Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Summary

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Abstract

Op lichtplaat gebaseerde fluorescentiemicroscopie biedt efficiënte oplossingen om complexe processen op meerdere biologisch relevante schalen te bestuderen. Op de monsterkamer gebaseerde opstellingen, die specifiek zijn ontworpen om de driedimensionale integriteit van het monster te behouden en meestal voorzien zijn van monsterrotatie, zijn de beste keuze in ontwikkelingsbiologie. Ze zijn bijvoorbeeld gebruikt om de volledige embryonale morfogenese van de fruitvlieg Drosophila melanogaster en de rode meelkever Tribolium castaneum te documenteren. Veel beschikbare live beeldvormingsprotocollen bieden echter alleen experimentele kaders voor enkele embryo's. Vooral voor vergelijkende studies zijn dergelijke benaderingen lastig, omdat opeenvolgend afgebeelde exemplaren worden beïnvloed door omgevingsafwijkingen. Verder beperkt dit het aantal exemplaren dat binnen een bepaalde tijd kan worden afgeteld. We bieden een experimenteel raamwerk voor gelijktijdige live beeldvorming dat de doorvoer in op de monsterkamer gebaseerde opstellingen verhoogt en zo zorgt voor vergelijkbare omgevingsomstandigheden voor alle monsters. Ten eerste bieden we een kalibratierichtlijn voor lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Ten tweede stellen wij een montagemethode voor meerdere embryo's voor die compatibel is met monsterrotatie. Ten derde bieden we voorbeeldige driedimensionale live imaging datasets van Drosophila, waarvoor we drie transgene lijnen naast elkaar plaatsen met fluorescerend gelabelde kernen, evenals van Tribolium, waarvoor we de prestaties vergelijken van drie transgene sublijnen die hetzelfde transgeen dragen, maar op verschillende genomische locaties. Ons protocol is speciaal ontworpen voor vergelijkende studies omdat het proactief omgevingsafwijkingen aanpakt, die altijd aanwezig zijn in sequentiële live beeldvorming. Dit is vooral belangrijk voor kwantitatieve analyses en karakterisering van aberrationele fenotypes, die bijvoorbeeld het gevolg zijn van knock-out experimenten. Verder verhoogt het de algehele doorvoer, wat zeer handig is wanneer de toegang tot fluorescentiemicroscopen van lichtplaten beperkt is. Ten slotte kan de voorgestelde montagemethode worden aangepast voor andere insectensoorten en andere modelorganismen, bijvoorbeeld zebravissen, zonder optimalisatie-inspanning.

Introduction

Fluorescentiemicroscopie is een van de meest essentiële beeldvormingstechnieken in de biowetenschappen, vooral in de cel- en ontwikkelingsbiologie. In confocale fluorescentiemicroscopen¹, die sinds het midden van de jaren negentig state-of-the-art zijn voor driedimensionale fluorescentiebeeldvorming, wordt dezelfde lens gebruikt voor fluorofoor excitatie en emissielichtdetectie. De verlichtingslaserstraal prikkelt alle fluoroforen langs de verlichtings-/detectieas en het betreffende storingssignaal wordt vóór detectie door een pinhole gediscrimineerd. Daarom wordt voor elk tweedimensionaal beeld het hele exemplaar verlicht. Bijgevolg wordt voor....

Protocol

1. Voorbereidende werkzaamheden

1. Kies een verlichtingslens/detectielens/cameracombinatie voor de LSFM die past bij de wetenschappelijke vraag en stel de microscoop in. De grootte van het gezichtsveld is het quotiënt van de grootte van de camerachip en de vergroting van de detectielens. De verlichtingslens moet zo worden gekozen dat het gehele gezichtsveld wordt bedekt door een ruwweg vlak lichtblad³⁴. Tabel 1bevat drie aanbevolen combinaties .
2. Om agarose aliquots en retrieval gerechten te bereiden, voeg 2 g laagsmeltende agarose toe aan 200 ml autoclaafd leidingwater en verwarm het mengsel in een magnetron op....

Results

Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor vergelijkende fluorescentie live beeldvorming in op de monsterkamer gebaseerde LSFMs. Het raamwerk kan bijvoorbeeld worden gebruikt om (i) embryo's van twee of meer soorten naast elkaar te zetten, (ii) embryo's van lijnen waarin een of meer genen worden uitgeschakeld plus wild-type controles, (iii) meerdere embryo's van dezelfde transgene lijn, (iv) embryo's uit verschillende transgene lijnen, of (v) embryo's van sublijnen die dezelfde transgene dragen , maar op versch.......

Discussion

Een van de exclusieve toepassingsgebieden van LSFMs is ontwikkelingsbiologie. In deze discipline is het van belang om naar levende exemplaren te kijken, anders kunnen morfogenetische processen niet op een dynamische manier worden beschreven. Een experimenteel kader voor de gelijktijdige live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFM's, zoals hier beschreven, is om twee belangrijke redenen handig.

Omgevingsafwijkingen, die onvermijdelijk zijn bij sequentiële live beeldvorming, kunne.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100 µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila