Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie

Samenvatting

Deze studie presenteert methodologieën om de pathomorfologische en moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan kikkererwten:Rhizoctonia bataticola-interactie. De blotting papier methode is nuttig om snel te bestuderen kikkererwten genotype reacties, terwijl de zieke pot-gebaseerde methode kan worden gebruikt om tegelijkertijd droogte en R. bataticola infectie en scherm voor tolerante genotypen op te leggen.

Samenvatting

Droge wortelrot (DRR) ziekte is een opkomende biotische stress bedreiging voor kikkererwten teelt over de hele wereld. Het wordt veroorzaakt door een door de bodem overgedragen schimmelpathogene ziekteverwekker Rhizoctonia bataticola. In de literatuur zijn uitgebreide en gedetailleerde stapsgewijze protocollen over ziektetesten schaars. Dit artikel bevat volledige details over de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van een blotting papier techniek voor het snel screenen genotypen voor weerstand tegen DRR. De blotting papier techniek is eenvoudig en minder duur. Een andere methode, gebaseerd op de zieke pot benadering, is een nabootsing van natuurlijke infectie en kan worden toegepast op de interactie componenten-plant, ziekteverwekker, en omgeving-betrokken bij de ziekte driehoek te bestuderen.

Bovendien komt DRR in de natuur vooral voor in geregen kikkererwtenteeltgebieden, waar bodemvocht afneemt naarmate de gewasgroei vordert. Droogte stress is bekend dat kikkererwten planten predisponeren om drr ziekte. Pathomorfologische en moleculaire kennis van de interactie tussen plant en ziekteverwekker bij droogtestress kan de weg vrijmaken voor de identificatie van elite DRR-resistente rassen uit de kikkererwtenkiempool. Dit artikel biedt een stapsgewijze methodologie voor de bereiding van een zieke pot en de daaropvolgende ziektetest. Over het algemeen zal de hierin gepresenteerde informatie onderzoekers helpen bij het voorbereiden van R. bataticola schimmelinoculum, het handhaven van deze ziekteverwekker, het opzetten van de blotting papiertechniek, het voorbereiden van zieke cultuur en zieke pot, en het beoordelen van ziekteverwekkerinfectie in kikkererwtenplanten.

Inleiding

Droge wortelrot (DRR) is een van de economisch belangrijke ziekten bij kikkererwten^1,2. Het is een wortel-specifieke ziekte veroorzaakt door Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Geïnfecteerde planten missen laterale wortels en bezitten broze taproots en geel gebladerte^1,3. DRR onder droogte stress is gemeld als een opkomende bedreiging voor kikkererwten teelt^1,2,3. Bovendien wordt gemeld dat de drr-incidentie onder droogtestress onder veldomstandigheden^1,2^,3wordt verergerd . DRR komt vaker voor in regengebieden dan in geïrrigeerde velden⁴. Het gebruik van resistente rassen is de manier om de ziekte te overwinnen en fungicide gebruik te omzeilen^1,13. Omdat kikkererwtenkiem kiemplasma beschikbaar over de hele wereld herbergt genetische variatie voor de eigenschap⁵, de screening en identificatie van resistente / vatbare genotypes zijn van cruciaal belang voor moleculaire veredeling voor gewas verbetering.

Robuuste, eenvoudige en kosteneffectieve ziektetesten zijn essentieel om r. bataticola-infectiepatronen in kikkererwten te onderzoeken. De primaire ziektetest die wordt gebruikt om de reactie van kikkererwtengenypes op R. bataticola-infectie waar te nemen, is de blotting papiertechniek^1,4. Het is een eenvoudige techniek en kan worden uitgevoerd met behulp van vloeibare schimmel inoculum, zaailingen met wortels, en steriele blotting papier. Deze techniek is echter niet maximaal gebruikt omdat er geen stap-voor-stap-protocol beschikbaar is in de literatuur.

Ondertussen, de zieke pot techniek omvat de voorbereiding van een potentiële zieke cultuur en het opleggen van droogte stress. Aangezien droogtestress drr-ziekteincidentie³verergert , is het van essentieel belang om de interactie tussen plant en ziekteverwekker onder droogtestress te bestuderen^6,7. De zieke pot techniek biedt het platform voor een dergelijke gelijktijdige studie, het bevorderen van betere mogelijkheden voor kiemplasma screening en het begrijpen van de mechanistische basis van de interactie. Pathomorfologische veranderingen, zoals een toename van de wortellengte en vermindering van het laterale wortelaantal — inherent aan de DRR-ziekte — kunnen worden aangepakt met behulp van de zieke pottechniek^1,3,7.

Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor blotting papier en zieke pottechnieken, die kunnen worden gebruikt om de interactie tussen kikkererwten en R. bataticola en het scherm van kikkererwtenkiemen te bestuderen. De details van de in de studie gebruikte materialen zijn vermeld in de tabel met materialen.

Protocol

1. Isolatie van R. bataticola en opslag

1. Details van de kikkererwtengenype en DRR symptomen
   1. Gebruik kikkererwtenplanten (genotype, JG 62) die over het algemeen typische DRR-symptomen vertonen, zoals droge, broze primaire wortel zonder laterale wortels en microsclerotie onder de schors en in de pith^1,3.
2. Inzameling en wassen
   1. Ontwortel planten met symptomen zoals droog strokleurig blad en broze primaire wortel met microsclerotie onder de opperhuidlaag. Tijdens het ontwortelen, een groot deel van de wortels zal blijven in de bodem als de geïnfecteerde wortels zijn broos. Verwijder het grove grondpuin dat aan de wortel is bevestigd. Snijd de wortels apart en verzamel ze in papieren enveloppen (27,5 cm x 12 cm) met het juiste etiket en leg ze in een monsterophaaldoos.
   2. Na het transport van monsters naar het laboratorium, plaats de wortels in een bekerglas van 200 mL en bedek met gaas (Nylon gaas met de poriegrootte van 3 mm diameter) en was de wortels grondig met stromend leidingwater om aanhangende bodemdeeltjes te verwijderen.
   3. Gebruik omgekeerd osmose (RO) water om eenmaal aan het einde te spoelen.
3. Oppervlaktesterilisatie
   1. Breek de wortels in vier stukken met elk 2 cm lengte met een scalpelmes en doe ze in een schone beker van 200 mL.
   2. Monteer autoclaved RO water, 2% NaOCl, weggooien pot, en autoclaved blotting papier (5 cm²) in de laminaire flow kamer.
   3. Was de wortels met 50 mL autoclaved RO water driemaal en vervolgens met 50 mL van 2% NaOCl gedurende 10 minuten. Was de wortels met 50 mL RO-water drie keer opnieuw om de NaOCl te verwijderen.
   4. Dep droog de wortels door het plaatsen van de wortels op autoclaved blotting papier en laat tot de wortels zijn gedroogd.
4. Media en incubatie
   1. Verwijder de randen van de wortels met een gesteriliseerd scalpelblad. Splits de wortels met behulp van het blad en gebruik de gesteriliseerde tangen om ze op een aardappel dextrose agar (PDA) media Petri plaat met streptomycine sulfaat (50 mg L^-1) en ampicilline (50 mg L^-1).
   2. Sluit de plaat, verzegel met parafilm en broed in een couveuse bij 28 °C gedurende twee dagen in het donker.
5. Hyphal tip methode
   1. Breng de platen na twee dagen incubatie in de laminaire stroomkamer. Snijd het puntje van de hyphal groei⁸ onder een stereomicroscoop (Leica EZ4 educatieve stereomicroscoop) en breng deze over in een verse PDA-plaat met streptomycinesulfaat en ampicilline.
   2. Incubeer de platen in de couveuse tien dagen in het donker bij 28 °C.
6. Opslag en onderhoud van R. bataticola schimmelinoculum
   1. Maak PDA schuine in reageerbuizen en breng een schimmelagar plug van een tien dagen oude cultuurplaat met behulp van de vlam gesteriliseerde inenting lus. Sluit de reageerbuisd af met parafilm.
   2. Broed de schuine kanten tien dagen in het donker op 28 °C.
   3. Sluit de dop opnieuw af met parafilm en bewaar deze op 4 °C in de koelkast voor toekomstig gebruik.
   4. Subcultuur om de zes maanden om de schimmel te behouden.
7. Behoud van virulentie
   1. Infecteer de planten met pure schimmel entculum bereid zoals vermeld in de zieke pot techniek³. Isoleer dezelfde schimmel van de geïnfecteerde planten (Koch's postulaten)⁹ en gebruik voor verdere experimenten.
      OPMERKING: In deze studie werd een veld geïsoleerde stam van de schimmel gebruikt (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Blotting papier techniek

OPMERKING: De blotting papier techniek omvat de voorbereiding van vloeibare schimmel entmateriaal, zaailing voorbereiding, en ziekte beoordeling.

1. Bereiding van vloeibare R. bataticola enoculum
   OPMERKING: Vloeibare R. bataticola schimmelintmateriaal bevat zowel mycelia als microsclerotie. Beide structuren fungeren als primaire entmateriaal.
   1. Bereid 500 mL PDB media in een 1.000 mL kolf en autoclave het op 121 pond voor 15 min.
   2. Nadat de media is afgekoeld, inentuleer de bouillon met een lus vol schimmelagar plug uit een schimmelschuincultuur en incubaal vijf dagen in een shaker bij 180 rpm in het donker.
   3. Monteer een autoclaved glas of plastic trechter (10 cm), een liter conische kolf, en twee lagen gaas (10 cm² grootte) (Nylon gaas met de porie grootte van 3 mm diameter) op de tafel. Filter de schimmelsycecelia en microsclerotia met behulp van het gaas. Dep droog de schimmel in autoclaved blotting papier.
   4. Weeg 100 g mycelia voor 50% entmateriaal en houd op kamertemperatuur.
2. Bereiding van kikkererwtenplant
   1. Selecteer 50 gezonde zaden (in deze studie werd het DRR-vatbare genotype JG 62 gebruikt), plaats ze in een bekerglas van 100 mL en bedek ze met een gaas.
   2. Was de zaden eerst met leidingwater om bodemafval te verwijderen.
   3. Neem het bekerglas met zaden in de laminaire stroomkamer en was ze met gesteriliseerd 50 mL RO water driemaal gedurende 1 min per wasbeurt.
   4. Steriliseer de zaden met 50 mL van 2% waterige NaOCl gedurende 2 minuten met continu schudden en was de zaden met 50 mL gesteriliseerd water vijf keer gedurende 1 min per stuk.
   5. Vul een polytheenzak (47,5 cm x 25 cm) met Soilrite (een mengsel van uitgevouwen perliet van tuinbouwkwaliteit, Iers veenmos en geëxfolieerd vermiculiet in gelijke verhouding d.w.z., 1/3:1/3:1/3), zeug de oppervlakte-gesteriliseerde 50 zaden twee cm diep, en bewaar in een groeikamer/ruimte met 28 °C ± 2 °C temperatuur, 16 uur fotoperiode met een lichtintensiteit van 150 μmol m⁻² s⁻¹, en relatieve vochtigheid van 70%. Geef ze water met RO-water en ontwortel de planten acht dagen na het zaaien.
   6. Was de wortels in leidingwater om de Soilrite deeltjes te verwijderen. Spoel de wortels af met gesteriliseerd RO-water en bewaar ze in het RO-water in een bekerglas van 1000 mL.
3. Bereiding van blotting papier in trays
   1. Neem een blotting papier en snijd ze in stukken (30 cm × 23 cm) in voldoende aantallen om de replicaties te voldoen.
   2. Pak de vellen in autoclavable polytheen zak en autoclave ze op 121 pond gedurende 15 minuten en bewaar het in een hete lucht oven voor het drogen.
   3. Vouw elke blotting papier vel in de helft.
   4. Leg het papier op een schone, met een geest afgeveegde plastic lade, zoals aangegeven in figuur 2i-iv.
4. Planteninenting door onder te dompelen
   1. Los 100 g schimmelenoculum op in 200 mL autoclaved RO water in een bekerglas van 200 mL om 50% entmateriaal te verkrijgen.
   2. Dompel de plantenwortels in het voorbereide entmateriaal gedurende 1 min met intermitterende op- en neerbeweging om een uniforme bevestiging van schimmelenoculum te garanderen.
5. Het plaatsen van de planten in het blotting papier
   1. Maak de onderkant van het blottingpapier op de lade nat met steriel RO-water. Plaats de planten op het papier op een manier waar alleen de wortels zijn bedekt door het papier, en scheuten worden weggelaten.
   2. Sluit het door het vouwen van de bovenkant van het blotting papier en nat het hele papier om voldoende water te bieden aan de groei van planten te ondersteunen.
   3. Geef de lade één keer per dag water en houd de trays op 28 °C. Observeer de symptomen zoals necrose, wortelrot en bladverkleuring dagelijks.

3. Zieke pottechniek

OPMERKING: De zieke pot techniek omvat de voorbereiding van virulente entmateriaal en een zieke pot, onderhoud van vochtgehalte, en de beoordeling van de symptomen van de ziekte.

1. Bereiding van substraat
   1. Neem een kg van alle commercieel verkrijgde kikkererwtenzaden. Verwijder geïnfecteerde zaden (zaden met schimmelgroei, infectievlekken en insectenschade). Plaats ze in 5 L plastic bekerglas en wassen met kraanwater grondig 3-4 keer om grote puin te verwijderen.
   2. Was de zaden driemaal met 2 L RO water en week de 1 kg zaden in een 5 L beker met drie maal meer water voor vijf uur.
   3. Zodra de zaden het water indrongen, opnieuw wassen ze met RO water driemaal om het zaad te verwijderen straalt.
   4. Verwijder het water volledig en verpak de zaden in jamflessen (300 mL, 12 cm hoog, 6 cm diameter en 155 g gewicht) tot ongeveer 1/4^e capaciteit (100 g per jamfles) en sluit de flessen met doppen. Pak tien jamflessen in een autoclalavable plastic zak (48 cm x 30 cm) autoclave tweemaal op 121 pond gedurende 15 min continu.
   5. Droog de zaden bij 40 °C 's nachts in een oven om de waterdruppels in de fles te verwijderen.
2. Voorbereiding van de zieke cultuur
   1. Schakel de BSL-2-niveau laminaire stroomkamer in. Veeg de vloer grondig af met 70% ethanol en zet UV 15 minuten aan. Houd vervolgens de zaden in de laminaire stroomkamer.
   2. Neem de vers geïsoleerde R. bataticola-cultuur van 10 dagen oud (deel 1). Neem vervolgens drie schimmelagarpluggen (4 mm diameter) met behulp van een steriele pipetpunt of kurkboor en stop ze aseptisch in jamflessen. Bedek de flessen met doppen en verzegel met parafilm.
   3. Schud de flessen om de schimmelschijf gelijkmatig te mengen met de kikkererwtenzaden.
   4. Incubeer de flessen 15 dagen in het donker bij 30 °C.
   5. Neem jamflessen met zwarte schimmelgroei(figuur 4iii)en breng de zieke cultuur (zaden met microsclerotia) over van jamflessen naar een glazen petriplaat met steriele tangen. Droog ze twee dagen op kamertemperatuur in een glazen petrischaal.
   6. Poeder de schimmelmassa met een vijzel en stamper en bewaar het poeder op 4 °C.
   7. Autoclave Soilrite twee keer op 121 pond voor 15 min.
   8. Droog de autoclaved Soilrite mix onder een parasol.
   9. Meng het schimmelpoeder met Soilrite op 50% w/w, vul de potten met het mengsel en bewaar ze een dag op kamertemperatuur.
   10. Zaai een oppervlakte-gesteriliseerd DRR-vatbaar kikkererwtenzaad per pot (10 cm ronde potten) (Tabel van materialen)en handhaven van een vochtgehalte van 80% veldcapaciteit (FC).
   11. Observeer de symptomen zoals necrose en wortelrot door de planten te ontwortelen na ontkieming.
3. Beoordeling van de efficiëntie van zieke wiet
   OPMERKING: Planten vertonen gele bladsymptomen wanneer de wortels volledig verrot zijn.
   1. Ontwikkel een ziektescore op basis van de laesie (necrotische vlekken)(aanvullende figuur 2C)nummers en de ernst van wortelrot. Zieke potten met 90% plantensterfte kunnen verder worden gebruikt.
4. Genotype screening
   1. Bereid de zieke cultuur in grote hoeveelheden voor en meng het met gesteriliseerde Soilrite of veldbodem (5% w/w) in 30 cm hoge potten. Geef de potten water om het oppervlak nat te maken en laat ze zeven dagen ongestoord.
   2. Zaai één oppervlakte-gesteriliseerd zaad per 10 cm ronde pot en drie zaden per 30 cm ronde potten en geef ze voldoende water.
   3. Observeer de gele blad- en wortelrotsymptomen.
5. Gecombineerde droogte en R. bataticola infectie
   1. Leg droogtestress op door de in Sinha et al. (2019) genoemde protocollen te volgen.

Resultaten

Deze studie was gericht op het aantonen van technieken zoals blotting papier en zieke pot technieken om pathomorfologische en moleculaire begrip van plant-pathogen interactie onder droogte stress te vergemakkelijken. Om dit te bereiken, planten vertonen DRR symptomen^1,3,4 werden verzameld uit een kikkererwten veld, en de schimmel werd geïsoleerd met behulp van de hyphal tip methode⁸. R. bataticola

Discussie

De blotting papier techniek biedt een eenvoudige aanpak voor het scherm kikkererwten genotypen onder laboratoriumomstandigheden. Dip-inenting maakt het onderzoeken van interactie op tijdelijke basis mogelijk met eenvoudige controle over entmateriaalbelasting(aanvullende figuur 1)en vergemakkelijkt in vitro screening. Bovendien kunnen zelfs jonge zaailingen worden gebruikt. Vijf dagen oude schimmelcultuur (Figuur 1B) kan voldoende inentmateriaal opleveren om de planten te inf...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogeen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Grondmedium in het lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filterpapier	Blotting papier om de plantengroei te ondersteunen	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Planten kweken	Potten van 10 en 30 cm grootte	Routinematig gebruikte kwekerijpotten, bijvoorbeeld, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Aardappel dextrose agar/bouillon	De schimmel cultiveren en onderhouden	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	De schimmel cultiveren	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator en shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Groeikamerbe	Planten kweken onder gecontroleerde omstandigheden	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminaire luchtstroom	Aseptische oefeningen uitvoeren	Telstar, Bio II advance, Klasse II kast, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Gaas	Het schimmelmycelium filteren	Nylon muggengaas	Gaas met poriëndiameter van 0,6-1 mm
Autoclaaf	Media en kikkererwten zaden autoclaveren	Autoclaaf	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopen	De infectie en het schimmelmycelium visualiseren	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopen, Leica EZ4 educatief stereomicroscoop	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weegschaal	Schimmel en chemicaliën wegen	Sartorius elektronische weegschaal, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Schimmelkleuring	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN
Anilienblauw	Schimmelkleuring	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901