Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Samenvatting

Fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de aanwezigheid en ruimtelijke verdeling van specifieke RNA-transcripten in cellen identificeert. Neurochemische fenotypering van functioneel geïdentificeerde neuronen vereist meestal gelijktijdige labeling met meerdere antilichamen (gericht op eiwit) met behulp van immunohistochemie (IHC) en optimalisatie van in situ hybridisatie (gericht op RNA), in tandem. Een "neurochemische handtekening" om bepaalde neuronen te karakteriseren kan worden bereikt, maar complicerende factoren zijn onder meer de noodzaak om FISH- en IHC-doelen te verifiëren voordat de methoden worden gecombineerd, en het beperkte aantal RNA's en eiwitten dat tegelijkertijd binnen dezelfde weefselsectie kan worden aangevallen.

Hier beschrijven we een protocol, met behulp van zowel vers ingevroren als vaste muizenhersenpreparaten, dat meerdere mRNA's en eiwitten in hetzelfde hersengedeelte detecteert met behulp van RNAscope FISH, gevolgd door respectievelijk fluorescentie-immunokleuring. We gebruiken de gecombineerde methode om het expressiepatroon van mRNA's met een lage abundantie (bijv. galaninereceptor 1) en mRNA's met een hoge abundantie (bijv. glycinetransporter 2) te beschrijven in immunohistochemisch geïdentificeerde hersenstamkernen.

De belangrijkste overwegingen voor eiwitetikettering stroomafwaarts van de FISH-test gaan verder dan weefselvoorbereiding en optimalisatie van de etikettering van de FISH-sonde. We ontdekten bijvoorbeeld dat de binding van antilichamen en de specificiteit van de etikettering nadelig kunnen worden beïnvloed door de proteasestap binnen de FISH-sondetest. Proteasen katalyseren hydrolytische splitsing van peptidebindingen, waardoor het binnendringen van de FISH-sonde in cellen wordt vergemakkelijkt, maar ze kunnen ook het eiwit verteren waarop de daaropvolgende IHC-test zich richt, waardoor off-target binding ontstaat. De subcellulaire locatie van het beoogde eiwit is een andere factor die bijdraagt aan het succes van IHC na de FISH-sondetest. We zagen dat IHC-specificiteit behouden bleef wanneer het beoogde eiwit membraangebonden is, terwijl IHC-gericht op cytoplasmatisch eiwit uitgebreide probleemoplossing vereiste. Ten slotte vonden we het hanteren van op objectglaasjes gemonteerd vast bevroren weefsel een grotere uitdaging dan vers ingevroren weefsel, maar de IHC-kwaliteit was over het algemeen beter met vast bevroren weefsel, in combinatie met RNAscope.

Inleiding

Eiwitten en mRNA's die neurochemisch subpopulaties van neuronen definiëren, worden gewoonlijk geïdentificeerd met een combinatie van respectievelijk immunohistochemie (IHC) en/of in situ hybridisatie (ISH). Het combineren van ISH met IHC-technieken vergemakkelijkt de karakterisering van colokalisatiepatronen die uniek zijn voor functionele neuronen (neurochemische codering) door de multiplex-labelcapaciteit te maximaliseren.

Fluorescerende ISH (FISH)-methoden, waaronder RNAscope, hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met eerdere RNA-detectiemethoden zoals radioactief ISH en niet-radioactief chromogeen ISH. FISH maakt visualisatie mogelijk van enkelvoudige mRNA-transcripten als puntvormige gekleurde vlekken¹. Bovendien maakt de RNAscope-assay het mogelijk om een groter aantal RNA-doelen tegelijk te labelen, met behulp van verschillende fluorofoortags. Ondanks deze voordelen kunnen technische beperkingen van invloed zijn op het aantal fluoroforen/chromogenen dat in een enkel experiment kan worden gebruikt. Deze omvatten de beschikbaarheid van microscoopfiltersets; dergelijke overwegingen worden nog verergerd wanneer neurochemische identificatie gebruik maakt van gecombineerde FISH en IHC, in vergelijking met het gebruik van elke techniek afzonderlijk, aangezien inherente stappen die optimaal zijn voor de ene methode schadelijk kunnen zijn voor de andere.

Eerdere toepassing van FISH in combinatie met IHC heeft de expressie van specifieke cellulaire doelwitten aangetoond in menselijke B-cellymfomen², kuikenembryo's³, zebravisembryo's⁴, muizennetvlies⁵ en binnenoorcellen van muizen⁶. In deze onderzoeken was de weefselvoorbereiding ofwel in formaline gefixeerde paraffine ingebed (FFPE)^2,3,5 ofwel verse hele montage ^4,6. Andere studies pasten chromogene RNAscope toe op vaste preparaten van muizen en rattenhersenen ^7,8,9. In het bijzonder Baleriola et al.⁸ beschreef twee verschillende weefselpreparaten voor gecombineerde ISH-IHC; vaste hersensecties van muizen en FFPE-hersensecties van mensen. In een recente publicatie combineerden we FISH en fluorescerende IHC op vers ingevroren secties, om tegelijkertijd mRNA met een lage abundantie (galaninereceptor 1, GalR1), mRNA met een hoge abundantie (glycinetransporter 2, GlyT2) en vesiculaire acetylcholinetransporter (vAChT) proteïne¹⁰ in de reticulaire formatie van de hersenstam te visualiseren.

De kern van het solitaire kanaal (NTS) is een belangrijk hersengebied dat betrokken is bij de autonome functie. Deze heterogene populatie van neuronen bevindt zich in de achterhersenen en ontvangt en integreert een groot aantal autonome signalen, waaronder signalen die de ademhaling reguleren. De NTS herbergt verschillende neuronale populaties, die fenotypisch kunnen worden gekenmerkt door het expressiepatroon van mRNA-doelen, waaronder GalR1 en GlyT2 en eiwitmarkers voor het enzym tyrosinehydroxylase (TH) en de transcriptiefactor Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

De eigenaar van RNAscope beveelt vers ingevroren weefselpreparaten aan, maar weefsel dat is voorbereid door transcardiale perfusiefixatie van hele dieren, samen met cryoprotectie op lange termijn (opslag bij -20 °C) van vaste ingevroren weefselsecties, is gebruikelijk in veel laboratoria. Daarom hebben we geprobeerd protocollen op te stellen voor FISH in combinatie met IHC met behulp van vers ingevroren en gefixeerde ingevroren weefselpreparaten. Hier voorzien we in vers ingevroren en gefixeerde ingevroren hersensecties: (1) een protocol voor gecombineerde FISH en fluorescerende IHC (2) een beschrijving van de kwaliteit van de geproduceerde mRNA- en eiwitetikettering bij gebruik van elk preparaat (3) een beschrijving van de expressie van GalR1 en GlyT2 in de NTS.

Onze studie toonde aan dat, in combinatie met RNAscope-methodologie, het IHC-succes varieerde in vers ingevroren en gefixeerde diepvriespreparaten en afhankelijk was van lokalisatie van de doeleiwitten in de cel. In onze handen was het labelen van membraangebonden eiwitten altijd succesvol. IHC voor cytoplasmatisch eiwit daarentegen vereiste probleemoplossing, zelfs in gevallen waarin het cytoplasmatische eiwit tot overexpressie werd gebracht in een transgeen dier (Phox2b-GFP)¹¹. Ten slotte, terwijl GalR1 tot expressie wordt gebracht in niet-catecholaminerge neuronen in de NTS, is GlyT2-expressie afwezig in de NTS.

Protocol

Een samenvatting van de stappen van de voorbewerking van het weefsel is te vinden in figuur 1. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Ethics Committee van de University of New South Wales in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (Australian National Health and Medical Research Council).

1. Monstervoorbereiding van vers ingevroren hersenweefsel

1. Transcardiale perfusie
   1. Bereid gehepariniseerde (2500 E/L) 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,5. Maak droogijs ethanol slurry door droogijs te mengen met ethanol. Dit heeft een temperatuur van ongeveer −72 °C en wordt gebruikt voor het onmiddellijk invriezen van het geoogste weefsel.
   2. Euthanaseer volwassen C57BL/6 en Phox2b-GFP¹¹ (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.), met behulp van een naaldmeter van 27,5 inch.
      LET OP: Pentobarbital is een barbituraat. Het is acuut giftig in hoge doses en kan de dood veroorzaken door ademstilstand. Raadpleeg voor gebruik de plaatselijke richtlijnen voor gezondheidszorg, juridische en materiële veiligheid.
   3. Leg het hart bloot en kanunnik de linker hartkamer met een optreknaald (23 inch gauge). Voer transcardiale perfusie uit met gehepariniseerde 0,1 M PB totdat het bloed is verdwenen (2-3 minuten) met een stroomsnelheid van 11-13 ml/min. Bepaal de bloedzuivering door de verkleuring van de lever en de uitvloeiing vanuit het rechter atrium^{te controleren 12}.
   4. Isoleer de hersenen van de schedelholte, sluit ze onmiddellijk in Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) in een cryomal of aluminiumfolie in en plaats ze op het droogijs-ethanolbad. Bewaar het ingevroren ingebedde weefsel maximaal 3 maanden in een luchtdichte verpakking bij - 80 °C.
2. Delen van vers ingevroren weefsel
   1. Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C. Laat het in OCT ingebedde weefsel en een cryostaathouder ~30 minuten in de cryostaat om evenwicht met de nieuwe temperatuur mogelijk te maken.
      NOTITIE: Houd het weefsel te allen tijde bevroren; transporteer het weefsel van de vriezer van -80 °C naar de cryostaat op droogijs.
   2. Bevestig het weefsel aan de voorgekoelde cryostaathouder met behulp van een OCT-verbinding. In dit protocol werden weefselblokken op de klauwplaat in het coronale vlak gemonteerd.
      NOTITIE: Snijd overtollige OCT uit het weefsel met een scheermesje om de hoeveelheid OCT die door de cryostaat wordt gesneden en vervolgens op het glasglaasje wordt overgebracht, tot een minimum te beperken.
   3. Snijd coronale secties van 14 μm dik en monteer ze op geladen glasmicroscopieglaasjes.
      1. Verwarm de geleiders tot kamertemperatuur voordat u de secties monteert. Nadat de sectie is gemonteerd, bewaart u de objectglaasjes in een glaasjesdoos in de cryostaat.
      2. Als er meer dan één sectie op één objectglaasje moet worden gemonteerd, verwarm dan het gebied voor het tweede glaasje door een vinger gedurende 5-10 seconden aan de andere kant van het glaasje te plaatsen om de hechting van het gedeelte aan het glaasje te bevorderen. Een koud weefselgedeelte hecht zich niet aan een koud glaasje. De secties moeten plat aan de dia's hechten; Door te vouwen vallen ze tijdens het wassen van de geleiders.
      3. Als er scheuren in de secties worden opgemerkt, verhoog dan de cryostaattemperatuur met 1-5 °C om dit te voorkomen. Het is vooral belangrijk om weefselsecties dicht bij elkaar op hetzelfde objectglaasje te plaatsen. Dit voorkomt verspilling van FISH-sondes en reagentia tijdens de test.
   4. Bewaar weefselcoupes die op objectglaasjes zijn gemonteerd maximaal 6 maanden in een luchtdichte verpakking bij -80 °C.
      NOTITIE: Houd de secties te allen tijde bevroren en vermijd vriesdooicycli om afbraak van RNA te voorkomen. Transporteer de glaasjesdoos van binnenuit de cryostaat naar de vriezer van -80 °C op droogijs.
3. Fixatie van vers ingevroren weefsel
   1. Bereid op de dag dat de FISH-sondetest moet worden uitgevoerd 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-oplossing). Filtreer door filtreerpapier (klasse 1: 11 μm, tabel met materialen) in een Buchner-trechter of kroesfilter te halen.
      LET OP: PFA is schadelijk en giftig bij contact met de huid of inademing. Alle procedures met PFA-oplossing moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Afval van PFA-oplossingen moet zorgvuldig worden verwijderd volgens de institutionele veiligheidsprotocollen.
   2. Koel de 4% PFA-oplossing af tot 4 °C. Transporteer het op de dia gemonteerde weefsel uit de vriezer van -80 °C in droogijs en dompel het onmiddellijk gedurende 15 minuten onder in het voorgekoelde fixeermiddel.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat deze fixatiestap niet langer duurt dan 15 minuten, omdat overfixatie zal resulteren in niet-specifieke achtergrondmarkering.
4. Uitdroging van vers ingevroren weefsel
   1. Dehydrateer weefselsecties door de objectglaasjes onder te dompelen in graduele concentraties ethanol. In een Coplin-pot eerst onderdompelen in 50%, dan 70% en tenslotte absolute ethanol, elk gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Herhaal de laatste absolute ethanolincubatie een tweede keer.
   2. Laat de dia's aan de lucht drogen en schets de groep secties met behulp van een hydrofobe barrièrepen, waarbij u ervoor zorgt dat het binnengebied tot een minimum wordt beperkt.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het glasplaatje volledig droog is voordat u de hydrofobe barrière trekt. De hydrofobe barrière moet de weefselsecties volledig zonder openingen omringen en moet droog zijn voordat deze verder wordt verwerkt.

2. Monstervoorbereiding van gefixeerd ingevroren hersenweefsel

1. Transcardiale perfusie fixatie
   1. Euthanaseer muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.) gevolgd door transcardiale perfusie, eerst met 0,1 M PB en vervolgens met 4% PFA-oplossing. Fixeer met 10 minuten perfusie op 11-13 ml/min.
   2. Isoleer de hersenen van de schedelholte na perfusiefixatie en dompel ze een nacht onder in 4% PFA-oplossing bij 4 °C.
2. Weefseldoorsnede van vast weefsel
   1. Spoel de hersenen met een fijne pincet af met een steriele 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u de meningeale lagen verwijdert, met behulp van een ontleedmicroscoop.
   2. Snijd de hersenen nauwkeurig in blokken (scheid de hersenstam van de voorhersenen voorafgaand aan de vibratomesectie) met behulp van een hersenmatrix (Tabel met materialen). Snijd in het bijzonder de hersenstam caudaal door bij de piramidale decussatie en ontleed het cerebellum. Snijd op dezelfde manier de voorhersenen onmiddellijk rostraal naar het optische chiasma.
   3. Zet het weefsel vast op een vibrerende microtoomboorkop met cyanoacrylaat en veranker het in 2% agar-oplossing.
   4. Snijd 30 μm dikke weefselsecties met behulp van een vibrerende microtoom en bewaar gesneden secties in cryoprotectieve oplossing (30% RNasevrije sucrose, 30% ethyleenglycol, 1% polyvinylpyrrolidon (PVP-40), in 0,1 M PB, pH 7,4). Weefselcoupes kunnen maximaal 6 maanden in cryoprotectant bij -20 °C worden bewaard.
3. Voorbereiding van vaste secties voorafgaand aan FISH
   1. Was op de dag van FISH vrij zwevende secties drie keer, gedurende 10 minuten per wasbeurt, om de cryoprotectieve oplossing te verwijderen. Om te wassen, plaatst u secties in 0,1 M PBS in een celkweekplaat met 12 putjes en schudt u ze op een roterende platformschudder (90 - 100 tpm).
   2. Gebruik na het wassen een penseel om secties op glasmicroscopieglaasjes te monteren en laat ze minimaal 2 uur aan de lucht drogen.
      NOTITIE: De secties moeten plat op de dia's hechten, omdat ze bij uitgesproken plooien tijdens het wassen losraken.
   3. Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen een barrière rond de secties om de FISH-reagentia te beperken tot de secties. Nogmaals, het is belangrijk om het interne gebied van de omtrek die met de barrièrepen is getekend te minimaliseren.
      MOGELIJK BREEKPUNT: De secties kunnen 's nachts bij kamertemperatuur worden bewaard om de volgende dag door te gaan met de test.

3. FISH-test

OPMERKING: De rest van het protocol is van toepassing op zowel vers ingevroren als vast ingevroren weefsel.

1. Bereid de reagentia en instrumenten voor op hybridisatie- en amplificatiestappen.
   1. Stel een tafelincubator en een waterbad in op 40 °C.
   2. Bereid een bevochtigde, tegen licht beschermde kamer voor voor het incuberen van objectglaasjes. Bevochtiging voorkomt uitdroging van tissues - dia's bevinden zich veilig boven een vochtig reservoir. Idealiter is de kamer gemaakt van stevig polystyreen, het is lichtdicht en luchtdicht om een verzadigde waterdampatmosfeer te behouden. Het sluiten van de kamer is afhankelijk van minimale wrijving om beweging te voorkomen. We gebruikten een glaasjesdoos bekleed met natte laboratoriumdoekjes (Table of Materials) aan de onderkant. Plaats de glaasjesbak in de broedstoof om deze voor te verwarmen tot 40 °C.
   3. Verwarm de 50x Wash Buffer (materiaaltabel) en sondes gedurende 10 minuten tot 40 °C met behulp van het waterbad en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
   4. Bereid 1 L van 1x Wash Buffer van de 50x voorraadconcentratie.
   5. Bereid het sondemengsel voor (materiaaltabel): de C1-sonde is klaar voor gebruik bij voorraadconcentratie, terwijl C2- en C3-sondes worden verzonden als een concentratie van 50x en moeten worden verdund met het verdunningsmiddel dat in de set is meegeleverd.
      OPMERKING: Sondemengsels kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
2. Protease behandeling
   1. Incubeer secties met Protease III (Tabel met materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat Protease III en incubatiereagentia in stroomafwaartse processen (sondemengsel, amplificatieoplossingen, blokkeerbuffer en antilichaamsera) de secties volledig bedekken. Een pipetpunt kan worden gebruikt om het reagens op de sectie te verspreiden om het hele gebied binnen de hydrofobe barrière te bedekken.
   2. Was de glaasjes twee keer met 0,1 M PBS, telkens gedurende 2 minuten, in een grote plastic vierkante petrischaal. Hier werd een vierkante bioassayschaal van 245 mm x 245 mm gebruikt (Tabel met materialen). Houd de schaal aan één kant vast en kantel deze 3-5 keer voorzichtig. Veeg na het wassen overtollig 0.1 M PBS van het objectglaasje en voeg onmiddellijk het volgende reagens toe. Laat weefselsecties niet opdrogen.
      NOTITIE: Tijdens elke wasbeurt worden de objectglaasjes ondergedompeld in oplossing bij kamertemperatuur. Dit is de workflow voor alle volgende wasstappen. De vaste secties van 30 μm dik komen gemakkelijker los van de geleiders dan secties met een dikte van 14 μm, wees voorzichtig tijdens het wassen.
3. Hybridisatie en amplificatie
   1. Plaats na het afwassen van de protease-oplossing de objectglaasjes in de bevochtigde, voorverwarmde kamer. Incubeer secties met sondemengsel (Tabel met materialen) gedurende 2 uur bij 40 °C in een benchtop incubator.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat er ten minste 2 secties zijn gereserveerd voor positieve en negatieve controlesondes om de kwaliteit van het monster-RNA en de optimale permeabilisatie te beoordelen. Positieve controlesondes richten zich op genen voor het huishouden; hier waren dit een cocktail van RNA's gericht op ubiquitine C (UBC; hoge overvloed), peptidylpropylisomerase B (PPIB; matige overvloed) en RNA-polymerase 2a (POLR2A; lage overvloed). Negatieve controlesondes richten zich op het bacteriële 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinaatreductase (DapB)-gen, dat normaal afwezig is in hersenmonsters van muizen. Een positief DapB-signaal duidt op een niet-specifiek signaal en/of bacteriële besmetting van het monster.
   2. Na hybridisatie met het sondemengsel bestaan de signaalversterkingsstappen uit incubatie met Amp 1-FL (30 minuten), vervolgens met Amp 2-FL (15 minuten), gevolgd door Amp 3-FL (30 minuten) en tenslotte Amp 4-FL (15 minuten) - elk bij 40 °C. Gebruik de meegeleverde druppelflesjes om weefselsecties af te dekken met een amplificatieoplossing. Ga verder met de IHC-test na de laatste versterkingsstap.
   3. Spoel de objectglaasjes tweemaal af met Wash Buffer gedurende 2 minuten tussen de hybridisatie van de sonde en elke versterkingsstap.

4. IHC-test

1. IHC-blokkeringsstap
   1. Om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen, incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een blokkeringsoplossing met 10% normaal paardenserum, 0,3% Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% merthiolaat) na de FISH-test. Bereid primaire antilichamen in een verdunningsbuffer met 1x TBSm, 5% normaal paardenserum en 0,1% Tween20. Leveranciers van primaire antilichamen worden vermeld in de materiaaltabel.
2. Immunohistochemie
   1. Verwijder overtollige blokkeerbuffer door op het glaasje te tikken en incubeer secties met primaire antilichamen gedurende een nacht bij 4 °C.
   2. Was de glaasjes 3 keer (elk 5 minuten) met 1x TBSm en incubeer met secundair antilichaam in verdunningsmiddel met 1x TBSm, 1% normaal paardenserum en 0,1% Tween20 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Secundaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.
   3. Was de glaasjes 3 keer met 1x TBSm (elk 5 minuten) voordat u ze onder het dekglaasje gooit met montagemedium met of zonder DAPI (Tabel met materialen).

5. Beeldvorming

1. Onderzoek immunokleuring onder een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een camera (zie de materiaaltabel voor details). Verkrijg representatieve afbeeldingen met een vergroting van 20x en sla ze op als TIFF-bestanden.
2. Exporteer representatieve afbeeldingen naar beeldverwerkingssoftware (Tabel met materialen) voor aanpassing van de helderheid/contrast om de helderheid te vergroten en de waarheidsgetrouwe weergave weer te geven.

6. OPTIONEEL: Kwantitatieve analyse van doeltranscripties

OPMERKING: Dit is een artikel over methoden en er worden geen kwantitatieve resultaten verstrekt. De hier gepresenteerde kwantificeringsmethode is afkomstig van Dereli et al.¹⁰. okt.

1. Verkrijg beelden van de interessegebieden zoals uitgelegd in 5.1 en pas dezelfde microscoop- en camera-instellingen (zoals belichtingstijd en lichtintensiteit) toe op alle beelden van dezelfde fluorofoor.
2. Plot de neuronale profielen met behulp van beeldanalysesoftware (Tabel met materialen).
3. Lijn de secties uit met betrekking tot het Bregma-niveau volgens een stereotactische hersenatlas¹³.
4. Pas dezelfde helderheid en hetzelfde contrast toe op alle afbeeldingen van dezelfde fluorofoor. Beschouw alleen de neuronen met DAPI-gekleurde kernen.
5. Tel handmatig het aantal mRNA-, eiwitexpressie-, mRNA/mRNA-, eiwit/eiwit- en mRNA/eiwit-co-expressiecellen binnen het interessegebied.
6. Om vertekening in de experimentele resultaten te verminderen, moet u de persoon die de experimentele resultaten kwantificeert, blind maken voor de experimentele groepen.
7. Pas Abercrombie-correctie¹⁴ toe op het totale aantal cellen met behulp van de volgende Abercombie-vergelijking:
   Gecorrigeerd celgetal = handmatig celgetal x sectiedikte / (sectiedikte + kerngrootte)
   Voor secties met een dikte van 14 μm wordt bijvoorbeeld de gemiddelde kernbreedte berekend op 7,7 ± 0,3 μm en de gemiddelde sectiedikte is 14 ± 1 μm op basis van respectievelijk 30 cellen en 10 secties bij 5 dieren¹⁰. Volgens de Abercrombie-vergelijking zou het gecorrigeerde aantal cellen handmatig zijn aantal cellen x 14/(14+7,7).

Figuur 1: Parallelle workflow van weefselvoorbewerkingsstappen voor zowel vers ingevroren als paraformaldehyde-gefixeerd weefsel. Verwerkingsstappen voor vers ingevroren weefsel worden weergegeven in de rood omlijnde vakken, terwijl die voor paraformaldehyde (PFA) vast weefsel worden weergegeven in de blauw omlijnde vakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Samenvatting van de gecombineerde procedure voor de FISH-sonde en de immunohistochemie. Na de voorbewerking van het weefsel wordt het op het objectglaasje gemonteerde weefsel omcirkeld met behulp van een hydrofobe barrièrepen, zoals te zien is in het eerste frame, en geïncubeerd in een protease-oplossing bij kamertemperatuur. Na wasbeurten wordt het weefsel gedurende 2 uur overgebracht naar een benchtop-incubator voor hybridisatie vóór opeenvolgende versterkingsstappen. Het in situ hybridisatiesysteem maakt gebruik van een gepatenteerd 'Z-sonde'-ontwerp, voorversterkers en versterkers zoals te zien is in frames 3-6⁶. Zodra het weefsel een FISH-sondeverwerking heeft ondergaan, wordt het gewassen voordat het wordt geblokkeerd met normaal paardenserum. De primaire incubatie van antilichamen wordt 's nachts bij 4 °C uitgevoerd om de antilichaam-antigeenbinding te maximaliseren. De secundaire incubatie van antilichamen (2 uur) werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Hier schetsen we een methode voor het combineren van multiplex FISH met fluorescerende IHC om mRNA-expressie voor GalR1 en GlyT2 te lokaliseren met behulp van respectievelijk vers ingevroren en paraformaldehyde-gefixeerde weefsels in de NTS van de muis. Een pijplijn van de weefselbewerking, FISH- en IHC-procedures die in de methoden worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Tabel 1 geeft een samenvatting van de FISH-sonde- en...

Discussie

In de neurowetenschappen worden FISH en IHC routinematig gebruikt om de ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA of eiwitten binnen neuronale subpopulaties te onderzoeken. Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, vergroot de capaciteit voor gelijktijdige detectie van mRNA's en eiwitten in hersensecties. Onze gecombineerde multiplex FISH-IHC-test maakte fenotypische identificatie mogelijk van verschillende neuronale subpopulaties in de NTS in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersenpreparaten....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DIEREN
C57BL/6 muis	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP muis	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTIA
Cyanoacrylaat	Loctite
Ethyleenglycol	Sigma-Aldrich	324558
Heparine-Natrium	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Raadpleeg lokale dierenarts of apotheek.
Lethabarb (Natrium Pentabarbitol) Euthanasie Injectie	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	Raadpleeg een dierenarts voor lokale farmaceutische voorschriften betreffende Natrium Pentabarbitol
Moleculair kwaliteit agarose poeder	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehyde, prilled, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polyvinylpyrrolidon, gemiddelde mol wt 40.000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	Met of zonder DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (tot 3-plex capaciteit)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Bevat 50x Wash buffer en Protease III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, voor moleculaire biologie	Sigma-Aldrich	P9416
APPARATUUR
Benchtop incubator	Thermoline scientific micro incubator	Model: TEI-13G
Brain Matrix, Muis, 30g Volwassen, Coronaal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Aanzuignaald (23 inch gauge)	BD	0288U07
Hydrofobe Barrière Pen	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Peristaltiekpomp	Coleparmer Masterflex	L/S Series
Retiga 2000R Digital Camera	QImaging	RET-2000R-F-CLR	kleurcamera
SuperFrost Plus Glas Slides (Wit)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome)	Leica	VT1200S
Whatman kwalitatief filterpapier, Grade 1, 110 mm diameter	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Version 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ voor de volgende generatie wetenschappelijke beeldgegevens", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   en Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: een open-source platform voor biologische-beeldanalyse", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMAIRE ANTILICHAMEN
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antilichaam	Millipore Sigma	AB1542	Schapen polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antilichaam, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Muis monoklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antilichaam	Sigma-Aldrich	ABN100	Geiten polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2630394
GFP Antilichaam	Novus Biologicals	NB600-308	Konijn polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_10003058
Phox2b Antilichaam (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Muis monoklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2813765
SECONDAIRE ANTILICHAMEN
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Konijn IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Donkey anti-Konijn (1:400 verdunning), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Schapen IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey anti-Schapen (1:400 verdunning), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Geit IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	Donkey anti-Geit (1:400 verdunning), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Muis IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey anti-Muis (1:400 verdunning), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure