Methodenartikel

Ecotoxicologische effecten van microplastics op de ontwikkeling van vogelembryo's door uit te broeden zonder eierschaal

DOI:

10.3791/61696

⸱

14 augustus 2021

 ,  ,  ,  , 
1Xinjiang Key Laboratory of Environmental Pollution and Bioremediation, Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Key Laboratory of Microbial Technology for Industrial Pollution Control of Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel introduceert een methode om uit te broeden zonder een eierschaal te gebruiken voor toxicologisch onderzoek van deeltjesverontreinigende stoffen zoals microplastics.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microplastics zijn een opkomende wereldwijde verontreinigende stof die een grote bedreiging vormt voor de gezondheid van dieren als gevolg van hun opname en translocatie in dierlijke weefsels en organen. Ecotoxicologische effecten van microplastics op de ontwikkeling van vogelembryo's zijn niet bekend. Het vogelei is een compleet ontwikkelings- en voedingssysteem en de hele embryo-ontwikkeling vindt plaats in de eierschaal. Daarom wordt een direct verslag van de ontwikkeling van vogelembryo's onder de stress van verontreinigende stoffen zoals microplastics sterk beperkt door de ondoorzichtige eierschaal in traditionele arcering. In deze studie werden de effecten van microplastics op de ontwikkeling van kwartelembryo's visueel gemonitord door uit te broeden zonder eierschaal. De belangrijkste stappen omvatten het reinigen en desinfecteren van bevruchte eieren, de incubatie vóór blootstelling, de incubatie op korte termijn na blootstelling en de monsterextractie. De resultaten tonen aan dat in vergelijking met de controlegroep het natte gewicht en de lichaamslengte van de aan microplastics blootgestelde groep een statistisch verschil vertoonden en het leveraandeel van de hele blootgestelde groep aanzienlijk steeg. Daarnaast evalueerden we externe factoren die de incubatie beïnvloeden: temperatuur, vochtigheid, eirotatiehoek en andere omstandigheden. Deze experimentele methode biedt waardevolle informatie over de ecotoxicologie van microplastics en een nieuwe manier om de nadelige effecten van verontreinigende stoffen op de ontwikkeling van embryo's te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van plastic afval was ongeveer 6300 Mt in 2015, waarvan een tiende werd gerecycled, en de rest werd ondergronds verbrand of begraven. Naar schatting zou tegen 2050 ongeveer 12.000 mt plastic afval ondergronds worden begraven1. Met de aandacht van de internationale gemeenschap voor plastic afval stelde Thompson in 2004 voor het eerst het concept van microplasticsvoor 2. Microplastics (Parlementsleden) verwijzen naar kleine deeltjesplastics met een deeltjesdiameter van minder dan 5 mm. Op dit moment hebben onderzoekers de alomtegenwoordige aanwezigheid van parlementsleden ontdekt in de kustlijn van verschillende continenten, de Atlantische eilanden, binnenmeren, het Noordpoolgebied en diepzeehabitats3,4,5,6,7. Daarom zijn meer onderzoekers begonnen met het bestuderen van de milieurisico's van parlementsleden.

Organismen kunnen parlementsleden in het milieu opnemen. Parlementsleden werden gevonden in het spijsverteringskanaal van 233 mariene organismen wereldwijd (waaronder 100% schildpadsoorten, 36% zeehondensoorten, 59% walvissoorten, 59% zeevogelsoorten, 92 soorten zeevissen en 6 soorten ongewervelden)8. Bovendien kunnen parlementsleden het spijsverteringsstelsel van de organismen blokkeren, zich ophopen en migreren in hun bobies9. Het is gebleken dat parlementsleden via de voedselketen kunnen worden overgedragen en hun inname verschilt met de veranderingen van habitat, groeifase, voedingsgewoonten en voedselbronnen10. Sommige onderzoekers meldden het bestaan van parlementsleden in de uitwerpselen van zeevogels11, wat betekent dat zeevogels fungeren als drager van parlementsleden. Bovendien kan de inname van parlementsleden de gezondheid van sommige organismen beïnvloeden. Parlementsleden kunnen bijvoorbeeld verstrikt raken in het maagdarmkanaal, waardoor de mortaliteit van walvisachtigentoeneemt 12.

Parlementsleden alleen hebben toxische effecten op organismen en gezamenlijke toxische effecten op organismen met andere verontreinigende stoffen. Inname van milieugerelateerde concentraties van plastic afval kan de endocriene systeemfunctie van volwassen vissen verstoren13. De grootte van microplastics is een van de belangrijke factoren die van invloed zijn op hun opname en accumulatie door organismen14,15. De kleine kunststoffen, met name de nanosize kunststoffen, zijn gevoelig voor interactie met cellen en organismen met hoge toxiciteit16,17,18,19. Hoewel de schadelijke effecten van microplastics met nanodeeltjesgrootte op organismen het huidige onderzoeksniveau overschrijden, is de detectie en kwantificering van microplastics met een grootte van minder dan enkele micrometers, met name de submicron/nanoplastics in het milieu, nog steeds een grote uitdaging. Daarnaast hebben nanoplastics ook enkele effecten op embryo's. Polystyreen kan de ontwikkeling van zee-egelsembryo's beschadigen door eiwit- en genprofielen te reguleren20.

Om de mogelijke impact van parlementsleden op organismen te onderzoeken, hebben we deze studie uitgevoerd. Vanwege de gelijkenis tussen vogelembryo's en menselijke embryo's worden ze meestal gebruikt in ontwikkelingsbiologieonderzoek21, waaronder angiogenese en antiangiogenese, weefseltechnologie, biomateriaalimplantaat en hersentumoren22,23,24. De embryo's van de vogel hebben de voordelen van lage kosten, een korte cultuurcyclus en gemakkelijke verrichting25,26. Daarom kozen we kwarteleibryo's met een korte groeicyclus als proefdier in deze studie. Tegelijkertijd kunnen we de morfologische veranderingen van kwartelpembryo's die tijdens de embryonale ontwikkelingsfase aan parlementsleden zijn blootgesteld, direct waarnemen met behulp van een eierschaalvrije broedtechnologie. De gebruikte experimentele materialen waren polypropyleen (PP) en polystyreen (PS). Omdat PP en PS27 het grootste deel van de polymeertypen vertegenwoordigen die wereldwijd in sedimenten en waterlichamen worden verkregen, zijn de meest voorkomende polymeertypen die worden gewonnen uit gevangen mariene organismen ethyleen en propyleen28. Dit experimentele protocol beschrijft het hele proces voor visuele evaluatie van toxicologische effecten van parlementsleden op kwartelembryo's die aan parlementsleden zijn blootgesteld. We kunnen deze methode gemakkelijk uitbreiden om de toxiciteit van andere verontreinigende stoffen voor de embryoontwikkeling van andereovipareuze dieren te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding vóór blootstelling

  1. Selecteer bevruchte kwarteleitjes die op dezelfde dag zijn geboren voor de blootstellingstest.
  2. Selecteer kwarteleitjes met vergelijkbare gewichten. Elk bevrucht kwartelei is ongeveer 10-12 g.
  3. Reinig alle bevruchte kwarteleitjes volledig van externe uitwerpselen en ander vuil.
  4. Steriliseer elk voorgekomen bevrucht kwartelei en de te gebruiken eieren (Kies eieren met een vergelijkbare schaalvorm, vooral de punt van het ei) met een antibioticumoplossing (penicilline en streptomycine, 1:1000, kamertemperatuur). Steriliseer de incubator met 75% ethanol.
  5. Open de eieren met het stompe uiteinde van een tandboor, laat de eierschaal aan de punt voor verder gebruik. Voordat de bevruchte eieren worden overgedragen, wordt de inhoud van de eieren uitgestort. Dit is om het vocht van de eierschaal te houden. De openingsdiameter van het ei was ongeveer 3 cm.
    OPMERKING: Om de schade aan het kwarteleiembryo te verminderen, gebruikt u een tandboor om het stompe uiteinde van het ei te openen en de scheur zo glad mogelijk te maken.
  6. Plaats na sterilisatie de bevruchte kwarteleitjes gedurende 24-48 uur in een incubator van 38 °C met een luchtvochtigheid van 60%. Zorg ervoor dat het stompe uiteinde van het kwartelei naar boven is.
  7. Steriliseer tijdens de incubatie van bevruchte kwarteleitjes de gereedschappen die nodig zijn in de daaropvolgende experimenten in een sterilisatiepot. Deze gereedschappen omvatten plasticfolie, een bekerglas, steriel water, pipettips, chirurgische rechte schaar, pincet en een lepel.
    OPMERKING: Gebruik een film met een temperatuurtolerantie die hoog genoeg is om problemen met de sterilisatie op hoge temperatuur te voorkomen.

2. Het kwartelei uitbroeden zonder schaal

  1. Breng de voorgekomen bevruchte kwarteleitjes van de broedmachine naar een schone bank en leg ze plat op de container om ze ongeveer 1-2 minuten te stabiliseren.
  2. Gebruik een schaar (12,5 cm chirurgische rechte schaar) om een klein gaatje (diameter 3 mm) in de centrale as van de voorgekomen bevruchte kwarteleitjes te prikken en om 1-2 cm kleine opening te snijden. Breng het eiwit en de dooier van de bevruchte kwarteleitjes voorzichtig over op de gesneden eierschaal.
    OPMERKING: Wanneer u een kleine opening met een schaar snijdt, vermijd dan het aanraken van de dooier van kwarteleitjes.
  3. Voeg de regeloplossing (zonder parlementsleden) en de blootgestelde oplossing van verschillende massa's (0,1, 0,2 en 0,3 mg) microplastics met drie deeltjesgrootten (100, 200 en 500 nm) per pipet toe aan de eiinhoud. Voeg tegelijkertijd 1 druppel penicilline en 1 druppel streptomycine toe met een spuit van 1 ml.
  4. Bedek de opening van de eierschaal met de gesteriliseerde film (stap 1.6).
  5. Volgens stap 2.1-2.4, behandel alle bevruchte kwarteleitjes.
  6. Plaats de overgedragen kwarteleibryo's gedurende de noodzakelijke periode in de incubator van 38 °C met een luchtvochtigheid van 60%. Gebruik in dit experiment een eirotatiehoek van ±30°. Draai de eieren eens per uur.
    OPMERKING: De overdracht moet zo snel mogelijk zijn, wat in een vroeg stadium meer oefening vereist.

3. Monsterverzameling

  1. Verwijder na zeven dagen kweek goed ontwikkelde embryo's die met het blote oog zijn waargenomen uit de dooier en was met fosfaatbufferoplossing (PBS).
  2. Droog de overtollige oplossing buiten het gereinigde embryo met absorberend papier en weeg in een schone petrischaal.
  3. Open de hele borstholte, scheid de lever en het hart van de ingewanden met een naald-neustang en plaats deze onmiddellijk na het opruimen in centrifugebuizen van 1,5 ml.
  4. Noteer snel het gewicht op een elektronische balans en bereken de hepatosomatische index (HIS = levergewicht / lichaamsgewicht x 100). Meet de lengte van het borstbeen en lichaam.
  5. Evalueer op basis van de bovenstaande indicatoren het effect van parlementsleden op de embryonale ontwikkeling.
    OPMERKING: Embryokwaliteit verwijst hier naar de kwaliteit van dooierverwijdering.

4. Gegevensanalyse

  1. Rapporteer de experimentele gegevens in de vorm van gemiddelde ± standaardfout (SEM).
  2. Gebruik een enkele-factor analyse van variantie om de middelen van meerdere groepen monsters te vergelijken. De significante verschilwaarde was α = 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de analyse van experimentele gegevens vergeleken we nat gewicht, lichaamslengte, borstbeenlengte en de verandering van hepatosomatische index tussen de controlegroep en de 6 experimentele groepen, waarbij we de groei en ontwikkeling van de kwartelembryo's vanuit een macroperspectief meten en weerspiegelen. We ontdekten zes normale kwarteleibryo's in elke groep. Elk embryo bereikte het vereiste Hamburger en Hamilton (HH) stadium.

In figuur 1hebben we de voorge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document biedt een effectief experimenteel schema om de ontwikkeling van kwartelembryo's te evalueren door de basisontwikkelingsindexen te detecteren. Er zijn echter nog enkele beperkingen aan dit experiment.

Ten eerste is de mortaliteit van kwarteleibryo's in het latere stadium van het uitkomen hoger vanwege het schelploze uitkomen. Er zijn kunstmatig oncontroleerbare factoren zoals de vernietiging van de normale eiwitverhouding in het experimentele proces. We hebben de blootstellingstij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken. Alle auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk van dit artikel hadden kunnen beïnvloeden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door belangrijke onderzoeks- en ontwikkelingsprojecten in de autonome regio Xinjiang Uygur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Multi sample tissue grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.Tissuelyser-24Vermalen van grote plastic materialen tot kleine stukjes bij lage temperatuur
Elektronische weegschaalOHAUS corporationPR Series PrecisionGebaat voor wegen
Bevruchte kwarteleitjesGuangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.Kwarteleitjes voor het uitbroeden zonder schaal
Fluorescente polypropyleen deeltjesFoshan Juliang Optical Material Co., Ltd.Typen kunststoffen geselecteerd voor het experiment
IncubatorShandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.264 stuksBiedt een plek voor embryonale groei en ontwikkeling
Nanometer-schaal polystyreen microsferenXi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.100 nm, 200 nm, 500 nmTypen kunststoffen geselecteerd voor het experiment
Stalen liniaalDeli Group20 cmGebaat voor het meten van lengte
Verticaal verwarmde druksterilisatorShanghai Shenan Medical Instrument FactoryLDZM-80KCS-IIDe experimentele artikelen steriliseren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5(2017).
  2. Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
  3. Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
  4. Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
  5. Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
  6. Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
  7. Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R. Microplastic pollution in deep-sea sediments. Environmental Pollution. 182, 495-499 (2013).
  8. Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
  9. Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
  10. Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
  11. Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
  12. Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
  13. Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
  14. Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7(2017).
  15. Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
  16. Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
  17. Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13(2012).
  18. Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
  19. Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
  20. Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
  21. El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
  22. Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
  23. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  24. Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
  25. Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
  26. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  27. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
  28. Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microplastics EcotoxicologyBird Embryo DevelopmentHatching Without EggshellQuail Embryo ExposureEggshell Removal TechniqueIncubation Process MonitoringSample Extraction MethodTemperature Humidity ControlLiver Proportion AnalysisWet Weight Measurement

Gerelateerde artikelen