Methodenartikel

Geassisteerde selectie van biomarkers door lineaire discriminante analyse-effectgrootte (LEfSe) in microbioomgegevens

DOI:

10.3791/61715

⸱

16 mei 2022

 ,  , 
1Marine Resources Research Centre, Tianjin Research Institute for Water Transport Engineering, M.O.T., 2Key Laboratory of Regional Energy Systems Optimization, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, North China Electric Power University, 3School of Environmental Science and Engineering, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Retraction Notice

The article <em>Geassisteerde selectie van biomarkers door lineaire discriminante analyse-effectgrootte (LEfSe) in microbioomgegevens</em> (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LEfSe (LDA Effect Size) is een hulpmiddel voor hoogdimensionale biomarkermijnbouw om genomische kenmerken (zoals genen, paden en taxonomieën) te identificeren die twee of meer groepen in microbioomgegevens aanzienlijk karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is steeds meer aandacht voor gesloten biologische genomen in het milieu en in de gezondheid. Om de intergroepsverschillen tussen verschillende monsters of omgevingen te onderzoeken en te onthullen, is het cruciaal om biomarkers met statistische verschillen tussen groepen te ontdekken. De toepassing van Lineaire discriminante analyse Effect Size (LEfSe) kan helpen bij het vinden van goede biomarkers. Op basis van de originele genoomgegevens worden kwaliteitscontrole en kwantificering van verschillende sequenties op basis van taxa of genen uitgevoerd. Ten eerste werd de Kruskal-Wallis-rangtest gebruikt om onderscheid te maken tussen specifieke verschillen tussen statistische en biologische groepen. Vervolgens werd de Wilcoxon-rangtest uitgevoerd tussen de twee groepen die in de vorige stap waren verkregen om te beoordelen of de verschillen consistent waren. Ten slotte werd een lineaire discriminante analyse (LDA) uitgevoerd om de invloed van biomarkers op significant verschillende groepen te evalueren op basis van LDA-scores. Kortom, LEfSe bood het gemak voor het identificeren van genomische biomarkers die statistische verschillen tussen biologische groepen karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomarkers zijn biologische kenmerken die kunnen worden gemeten en kunnen wijzen op bepaalde verschijnselen zoals infectie, ziekte of omgeving. Onder hen kunnen functionele biomarkers specifieke biologische functies van afzonderlijke soorten zijn of gemeenschappelijk voor sommige soorten, zoals gen, eiwit, metaboliet en routes. Bovendien duiden taxonomische biomarkers op een ongewone soort, een groep organismen (koninkrijk, phylum, klasse, orde, familie, geslacht, soort), de Amplicon Sequence Varient (ASV)1 of de Operational Taxonomic Unit (OTU)2. Om biomarkers sneller en nauwkeuriger te vinden, is een tool voor het analyseren van de biologische gegevens noodzakelijk. De verschillen tussen klassen kunnen worden verklaard door LEfSe in combinatie met standaardtests voor statistische significantie en aanvullende tests die coderen voor biologische consistentie en effectrelevantie3. LEfSe is beschikbaar als galaxy-module, een conda-formule, een docker-image en opgenomen in bioBakery (VM en cloud)4. Over het algemeen maakt de analyse van microbiële diversiteit vaak gebruik van een niet-parametrische test voor de onzekere verdeling van een steekproefgemeenschap. De rangsomtest is een niet-parametrische testmethode, waarbij de rang van monsters wordt gebruikt om de waarde van monsters te vervangen. Afhankelijk van het verschil in monstergroepen kan het worden verdeeld in twee monsters met de Wilcoxon rank sum test en in meerdere samples met de Kruskal-Wallis test 5,6. Met name wanneer er significante verschillen zijn tussen meerdere groepen monsters, moet een rangsomtest van paarsgewijze vergelijking van meerdere monsters worden uitgevoerd. LDA (wat staat voor Linear Discriminant Analysis) uitgevonden door Ronald Fisher in 1936, is een vorm van supervised learning, ook bekend als Fisher's Linear Discriminant7. Het is een klassiek en populair algoritme in het huidige veld van machine learning datamining.

Hier is de LEfSe-test geoptimaliseerd door Conda- en Galaxy-servers. Drie groepen van 16S rRNA-gensequenties worden geanalyseerd om de significante verschillen tussen verschillende groepen aan te tonen met LDA-scores van microbiële gemeenschappen en visualisatieresultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het protocol is afkomstig van en aangepast uit het onderzoek van Segata et al.3. De methode wordt op https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse gegeven.

1. Voorbereiding van het invoerbestand voor analyse

  1. Bereid het invoerbestand (tabel 1) van LEfSe voor, dat eenvoudig kan worden gegenereerd door veel workflows8 of eerdere protocollen9 met de originele bestanden (voorbeeldbestand en bijbehorend soortannotatiebestand).

2. LEfSe native analyse (beperkt tot de Linux server)

  1. LEfSe Installatie
    OPMERKING: De LEfSe-pijplijn wordt aanbevolen om te worden geïnstalleerd met Conda10.
    1. Voer de volgende opdrachten uit om de mogelijkheid van afhankelijkhedenconflicten uit te sluiten. Maak een conda-omgeving voor LEfSe (deze stap wordt aanbevolen, maar is niet vereist.). -n staat voor de milieunaam.
      $ conda create -n LEfSe-env
    2. Voer het volgende uit om de gemaakte LEfSe-omgeving te activeren:
      $ source activeren LEfSe-env
    3. Voer het volgende uit om LEfSe te installeren met kanaalbioBakery waarbij -c staat voor kanaalnaam:
      $ conda install -c biobakery lefse |
  2. Gegevens opmaken voor LEfSe
    1. Voer de volgende opdracht uit om het oorspronkelijke bestand te formatteren naar de interne indeling voor LEfSe. Tabel.txt is het invoerbestand en Table-reformat.in is het uitvoerbestand. -c wordt gebruikt om de functie in te stellen, die wordt gebruikt als klasse (standaard 1) en -o wordt gebruikt om de normalisatiewaarde in te stellen (standaard -1.0 betekent geen normalisatie).
      $ format_input.py Tafel.txt Table-reformat.in -c 1 -o 1000000
  3. Berekening van de lineaire discriminantanalyse (LDA) effectgrootte
    1. Voer de volgende opdracht uit. Het doel van deze stap is om LDA van het vorige resultaat uit te voeren en het resultaatbestand voor de visualisatie te genereren. Table-reformat.in wordt gegenereerd met behulp van de vorige stap en wordt gebruikt als het invoerbestand in deze stap. Table-reformat.res is het resultaatbestand.
      $ run_lefse.py Table-reformat.in Table-reformat.res
  4. Visualisatie door plots
    1. Plot de LEfSe-resultaten. Om de effectgrootte van de biomarkers in een pdf-bestand te plotten. Table-reformat.res wordt gegenereerd met behulp van de vorige stap en de LDA.pdf is het plotbestand. -formaat wordt gebruikt om het uitvoerbestandsformaat in te stellen.
      $ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --formaat pdf
    2. Plot het cladogram. Om de soortboom te tekenen en de biomarkers in een cladogram weer te geven. cladogram.pdf is het uitvoerbestand.
      $ plot_cladogram.py Table-reformat.res cladogram.pdf --formaat pdf
    3. Plot één functie (optioneel) Om de verschillen van een enkele biomarker tussen verschillende groepen in kaart te brengen. -f wordt gebruikt om de kenmerken van het plot in te stellen. Als er een is ingesteld, moet de -feature_name worden gegeven.
      $ plot_features.py -f one --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --formaat pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf
    4. Plot de differentiële functies (optioneel) om alle functies te tekenen, maar er is te veel om voorzichtig te doen. --archief wordt gebruikt om te kiezen of de resultaten moeten worden gecomprimeerd. ./ betekent het pad van de resultaten.
      $ plot_features.py -f diff --archief none --formaat pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./

3. LEfSe online analyse (galaxy)

  1. Ga naar de huttenhower galaxy server11: http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
  2. Upload de bestanden. Druk op de pijl-omhoog in het linkerdeelvenster en upload het bestand. Klik op Kies lokaal bestand om het invoerbestand te selecteren en selecteer het formaat in tabelvorm en klik vervolgens op de knop Start .
    OPMERKING: Als u naar de webpagina (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse) verwijst, gebruikt u het script (taxonomy_summary. R) om het invoerbestand van LEfSe te genereren, en het formaat (elke kolom met een groepsnaam, elke regel met een ander niveau van annotatie gescheiden door "|") is vereist zoals weergegeven in tabel 1. Een schematisch overzicht van het uploadproces is weergegeven in figuur 1.
  3. Maak de gegevens op voor LEfSe. Klik op de LEfSe | De koppeling Gegevens opmaken voor LEfSe in het linkerdeelvenster en selecteer de specifieke rijen voor klasse in het bestand en klik op de knop Uitvoeren . Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 2.
  4. Bereken de grootte van het LDA-effect. Klik op de LEfSe | LDA-effectgroottekoppeling (LEfSe) in het linkerdeelvenster en selecteer parameterwaarden op basis van de analysevereisten. Klik op Uitvoeren. Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 3.
  5. Plot de LEfSe-resultaten. Klik op de LEfSe | Plot de link LEfSe-resultaten in het linkerdeelvenster en klik op de knop Uitvoeren . Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 4.
  6. Plot het cladogram. Klik op Cladogram plotten in het linkerdeelvenster en klik op de knop Uitvoeren nadat u de parameterwaarden hebt geselecteerd. Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 5.
  7. Plot één functie door te klikken op Eén functie plotten in het linkerdeelvenster en op de knop Uitvoeren te klikken nadat u parameterwaarden hebt geselecteerd. Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 6.
  8. Plot differentiële functies door te klikken op Differentiële kenmerken plotten in het linkerdeelvenster en de knop Uitvoeren vast te klikken nadat u parameterwaarden hebt geselecteerd. Een schematisch overzicht van het operationele proces en de gebruikte parameters zijn weergegeven in figuur 7.
    OPMERKING: Deze gegenereerde cijfers kunnen worden gevisualiseerd en gedownload tegen de resulterende uitvoer in het rechterdeelvenster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De LDA-scores van microbiële gemeenschappen met significante verschillen in elke groep door de 16S rRNA-gensequenties van drie monsters te analyseren, zijn weergegeven in figuur 8. De kleur van het histogram vertegenwoordigt verschillende groepen, terwijl de lengte de LDA-score vertegenwoordigt, wat de invloed is van de soort met significante verschillen tussen verschillende groepen. Het histogram toont de soort met significante verschillen waarvan de LDA-score groter is dan de vooraf ingest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt het protocol voor de identificatie en karakterisering van biomarkers binnen verschillende groepen beschreven. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor andere monstertypen, zoals OTA's van micro-organismen. De statistische methode van LEfSe kan de karakteristieke micro-organismen in elke groep vinden (standaard is LDA >2), dat wil zeggen, de micro-organismen die overvloediger voorkomen in deze groep in vergelijking met de anderen12. LEfSe is beschikbaar in zowel native als web Li...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van Fundamental Research Funds voor de Central Public Welfare Research Institutes (TKS170205) en De Foundation for Development of Science and Technology, en Tianjin Research Institute for Water Transport Engineering (TIWTE), M.O.T. (KJFZJJ170201).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Geen materialen gebruikt

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bolyen, E., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37 (8), 852-857 (2019).
  2. Knight, R., et al. Best practices for analysing microbiomes. Nature Reviews. Microbiology. 16 (7), 410-422 (2018).
  3. Segata, N., et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biology. 12 (6), 60(2011).
  4. McIver, M., Sayoldin, B., Shafquat, A. Biobakery / lefse [tool]. , Available from: https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse (2019).
  5. Kruskal, W. H. A nonparametric test for the several sample problem. The Annals of Mathematical Statistics. 23 (4), 525-540 (1952).
  6. Wilcoxon, F. Individual comparisons by ranking methods. Biometrics Bulletin. 1 (6), 80-83 (1945).
  7. Fisher, R. A. The use of multiple measurements in taxonomic problems. Annals of Eugenics. 7 (1), 179-188 (1936).
  8. Liu, Y. X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein and Cell. 41 (7), 1-16 (2020).
  9. Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e59980(2019).
  10. Grüning, B., et al. Bioconda: sustainable and comprehensive software distribution for the life sciences. Nature Methods. 15 (7), 475-476 (2018).
  11. Blankenberg, D., Chilton, J., Coraor, N. Galaxy external display applications: closing a dataflow interoperability loop. Nature Methods. 17 (2), 123-124 (2020).
  12. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  13. Shilei, Z., et al. Reservoir water stratification and mixing affects microbial community structure and functional community composition in a stratified drinking reservoir. Journal of Environmental Management. 267, 110456(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Linear Discriminant AnalysisBiomarker SelectionMicrobiome DataKruskal Wallis TestWilcoxon Rank TestLDA Effect SizeLEfSe AnalysisGalaxy ServerPrincipal Component AnalysisGenomic Biomarkers