H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Maak in het gedeelte "lege" van het softwarescherm een puntplot en histogram voor elk gebruikt fluorochroom; gebruik het algoritme in aanvullende figuur 1 als voorbeeld. Om dit te doen, klikt u op de optie Dot Plot of Histogram voor elk fluorochroom.
    OPMERKING: Achtergrondgeluid zal altijd aanwezig zijn, zoals weergegeven in Afbeelding 3A. Alle stippen tussen 0 en 1.000 van FL1 (x-as) bevinden zich buiten de gemaakte poort. Daarom is het essentieel om alle controlebuizen te gebruiken om voldoende resultaten te verkrijgen. Spoel tussen elke slanglading de omhulselvloeistof terug en voer een ontstopcyclus uit. Schud elke buis voorzichtig voordat u deze laadt. Na het laden van vijf opeenvolgende buisjes, laat u 1x 100 μL PBS draaien.
  2. Laadbuizen nummer 2 en 5, om de afkapwaarden (negatief) in te stellen. Selecteer hiervoor het pictogram Rechthoekige poort (onder de gemaakte puntplot) of het pictogram Lijnpoort (onder het gemaakte histogram); en plaats het op een plaats waar er geen signaal is, om puntdiagrammen en histogrammen te verkrijgen zoals die worden getoond in aanvullende figuur 1.
    OPMERKING: Al deze buizen vereisen de plaatsing van het positieve gebied niet verder dan 0.70% omdat er niet meer dan 103 (1,500) "fluorescentie" zal zijn. Als er een fluorescentie is die verder is dan dit gebied, verdun dan de gebruikte reagentia. Daarom is het belangrijk om de reagentia te titeren vóór de definitieve metingen.
  3. Laadbuis nummer 6 (autofluorescentiebuis), om de negatieve gebieden voor het monster in te stellen. Selecteer hiervoor het pictogram Rechthoekige poort (onder de gemaakte puntplot) of het pictogram Lijnpoort (onder het gemaakte histogram); Plaats het op een plek waar er geen signaal is.
  4. Laad de volgende buizen (buizen 7 t/m 9, weergegeven in tabel 1).
  5. Sla het experiment op.
    OPMERKING: Voor de cytometersoftware die hier wordt gebruikt, verwijst het commando Experiment opslaan naar het opslaan van de gegenereerde gegevens. Met andere woorden, alle buisjes die door de flowcytometer worden verkregen en de gegevens die voor elke buis worden gegenereerd, moeten worden opgeslagen. Om dit te doen, is het noodzakelijk om op de knop Experiment opslaan te klikken.
  6. Exporteer gegevens als FSC-bestanden.

4. Analyse van de gegevens met een flowcytometersoftware.

OPMERKING: Instructies voor het gebruik van de flowcytometersoftware die wordt weergegeven in de materiaaltabel, worden in dit hoofdstuk beschreven. Afbeelding 4 toont de werkruimte met de stappen om de groottepoorten te maken.

figure-protocol-4
Afbeelding 4: Werkruimte met alle stappen om de analyse van de gegevens te starten. Alle afbeeldingen zijn gegenereerd door zeefdruk van de werkruimte. (A) Werkruimte gegenereerd met de toegevoegde monstergegevens (links), puntplot gegenereerd door de selectie van de buis 1, FSC-kralen, (rechts). (B,C) tonen de wijziging van de as, om SSC-H en FSC-H te hebben. (D-F) tonen stap-voor-stap aanpassing van beide assen. (G-I) tonen de selectie en generatie van de verschillende kraalmaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Open de flowcytometersoftware. Voeg de voorbeelden toe door op de knop Voorbeelden toevoegen te klikken en selecteer de geëxporteerde FCS-bestanden.
  2. Klik op de Megamix-buis om een puntdiagram SSC-H (y-as) VS FSC-H (x-as) te openen. Pas beide assen aan om 0 tot 100.000 weer te geven door op de T-knop te klikken (Gegevensweergave transformeren), klik op As aanpassen, klik op SSC-H of FSSC-H en verander de schaalwaarde in min 0 en max 100.000 (zie afbeelding 4AF).
  3. Stel de poorten in op 0,1, 0,3, 0,5 en 0,9 μm in de puntplot die in stap 4.2 is gegenereerd. Selecteer de knop Rechthoekige poort om een poort te maken zoals weergegeven in Afbeelding 4G-I.
    OPMERKING: Afbeelding 5 toont de werkruimte met de stappen om de positieve gebieden te maken en om de gemiddelde intensiteit voor het fluorchroom te verkrijgen.

figure-protocol-5
Figuur 5: Werkruimte om de verkregen gegevens te analyseren. Alle afbeeldingen zijn gegenereerd door de zeefdruk van de werkruimte. (A) Werkruimte die is gegenereerd met de groottepoort toegepast op alle steekproeven. (B) Autofluorescentiebuis geselecteerd, puntdiagram met de groottepoort en het histogram voor een geselecteerde grootte (0.1 μm), gebruik dit histogram om de positieve poort voor elk fluorchroom en elke grootte te verkrijgen. (C) Werkruimte gegenereerd met de positieve poorten voor elk fluorchroom en elke grootte. (D) Werkruimte (links) en Lay-outeditor (rechts) gegenereerd voor de voorbeelden. In de lay-outeditor wordt het histogram voor de autofluorescentiebuis en de positieve buis voor FL1-H weergegeven, en hoe u het eigenschappenpaneel kunt verkrijgen om ze te wijzigen. (E) De afbeelding laat zien hoe de fluorescentiewaarde met gemiddelde intensiteit kan worden verkregen. (F) Histogrammen gegenereerd voor drie verschillende fluorochromen, met alle wijzigingen die de software toestaat om te doen met de statistische informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Pas de gegenereerde poorten (0,1, 0,3, 0,5 en 0,9 μm) toe op alle monsters. Selecteer de poorten, sleep en zet neer in de optie Alle monsters , zoals weergegeven in afbeelding 5A.
  2. Klik op de Autofluorescentie-buis. Stel de positieve gebieden in voor elk fluorchroom, voor elke grootte. Open de dot plot SSC-H VS FSC-H met de grootte poorten, klik op Single Gate Size. Klik in het nieuwe venster op de y-as om de histogramoptie te selecteren. Selecteer op de x-as FL1-H en selecteer vervolgens het pictogram Bereik om het positieve gebied te maken. Herhaal de handeling voor FL2-H en FL4-H (zie afbeelding 5B).
  3. Pas de poorten toe op alle monsters. Selecteer Poorten, sleep en zet neer in de optie Alle monsters , zoals weergegeven in afbeelding 5C.
  4. Open de lay-outeditor.
  5. Sleep elk voorbeeld in de editor. Selecteer de grootte van de "autofluorescentie"-buis, sleep en zet neer en selecteer vervolgens dezelfde maat van de bevlekte buis, sleep en zet neer.
  6. Klik rechtsonder op het histogram. Open het menu Eigenschappen . Klik op Legenda. Tel de gemiddelde intensiteit voor het fluorchroom bij elkaar op.
    OPMERKING: In Eigenschappen zijn er andere hulpmiddelen beschikbaar om het uiterlijk van het histogram te wijzigen.
  7. Herhaal dezelfde procedure voor de resterende fluorochromen en formaten.

5. Analyse om het aantal uEV's per monster te verkrijgen.

OPMERKING: Figuur 6 toont de werkruimte met de stappen om het aantal uEV's per monster te verkrijgen.

figure-protocol-6
Figuur 6: Werkruimte om de CFSE-buis te analyseren. Alle afbeeldingen zijn gegenereerd door zeefdruk van de werkruimte. (A) Werkruimte gegenereerd door de selectie van alle groottes regio, uEV's totaal (links), puntdiagram met de geselecteerde poort (rechts). (B) Dot plot SSC-H VS FL1-H voor CFSE-negatief gebied in de autofluorescentiebuis. (C) Dot plot SSC-H VS FL1-H voor CFSE in de kleurbuis. (D) Afbeelding van de tabel verkregen met de statistieken van de CFSE-kleuring, met het aantal uEV's in de steekproef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Klik op Autofluorescentie buis. Maak in de dot plot SSC-H VS FSC-H met de groottepoorten een gebied met alle maten. Klik op Nieuwe regio. Stel het positieve gebied in (zie afbeelding 6A,B).
  2. Pas de poorten toe op alle monsters. Selecteer de poorten, sleep en zet neer in de optie Alle voorbeelden .
  3. Klik op CFSE + uEVs buis. Open het nieuwe gebied en controleer het positieve gebied voor CFSE (FL1-H), zoals weergegeven in Figuur 6C.
  4. Kopieer in de werkruimte in Figuur 6D de # cellengegevens voor de buis. Dit getal is de #uEVs die wordt verkregen door flowcytometrie (#uEVs FC).
  5. Pas de volgende formule toe om het aantal uEV's per microliter te berekenen:
    figure-protocol-7
  6. Als u de #uEVs per microliter voor elk fluorochroom (#uEVs/μL FLX) wilt hebben, kopieert u in de werkruimte de statistieken voor de FLX-H-subset, dit getal is het percentage (%FLX-subset).
  7. Pas de volgende formule toe om het aantal uEV's per microliter voor elk fluorchroom te berekenen.
    figure-protocol-8
    OPMERKING: Afhankelijk van of de geselecteerde poort voor één formaat of voor alle uEV's is, controleert u de geselecteerde gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende controlepunten via het protocol en vóór de kleuring van uEV's. Daarom is het essentieel om eerst de hoeveelheid eiwit in het extract van uEV's te verifiëren. Alle onderzoeksgroepen die met extracellulaire blaasjes werken, kwantificeren het eiwit, zoals aangegeven in stap 2.1. Aanvullende figuur 2 toont een representatieve plaat met 96 putjes met de uEVs-fractie in putjes 4E, 5E en 6E. Putten 1A, 2A en 3A bestaan uit blanco's, maar als er geen uEV's ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tegenwoordig is het gebruik van extracellulaire blaasjes als biomarkers voor verschillende ziekten toegenomen, vooral voor ziekten die kunnen worden geïsoleerd uit niet-invasieve bronnen zoals urine 5,21,22,23,24. Het is bewezen dat de isolatie van uEV's een essentiële hulpbron is om de status van een gezond individu te kennen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige financiële of commerciële relatie die zou kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van CONACyT (A3-S-36875) en het UNAM-DGAPA-PAPIIT-programma (IN213020 en IA202318). NH-I werd ondersteund door fellowship 587790 van CONACyT.

De auteurs willen Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr en Diana Gómez-Martin bedanken voor hun waardevolle advies voor de realisatie van dit protocol, en aan alle gezonde individuen voor hun urinemonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APC anti human CD156c (ADAM10) antibodyBioLegend352706Voeg 5 µL toe aan de 20 µL van uEVs in PBS
APC anti human TSPAN33 (BAAM) antibodyBioLegend395406Voeg 5 µL toe aan de 20 µL van uEVs in PBS
Avanti centrifuge met JA-25.5O vaste hoek rotorBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 Flow CytometerBD Biosciences
β-mercaptoethanolSIGMA-AldrichM3148
Benchtop centrifuge met A-4-44 rotorEppendorf5804
BLUEstain 2 proteïne ladderGOLDBIOP008
CD9 (C-4) muis monoklonaal antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-13118
CD63 (MX-49.129.5) muis monoklonaal antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-5275
Cell Trace CFSE celproliferatie kit voor flow cytometryThermo ScientificC34554
Chemidoc XRS+ systeemBIORAD5837
FITC anti human CD9 antilichaamBioLegend312104Voeg 5 µL toe aan de 20 µL van uEVs in PBS
FITC anti human CD37 antilichaamBioLegend356304Voeg 5 µL toe aan de 20 µL van uEVs in PBS
Fluorescente gele deeltjesSpherotechFP-0252-2
Fluorescente gele deeltjesSpherotechFP-0552-2
Fluorescente gele deeltjesSpherotechFP-1552-2
FlowJo SoftwareBecton, Dickinson and Company
Gezegerd anti-muis immunoglobulinen/HRPDakoP0447
Halt protease inhibitor cocktailThermo Scientific78429
Immun-Blot PVDF membraan 0.22µmBIORAD1620177
Megamix-Plus FSC kralenCOSMO BIO CO.LTD7802
NuPAGE LDS sample buffer 4XThermo ScientificNP0007
Optima ultracentrifuge met rotor 90Ti vaste hoek 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Blue proteïne kleuring oplossingThermo Scientific24620
PE anti human CD53 antilichaamBioLegend325406Voeg 5 µL toe aan de 20 µL van uEVs in PBS
Pierce BCA Protein assay kitThermo Scientific23227
Pierce RIPA bufferThermo Scientific89900
Polycarbonaat dikwandige centrifuge buizenBeckamn Coulter355630
Spherotech 8-Peak validatie kralen (FL1-FL3)BD Accuri653144
Spherotech 6-Peak validatie kralen (FL4)BD Accuri653145
SucroseSIGMA-Aldrich59378
TriethanolamineSIGMA-Aldrich90279

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  2. Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11 (12), 688-701 (2014).
  3. Pisitkun, T., Johnstone, R., Knepper, M. A. Discovery of urinary biomarkers. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1760-1771 (2006).
  4. Urinology Think Tank Writing Group. Urine: Waste product or biologically active tissue. Neurourology and Urodynamics. 37 (3), 1162-1168 (2018).
  5. Wang, S., Kojima, K., Mobley, J. A., West, A. B. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 45, 351-361 (2019).
  6. Merchant, M. L., Rood, I. M., Deegens, J. K. J., Klein, J. B. Isolation and characterization of urinary extracellular vesicles: implications for biomarker discovery. International Urology and Nephrology. 13 (12), 731-749 (2017).
  7. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  8. Jing, H., et al. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).
  9. Liu, X., et al. Tubule-derived exosomes play a central role in fibroblast activation and kidney fibrosis. Kidney International. 97 (6), 1181-1195 (2020).
  10. Quaglia, M., et al. Extracellular Vesicles as Mediators of Cellular Crosstalk Between Immune System and Kidney Graft. Frontiers in Immunology. 11, 74(2020).
  11. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Review of Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  12. Street, J. M., Koritzinsky, E. H., Glispie, D. M., Star, R. A., Yuen, P. S. Urine Exosomes: An Emerging Trove of Biomarkers. Advances in Clinical Chemistry. 78, 103-122 (2017).
  13. Thongboonkerd, V. Roles for Exosome in Various Kidney Diseases and Disorders. Frontiers in Pharmacology. 10, 1655(2019).
  14. Watanabe, Y., et al. Molecular Network Analysis of the Urinary Proteome of Alzheimer's Disease Patients. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders Extra. 9 (1), 53-65 (2019).
  15. Jadli, A. S., Ballasy, N., Edalat, P., Patel, V. B. Inside(sight) of tiny communicator: exosome biogenesis, secretion, and uptake. Molecular and Cellular Biochemistry. 467 (1-2), 77-94 (2020).
  16. Svenningsen, P., Sabaratnam, R., Jensen, B. L. Urinary extracellular vesicles: Origin, role as intercellular messengers and biomarkers; efficient sorting and potential treatment options. Acta Physiologica. 228 (1), 13346(2020).
  17. Witwer, K. W., Thery, C. Extracellular vesicles or exosomes? On primacy, precision, and popularity influencing a choice of nomenclature. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1648167(2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Perez-Hernandez, J., et al. Increased Urinary Exosomal MicroRNAs in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. PLoS One. 10 (9), 0138618(2015).
  20. Freyssinet, J. M., Toti, F. Membrane microparticle determination: at least seeing what's being sized. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 311-314 (2010).
  21. D'Anca, M., et al. Exosome Determinants of Physiological Aging and Age-Related Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, 232(2019).
  22. Lawson, C., Vicencio, J. M., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Microvesicles and exosomes: new players in metabolic and cardiovascular disease. Journal of Endocrinology. 228 (2), 57-71 (2016).
  23. Lee, S., Mankhong, S., Kang, J. H. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  24. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  25. Hoorn, E. J., et al. Prospects for urinary proteomics: exosomes as a source of urinary biomarkers. Nephrology (Carlton). 10 (3), 283-290 (2005).
  26. Ranghino, A., Dimuccio, V., Papadimitriou, E., Bussolati, B. Extracellular vesicles in the urine: markers and mediators of tissue damage and regeneration. Clinical Kidney Journal. 8 (1), 23-30 (2015).
  27. Zhang, W., et al. Extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), 844-851 (2016).
  28. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney International. 77 (8), 736-742 (2010).
  29. Royo, F., et al. Different EV enrichment methods suitable for clinical settings yield different subpopulations of urinary extracellular vesicles from human samples. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 29497(2016).
  30. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978(2016).
  31. Lv, C. Y., et al. A PEG-based method for the isolation of urinary exosomes and its application in renal fibrosis diagnostics using cargo miR-29c and miR-21 analysis. International Urology and Nephrology. 50 (5), 973-982 (2018).
  32. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  33. Wang, D., Sun, W. Urinary extracellular microvesicles: isolation methods and prospects for urinary proteome. Proteomics. 14 (16), 1922-1932 (2014).
  34. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  35. van der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  36. Huyan, T., Du, Y., Huang, Q., Huang, Q., Li, Q. Uptake Characterization of Tumor Cell-derived Exosomes by Natural Killer Cells. Iranian Journal of Public Health. 47 (6), 803-813 (2018).
  37. Puzar Dominkus, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  38. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1878(2017).
  39. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Urinary Extracellular VesiclesFlow CytometryEV Size DeterminationPhenotypic AnalysisEV IsolationBiomarker DetectionEV QuantificationConventional CytometerKidney DiseaseBrain Damage
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen